Name: Desarrollo de Metarhizium anisopliae Como Mycoinsecticide: Del aislamiento al funcionamiento del campo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Aprende a desarrollar un micoinsecticida con Metarhizium anisopliae para el control biológico de plagas agrícolas. Este método incluye aislamiento, identificación y selección de cepas fúngicas indígenas más efectivas.

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Los autores reconocen la contribución de los colaboradores del programa de Colaboración Indo-Suiza en Biotecnología (ISCB) del Departamento de Biotecnología de Nueva Delhi y de la Agencia Suiza para el Desarrollo y la Cooperación, Berna, Suiza. Se reconoce la contribución de los estudiantes del proyecto y del personal involucrado en el desarrollo del micoinsecticida, incluyendo a Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane y Abhijeet Lande. EKP y SGT agradecen a la University Grants Commission, India y al Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR), India, respectivamente, por becas de investigación. MVD reconoce el apoyo del Consejo de Investigación Industrial y Científica, Nueva Delhi para el Emeritus Scientist Scheme. Los autores agradecen al Departamento de Biotecnología, Nueva Delhi, India, por el apoyo financiero de los programas ISCB y SBIRI. Estamos agradecidos aRevisores por sus aportaciones.

1. Aislamiento de hongos entomopatogénicos <ol><li> Método de dilución del suelo <ol><li> Recoger las muestras de suelo y los insectos micosos de diferentes cultivos ( Tabla 1 ). Aislar los hongos entomopatógenos de las muestras de suelo utilizando el método de placas de dilución del suelo 8 . Nota: En este estudio se recogieron muestras de Pune (18 ° 31&#39;13&#39;&#39;N, 73 ° 51&#39;24&#39;&#39;E) y Buldhana (19 ° 58&#39;36&#39;&#39;N 76 ° 30&#39;30&#39;&#39;E ) Distritos, Maharashtra, India. </li><li> Pesar 10 g de cada muestra de suelo y agregarlos por separado a 90 ml de Tween-80 estéril 0,1% (p / v). </li><li> Mezclar bien las muestras usando un agitador magnético durante 60 minutos para liberar las esporas adheridas a las partículas del suelo. </li><li> Después de mezclar, diseminar alícuotas de 100 a 200 μL de cada muestra sobre medio selectivo que contiene (g / L): peptona, 10; Glucosa, 20; Agar, 18; Estreptomicina, 0,6; Tetraciclina, 0,05; CycLohexamida, 0,05; Y dodina, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Incubar las placas a 28 ° C durante 3-7 días. </li><li> Seleccionar y subcultivar las colonias individuales de esporulación en el mismo medio para obtener cultivos puros. </li></ol></li><li> De los insectos micosos <ol><li> Recoger los insectos mycosed del campo. Nota: Es probable que un cuerpo larval duro esté infectado con hongo entomopatógeno. Con infección bacteriana o viral, el cuerpo de insecto muerto es suave. </li><li> Recoger insectos vivos con comportamiento anormal, coordinación pobre, y movimientos espasmódicos. </li><li> Mantener los insectos hasta la muerte y luego transferirlos a cámaras húmedas para detectar micosis y esporulación, si las hay, a 28 ° C y 70-80% de HR. </li><li> Raspar las esporas de los cadáveres esporulados en el medio selectivo mencionado anteriormente y obtener cultivos puros por subcultivo adicional 2-3 veces en el mismo medio. </li></ol></li><li> Método del cebo <ol><li> En un(3,85 x 6,0 cm) que contenga 60 g de muestra de suelo, agregue 4 larvas de polilla de arroz ( Corcyra cephalonica ) y guarde los viales a 25 ± 2 ° C durante un período de 14 días. </li><li> Coloque los viales al revés todos los días. Después de 14 días, revise las muestras de suelo para determinar la presencia de larvas de polilla de arroz micóticas. Aislar el hongo entomopatogénico por rayas de esporas de cadáveres esporulados en medio selectivo. </li><li> Después de obtener cultivos puros, transferir los aislamientos a agar de dextrosa de patata (PDA) e incubar