Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

El objetivo general de este protocolo es diferenciar las células madre pluripotentes humanas en células trofoblásticas humanas utilizando morfogénicos óseos 4 e inhibidores de las vías de señalización activa y ganglionar para estudiar los eventos tempranos de la formación y función de la placenta humana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las funciones de las células trofoblásticas y cómo se forman estas células. La principal ventaja de esta técnica es que puede producir abundantes células trofoblásticas para una amplia variedad de aplicaciones, incluida la genética, y permite realizar ensayos de función celular.

Para comenzar el experimento, descongele una alícuota de matriz extracelular en hielo durante tres o cuatro horas. Usando puntas heladas, un tubo cónico frío de 50 mililitros y el medio igual modificado de Dulbecco, o medio DMEM F12, transfiere dos miligramos de matriz extracelular a 24 mililitros de DMEM F12 helado. Transfiera inmediatamente el tubo cónico de 50 mililitros a hielo y guárdelo a cuatro grados centígrados.

Para recubrir las placas de cultivo de tejidos, agregue un mililitro de matriz extracelular diluida por pocillo de una placa de seis pocillos. Gire la placa para cubrir los pocillos e incube la placa a temperatura ambiente durante al menos una hora. Aspire la matriz extracelular de la nueva placa y agregue medio condicionado con fibroblastos embrionarios de ratón o MEFCM que contenga bFGF.

Utilice una pipeta para transferir las pinzas celulares raspadas de la placa MEF y alícuotas a la placa recubierta de matriz extracelular. A continuación, incuba la placa. Raspe las células diferenciadas con una pipeta Pasteur antes de reemplazar el MEFCM con medio bFGF diariamente usando dos mililitros de medio para un pocillo.

Cuando las colonias parecen grandes y brillantes bajo el microscopio, expulse las hESC cada seis o siete días. Cuando las celdas sin alimentador estén listas para pasar, retire el medio y lave las celdas agregando un mililitro de PBS con una pipeta. Aspire el PBS y reemplácelo con 0,5 miligramos por mililitro de dispasa precalentado con una pipeta.

Incuba las células a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, lavar las células con PBS añadiendo dos mililitros de PBS por pocillo y aspirar el PBS. Agregue un mililitro de CM por pocillo y raspe manualmente las células en pequeños grumos con la punta de una pipeta de cinco mililitros.

A continuación, coloque las células suspendidas en nuevos bloques recubiertos de matriz extracelular. Preparar el medio de diferenciación. Use CM sin bFGF y agregue inhibidores nuevos antes de usar.

Utilice hESC sin alimentador que crezcan en placas recubiertas de matriz extracelular para un solo paso cultivadas dentro de una incubadora configurada al 5% de oxígeno. Después del primer paso a las placas recubiertas de matriz extracelular, deje que las células se adhieran durante 24 horas. Al día siguiente, inicie la diferenciación eliminando el CM que contiene bFGF y reemplazándolo con CM que contiene BMP4/A/P con dos mililitros por pocillo en una placa de seis pocillos.

Continúe cultivando las células utilizando niveles de oxígeno al 4%. Reemplace el CM que contiene BMP4/A/P cada dos días aspirando el medio viejo y agregando un nuevo medio que contenga BMP4/A/P. Recoja las celdas en los puntos de tiempo deseados.

Cultivo de hESCs para dos pasajes en la matriz extracelular después de transferirlas desde las MEFs con medio hESC que contiene bFGF. La alta confluencia celular es importante, así que divida las hESC una a una en una nueva placa que asegurará al menos un 50% de confluencia al día siguiente. Incubar las células durante la noche en la incubadora de bajo oxígeno.

Al día siguiente, reemplace el medio con dos mililitros por pocillo de medio de diferenciación. Coloque las células en una incubadora con poco oxígeno durante la noche. Antes de la transfección, la gelatina cubre un plato agregando 0,1% de gelatina a un plato.

Gire el plato para cubrir el plato, luego deje el plato a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, retira la gelatina. Diferencie las celdas hasta el punto de tiempo deseado.

El día antes de la transfección, tripsinice las células con tripsina al 0,05% durante cinco minutos. Coloque las células en la confluencia deseada en la placa recubierta de gelatina. Agregue CM que contenga BMP4/A/P que carezca de bFGF e incube el cultivo durante la noche.

Al día siguiente, agregue medio de diferenciación fresco a las células. Transfecte siRNAs utilizando un reactivo de transfección de siRNA. Para el ADN plasmático, utilice un reactivo de lipofectamina adecuado.

Siga el protocolo del producto tal y como se describe para cada reactivo de transfección. Transfiera los complejos de lipofectamina de siRNA a cada pocillo o placa de células y mezcle suavemente. A continuación, cultive las células durante la noche en una incubadora con poco oxígeno.

Al día siguiente, reemplace los medios con nuevos medios de diferenciación. Recoja las células en los puntos de tiempo deseados para comprobar la eficiencia de la disrupción génica mediante RT-PCR cuantitativa. Finalmente, para recolectar células, agregue un mililitro de tripsina al 0,05% por pocillo e incube las células.

Agregue cinco mililitros de medio MEF por pocillo para neutralizar la tripsina. Gire las células a 200 veces g durante cinco minutos y use el pellet de la celda para el aislamiento de ARN. Con esta técnica, los cambios morfológicos se ven claramente.

Las células del primer día de diferenciación son más grandes que las células del día cero. A medida que avanza la diferenciación, las células se dividen y se expanden desde el centro de la colonia, creciendo en dirección hacia afuera. Las colonias individuales se fusionan por diferenciación en el quinto día con células que crecen una encima de la otra.

El análisis QRT-PCR revela que los niveles relativos de expresión del marcador C pluripotente NANOG se reducen en un 75% después de un día de diferenciación cuando las células se cultivan con BMP4 y se reducen en un 90% en presencia de BMP4/A/P. En el segundo día de diferenciación, los niveles de NANOG son muy bajos para las células cultivadas en BMP4 solo o en BMP4/A/P en comparación con las del medio hESC CM que contiene beta FGF. Las transfecciones realizadas utilizando un plásmido GFP e introducidas en células tratadas con BMP4/A/P en el primer y tercer día de diferenciación obtuvieron una eficiencia de transfección del 30 al 50% a las 24 horas después de la transfección.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar células pluripotentes humanas en células trofoblásticas in vitro y cómo introducir construcciones de ADN para manipular la expresión génica.