a 28 ° C y 70-80% HR durante 7 días para permitir la esporulación. Después de la esporulación, mantener los cultivos madre a 8 ° C hasta su uso. </li></ol></li></ol> 2. Identificación de los hongos entomopatógenos <ol><li> Identificar hongos entomopatógenos mediante la observación de características morfológicas ( es decir, tamaño y forma de esporas asexuales y la disposición de las esporas en conidióforos); Aislados de 3 géneros principales, Metarhizium , Beauv<html> Eria y Nomuraea . </li><li> Para la identificación molecular de cepas de Metarhizium , extraer el ADN genómico de la biomasa micelial utilizando un kit de aislamiento de ADN; Siga las instrucciones del fabricante (vea la Tabla de Materiales ). Compruebe la calidad del ADN genómico realizando la electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. <ol><li> PCR-amplificar el ITS1-5.8S-ITS2 y 26S rDNA región. Utilizar ADN genómico como una plantilla, con ITS1 adelante (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) y ITS4 inversa (TCCTCCGCTTATTGATATGC) cebadores [ 10] . </li><li> Gel-eluir y purificar los amplicones de tamaño esperado usando un kit de extracción de gel; Siga las instrucciones del fabricante (vea la Tabla de Materiales ). Cuantificar el amplicón y la secuencia purificados. </li><li> Leer y editar las secuencias utilizando el software y realizar una búsqueda BLAST de las secuencias de nucleótidos en el NCBI GenBank biblioteca de datos para analizar la estrecha homología= &quot;Xref&quot;&gt; 11. </li><li> Depositar las secuencias de aislados entamopatógenos identificados a la base de datos NCBI GenBank para recuperar los números de acceso. </li></ol></li></ol> 3. Detección de aislados de Metarhizium contra H. armigera <ol><li> Crianza de insectos <ol><li> Establecer la cultura inicial de H. armigera recolectando larvas saludables y pupas del insecto del campo. </li><li> Para la cría, cultivar las larvas individualmente en viales de polipropileno estériles (3,85 x 6,0 cm, capacidad de 50 ml) que contienen trozos de okra desinfectados con hipoclorito de sodio al 0,5% (v / v) durante 10 min 12 . </li><li> Recoger los huevos de los insectos depositados durante la cría y esterilizarlos en la superficie con hipoclorito de sodio al 0,5% (v / v). </li><li> Mantener las larvas a 25 ± 2 ° C y 65 ± 5% de HR. </li></ol></li><li> Bioensayo de insectos Nota: Para el bioensayo de insectos, la producción de esporas,Y los estudios de rendimiento de campo, se utilizaron las primeras subculturas de cepas de Metarhizium de larvas de H. armigera de micosis, a menos que se indique lo contrario. <ol><li> Para los bioensayos de insectos, use larvas de III-instar de H. armigera . </li><li> Sumerja un conjunto de 30 larvas por triplicado individualmente en una suspensión de esporas de 10 ml de aislados de Metarhizium (1 x 10 7 esporas / ml, a menos que se indique lo contrario, viabilidad&gt; 90%) durante 5 s. </li><li> Después del tratamiento, transfiera cada larva individualmente a un vial estéril separado para evitar el canibalismo. A cada vial, agregue el papel de filtro Whatmann húmedo No. 1 y un trozo de okra desinfectado como pienso. Cambie el papel y el alimento en días alternos. </li><li> Mantenga las larvas a 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% de HR y 16: 8 de luz: oscuras durante 14 días o hasta que mueran. </li><li> Transferir las larvas muertas a placas de Petri estériles que contengan hisopos de algodón húmedo y mantenerlos a 28 ° C y 70-80% de HR durante 3-7 días para permitir que los micelios y las esporasFormación sobre los cadáveres. </li><li> Para un control, se trata un conjunto de 30 larvas por triplicado con Tween-80 al 0,1% (p / v) en agua destilada estéril. </li><li> Realizar todo el experimento por triplicado utilizando suspensiones de esporas recién preparadas. Recopilar y reunir los datos sobre el porcentaje de mortalidad de tres experimentos para obtener valores promedio. Calcular el porcentaje de mortalidad corregida utilizando la fórmula 13 de Abbott. </li><li> Realizar los experimentos utilizando un diseño de bloques completos al azar (RCBD), con cada tratamiento que contiene un conjunto de 30 larvas por triplicado. Sobre la base del porcentaje de mortalidad frente a H. armigera , seleccione los aislados de Metarhizium para el cribado adicional del mejor aislado para la producción comercial. </li><li> Seleccione los aislamientos que demuestren una mortalidad&gt; 90% frente a las larvas de H. armigera III-instar. Nota: Aquí se seleccionaron 12 aislamientos. </li><li> Determinar el LT 50 de estos aislados y seleccionar los aislamientos demonstCalificando el asesinato más rápido (en menos tiempo). Nota: Aquí se seleccionaron 5 aislamientos de los 12 aislamientos más potentes. </li><li> Determinar los valores de LC 50 del seleccionado aislados utilizando cuatro concentraciones diferentes (es decir, 1 × 10 3, 1 × 10 5, 1 × 10 7, y 1 × 10 9 esporas / ml) de suspensión de esporas. </li><li> Determinar la CL 50 de los aislamientos de Metarhizium frente a las larvas de H. armigera de fase III para aumentar la posibilidad de identificar la diferencia en la virulencia de los aislados con altos valores de mortalidad que pudieran pasar desapercibidos si se utilizaba solo una dosis. </li></ol></li></ol> 4. Producción de esporas de un aislante de Metarhizium para estudios de rendimiento en el campo <ol><li> Producción de esporas de Metarhizium por SSF <ol><li> Para SSF, preparar el inóculo añadiendo 2 x 10 7 esporas de los aislados de Metarhizium a200 ml de medio de YPG (0,3% de extracto de levadura, 0,5% de peptona y 1,0% de glucosa). Incubar los frascos a 28 ° C con agitación (180 rpm) durante 48 h. </li><li> Para la producción en masa de esporas por SSF, use el arroz como sustrato a menos que se indique lo contrario. </li><li> Para el SSF, llenar las bolsas de autoclave (tipo / 14 con un solo filtro microvendido de 0,5 μm, 2 kg de capacidad, 64 × 36 cm) con 2 kg de arroz. Agregue 1000 mL de agua destilada al arroz en las bolsas y remoje durante la noche 14 . Autoclave las bolsas con el arroz empapado a 121 ° C durante 45 min 15 . </li><li> Inocular las bolsas con inoculo micelial de 48 h (inóculo al 10%, 200 ml para 2 kg de arroz) e incubar a 28 ° C y 70-80% HR durante 14 días. </li><li> Cosecha de las esporas por extracción líquida con Tween-80 al 0,1%. Para ello, añadir el contenido de la bolsa a Tween-80 al 0,1% (3 L por cada 1 kg de arroz), mezclar bien, separar las esporas del líquido por centrifugación y secar a 37 ° C durante 2 días &lt;<html> Li <li> Alternativamente, se secan las bolsas que contienen arroz con las esporas y algunos micelios a 37 ° C durante 2 días para reducir el contenido de humedad (&lt;20%). Cosecha de las esporas con un myco-harvester o vibro-sifter. </li></ol></li><li> Estudios de viabilidad <ol><li> Determinar el porcentaje de viabilidad de las esporas cosechadas utilizando diferentes métodos 15 . Para ello, preparar las suspensiones de esporas en Tween-80 al 0,1% (p / v) y ajustar el recuento a 1 × 10 3 esporas / ml. </li><li> Se separan las suspensiones de esporas (0,1 ml) en placas de PDA por triplicado e incuban a 28ºC y 70-80% de HR durante 72 h. </li><li> Contar manualmente las colonias aisladas y determinar el recuento total viable para la muestra respectiva. </li></ol></li><li> Tasa de sedimentación de esporas <ol><li> Para una dosis uniforme, se requiere la suspensión homogénea de esporas; Determinar las tasas de sedimentación de esporas de los aislados de Metarhizium, tal como se describe&quot;Xref&quot;&gt; 16. Compruebe las velocidades de sedimentación de las esporas en sulfato amónico 0,2 M y Tween-80 al 0,1%. </li><li> Ajustar el recuento de la suspensión de esporas a ~ 7 × 10 7 esporas / mL para obtener una absorbancia inicial de 0,6 a 540 nm. Deje que las cubetas permanezcan inalteradas durante 6 h para que las esporas se asienten. </li><li> Registre la absorbancia hasta 6 h. Expresar la tasa de sedimentación en porcentaje y calcular el tiempo requerido para la sedimentación al 50% (ST 50 ). Repita el experimento tres veces utilizando suspensiones de esporas recién preparadas. </li></ol></li></ol> 5. Estudios de Rendimiento de Campo de la Capacidad del Aislado de M. anisopliae Seleccionado para Controlar H. armigera en Pichones <ol><li> Formulación en polvo húmedo de M. anisopliae M 34412 esporas <ol><li> Preparar la formulación en polvo humectable al 2,5-5% mezclando las esporas con talco. </li><li> Ajuste el conteo final viable (TVC) a 1 x 10 12 spoRes por kg de formulación. </li></ol></li><li> Estudios de rendimiento de M. anisopliae M 34412 esporas <ol><li> Para estudios de rendimiento de campo de la capacidad del aislamiento de M. anisopliae seleccionado para controlar la infestación de H. armigera en garbanzos, utilice un RCBD con cuatro repeticiones. Nota: Aquí, realizada en Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li><li> Utilizar dos formulaciones de pulverización diferentes, una formulación en aceite de esporas (5 x 10 12 esporas / 3 L de diesel: aceite de girasol, 7: 3) y una formulación acuosa en Tween-80 (0,1%). Pulverizar la formulación de aceite con un pulverizador de volumen ultra bajo (ULV) (70 min, 3 L / ha), la formulación acuosa con un pulverizador de mochila (5 x 10 12 esporas, 500 L / ha). Nota: Aquí, las poblaciones de larvas se registraron un día antes de la pulverización y 3 y 7 días después de la aplicación de cada pulverización a 5 plantas seleccionadas al azar. La población total fueRansformado a la raíz cuadrada de n + 1 para el análisis estadístico. <ol><li> De acuerdo con las prácticas agrícolas para la cosecha de guandul, realizar la primera pulverización entre 10 y 15 días después de la puesta de huevos y 2 veces más con un intervalo de 14 días. Realizar la pulverización entre las 16:00 y las 18:00 h IST. Controle la dirección del viento y, si es necesario, use cortinas de tela para evitar la deriva de esporas a parcelas vecinas. </li></ol></li><li> Para la comparación, rocíe los insecticidas químicos con un pulverizador de la mochila de la compresión de la mano. </li><li> Determine la persistencia del inóculo en el campo recolectando larvas de H. armigera 0, 3, 5, 7 y 14 días después de la pulverización. </li><li> Mantener estas larvas bajo observación durante un período de 14 días y después de la muerte, transferirlas a un vial de plástico que contenga papel de filtro húmedo. Incubar a 25 ± 2 ° C y 70 ± 10% de HR para observar la micosis. </li><li> Determinar la persistencia del inóculo en la población de larvas basada en la p<html> Datos de mortalidad de las larvas recogidas del campo después de la pulverización. </li><li> Evaluar los estudios de campo sobre la base del porcentaje de eficacia 17 , el porcentaje de daño en la vaina y el porcentaje de rendimiento 18 . Nota: Aquí se registraron los datos de los parámetros, tales como temperatura, humedad, velocidad del viento (km / h), sol (h), lluvia (mm), días lluviosos, y evaporación (mm) durante un ensayo a una temperatura (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li></ol></li><li> Programa de participación de los agricultores <ol><li> Seleccione el número de agricultores para los ensayos de demostración. Suministro de las semillas de garbanzo (BSMR - 736), junto con fertilizantes para los agricultores. Nota: En este estudio participaron 20 agricultores. Población: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). </li><li> Utilice las mismas formulaciones de pulverización y el número de pulverizaciones como en el paso 5.2. </li></ol></li></ol>Tle &quot;&gt; 6. Efecto sobre los organismos no objetivo <ol><li> Observe el efecto del spray de mycoinsecticide, si lo hay, en las hojas de garbanzo. </li><li> Recoger los artrópodos de la tierra y los insectos que habitan en las hojas 1 día después de cada tratamiento en las parcelas no tratadas y en las parcelas tratadas con M. anisopliae . </li><li> Recoja los artrópodos que viven en el suelo con trampas de cautiverio dentro de las 24 h después del tratamiento y recoja los insectos que habitan en las hojas con una red de barrido la mañana siguiente al tratamiento ( es decir, aproximadamente 15-18 h después del tratamiento). </li><li> Conservarlos individualmente en cajas cilíndricas de plástico con diámetros de 3,5 cm y alturas de 4,0 cm. Compruebe los insectos diariamente para la infección y alimentarlos con la comida apropiada. </li><li> Anotar la presencia de M. anisopliae , si es que lo hay, y aislar el hongo. </li></ol> 7. Identificación de parámetros de control de calidad <ol><li> Compruebe la viabilidad de las esporas midiendo la germinación de esporas en PDA a 28 °;DO. </li><li> Medir las actividades enzimáticas degradantes de la cutícula, como la quitinasa, la quitin-desacetilasa, la quitosanasa, la proteasa y la lipasa, producidas en los medios YPG y quitina, como se describió anteriormente 15 . </li><li> Determine el porcentaje de mortalidad de H. armigera en un bioensayo de laboratorio 15 . </li><li> Utilizar marcadores moleculares, como un patrón de PCR-RFLP de Chitinases ( Chit 1 , 2 , y 4 ) y genes de proteasa ( Pr1A ), como atributos de virulencia para M. anisopliae . <ol><li> Extraer el ADN genómico de la biomasa de micelios utilizando un kit de aislamiento de ADN 15 . PCR-amplificar los fragmentos de genes Chit1 y Chit2 utilizando ADN genómico como plantilla, con pares de cebadores Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) y Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Para Chit4 , utilice el par de cebadores Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG). </li><li> Para la amplificación del gen Pr1A, utilice el par de cebadores METPR2 y METPR5 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG). </li><li> Realizar la digestión de restricción 19 del gen Chit1 con BsaJI, BstUI, y ScrFI; del gen Chit2 con AluI, HpyCH4IV, y HpyCH4V, y del gen Chit4 con BstUI, HaeIII, y MboI. Para la digestión del gen Pr1A , utilizar RsaI , DdeI y MspI 20 . </li><li> Observar el patrón de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) en gel de agarosa al 1,5% por electroforesis para cada gen de la mayoría de las cepas virulentas (&gt; 90% de mortalidad); Esto puede usarse como un marcador de virulencia para la selección de M. anisopliae . </li></ol></li></ol>

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<li>McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCoy%2C+CW+%22Handbook+of+natural+pesticides%2C+Microbial+insecticides%2C+Part+A.+Entomogenous+protozoa+and+fungi%22">Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi</a>. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).</li>
<li>Nahar, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150801935650">Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae).</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).</li>
<li>Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).</li>
<li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycopesticide+Production+by+Fermentation%3A+Potential+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges.</a> Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Durante la década de 1880, se hizo el primer intento de utilizar Metarhizium para controlar el escarabajo del escarabajo, Anisoplia austriaca, y el curculio de la remolacha azucarera, Cleonis punctiventris 21 . En este protocolo, uno de los prerrequisitos fue aislar una cepa virulenta, ya sea del suelo o de insectos infectados. De hecho, otros parámetros, como LC 50 , LT 50 y ST 50 , contribuyeron significativamente a la rentabilid...

<html> Desde la introducción de los plaguicidas organoclorados en la década de 1940 en la India, el uso de plaguicidas ha aumentado muchas veces 1 , con plagas de cultivos que todavía cuestan billones de rupias 2 anualmente en términos de pérdida de rendimiento en la producción agrícola. El uso generalizado y no juicioso de plaguicidas sintéticos es una amenaza continua para el medio ambiente y la salud humana 1 . El uso indiscriminado de plaguicidas produce residuos en el suelo y el agotamiento de los depredadores naturales de plagas. También sirve como una potente presión de selección para alterar la composición genética de una población de plagas, lo que lleva al desarrollo de resistencia 1 . A pesar de los enormes beneficios de la revolución verde, que requiere insumos altos, como fertilizantes y pesticidas, las plagas siguen siendo una importante restricción biótica. Una estimación general de las pérdidas anuales de cultivos registradas en la India y en todo el mundo es de USD 12.000 millonesEf &quot;&gt; 2 y 2.000 millones de dólares 3 , respectivamente. Cuando los plaguicidas químicos tienen efectos perjudiciales cuando se usan para controlar plagas de insectos, se hace imprescindible buscar métodos alternativos que sean ecológicamente sanos, confiables, económicos y sostenibles. El control biológico ofrece una alternativa adecuada e incluye el uso de parásitos, depredadores y patógenos microbianos 4 . Los hongos, por ejemplo, son conocidos por infectar una amplia gama de plagas de insectos, incluyendo lepidópteros, himenópteros, coleópteros y dipteranos, resultando a menudo en epizootias naturales. Además, a diferencia de otros agentes de control de insectos bacterianos y virales, el modo de acción de hongos patógenos de insectos es por contacto 5 . Estos hongos comprenden un grupo heterogéneo de más de 100 géneros, con aproximadamente 750 especies reportadas entre diferentes insectos. Los patógenos fungosos más importantes son: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii y Hirsutella sp., Por nombrar algunos 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin es el segundo hongo entomopatógeno más utilizado en biocontrol. Se sabe que ataca a más de 200 especies de insectos [ 7] . En este estudio, se presentan diferentes etapas involucradas en el desarrollo basado en el conocimiento de un mycopesticide usando M. anisopliae . 2) identificación y selección de entomopatógenos, 3) estrategias para mantener su naturaleza virulenta y su efectividad en el bioensayo de laboratorio y en el campo, 4) identificación de una fuente ( es decir, insectos micosos o de suelo) para entomopatógenos virulentos; ) La formulación rentable de propágulos infecciosos, 5) el desarrollo de parámetros únicos de control de calidad para la preparación virulenta, y 6) la bioprospección y la adición de valor.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Hi-Media</td><td>RM666</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Sulfato de amonio&nbsp;</td><td>Thomas Baker</td><td>11645</td><td>Analizador de ADN reactivo</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biosistema aplicado</td><td>ABI prisma 3730&nbsp; &nbsp;</td><td>instrumento</td></tr><tr><td>kit de aislamiento de ADN</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Dodine</td><td>Sigma</td><td>45466</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Glucosa Hi-Media</td><td></td><td>GRM077</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Knapsac sparyer</td><td>Kaypee</td><td>HY-16L (1004)</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Hi-Media</td><td>RM006-500G</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Viales de polipropileno&nbsp;</td><td>Laxbro</td><td>SV-50</td><td>Plasticware</td></tr><tr><td>Patata dextrosa agar (PDA)&nbsp;</td><td>Hi-Media</td><td>M096-500G</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>SRL</td><td>28940</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Sparyer de volumen ultra bajo</td><td>Matabi</td><td>INSECDISK</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Unicorn-bags&nbsp;</td><td>Unicornio</td><td>UP-140024-SMB Bolsa de</td><td>autoclave para</td>extracto de levadura SSF</tr><tr><td>Hi-Media</td><td>RM027-500G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo</td> <td>Chromas 2.1</td><td></td><td></td> software</tr></tbody></table>

desarrollo de<em&gt; metarhizium anisopliae</em&gt; como mycoinsecticide: del aislamiento al funcionamiento del campo

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Una preocupación importante cuando se desarrollan los micoinsecticidas comerciales es la velocidad de matanza comparada con la de los insecticidas químicos. Por lo tanto, el aislamiento y el cribado para la selección de un hongo entomopatógeno altamente virulento de acción rápida son pasos importantes. Los hongos entomopatógenos, como Metarhizium, Beauveria y Nomurea , que actúan por contacto, son más adecuados que el Bacillus thuringiensis o el virus de la nucleopoliedrosis (NPV), que debe ser ingerido por la plaga de insectos. En el presente trabajo, se aislaron 68 cepas de Metarhizium de insectos infectados utilizando un método de dilución y cebo. Los aislados fueron identificados por la amplificación y secuenciación de la ITS1-5.8S-ITS2 y 26S rDNA región. La cepa más virulenta de Metarhizium anisopliae se seleccionó en base a la concentración letal media (LC 50 ) y el tiempo (LT 50 ) obtenido en bioensayos de insectos contra larvas de larvas de III-instar de Helicoverpa armigera.La producción en masa de esporas por la cepa seleccionada se llevó a cabo con fermentación en estado sólido (SSF) utilizando arroz como sustrato durante 14 días. Se extrajeron esporas de la biomasa esporulada utilizando tween-80 al 0,1%, y se prepararon diferentes formulaciones de las esporas. Los ensayos de campo de las formulaciones para el control de una infestación por H. armigera en garbanzos se realizaron mediante diseño de bloques al azar. Los niveles de control de infestación obtenidos con formulaciones oleosas y acuosas (78,0% y 70,9%, respectivamente) fueron mejores que el 63,4% obtenido con pesticida químico.

Durante las investigaciones, se aislaron diferentes cepas de Metarhizium, Beauveria y Nomuraea mediante diversos métodos de aislamiento (datos no mostrados) 6 , 14. Como se demostró que las cepas de Metarhizium eran más efectivas en el control de H. armigera , una plaga espantosa en los pulsos 6 , 14 , Otros aislamientos fueron dirigidos a aislar cepas de Metarhizi...

Aquí se presentan las diferentes etapas del desarrollo basado en el conocimiento de un micoinsecticida eficaz, incluyendo el aislamiento, la identificación, el cribado y la selección del hongo entomopatógeno &quot;mejor ajustado&quot;, Metarhizium anisopliae , para el control de plagas de insectos en la agricultura .

Desarrollo de<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Como Mycoinsecticide: Del aislamiento al funcionamiento del campo

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

El uso inadecuado de pesticidas sintéticos representa una amenaza constante para el medio ambiente y la salud humana. El control biológico mediante bacterias, virus y hongos es una alternativa adecuada para controlar diversas plagas de insectos en la agricultura. A diferencia de las bacterias y los virus, los hongos patógenos de insectos son eficaces por contacto.Metarhizium spp. es uno de los hongos patógenos de insectos más eficaces. Se sabe que ataca a más de 200 especies de insectos plaga. Hemos desarrollado un micoinsecticida utilizando esporas de aislamientos indígenas de Metarhizium.Este video mostrará los protocolos para el aislamiento y la identificación de aislados fúngicos locales, el bioensayo con insectos para seleccionar y cribar cepas más potentes, la producción de esporas de cepas seleccionadas de Metarhizium y el protocolo para crear una formulación rentable del micoinsecticida para aplicaciones en campo. También se destacarán las medidas de control de calidad que deben tomarse durante la producción comercial. El aislamiento de los hongos entomopatógenos puede realizarse mediante tres métodos.Primero, a partir de suelos. Metarhizium es un hongo que ocurre naturalmente en la mayoría de los suelos. Para obtener una amplia variedad de aislados, se recolectan suelos de campos con diferentes tipos de cultivos y de regiones ampliamente separadas.La muestra de suelo se toma a una profundidad de cuatro a seis pulgadas bajo la superficie. Las muestras del campo se recogen en bolsas etiquetadas y, posteriormente en el laboratorio, se transfieren 10 gramos de cada muestra a viales. Metarhizium se aísla mediante el método de placa de dilución del suelo.Se transfieren 10 gramos de la muestra de suelo a 90 ml de Tween 80 estéril al 0,1%. La suspensión se agita con un agitador magnético durante 60 minutos. Mientras tanto, se preparan alícuotas de 900 microlitros de Tween 80 para dilución sucesiva.El sobrenadante de la suspensión se diluye ahora en series en alícuotas de Tween 80. Se extienden cien microlitros de cada muestra sobre el medio descrito por Keller y otros. Las placas se incuban a 28 grados durante tres a siete días.Las colonias esporuladas individuales se subcultivan posteriormente en el mismo medio para obtener cultivos puros. Para aislar el hongo patógeno de insectos, se recolectan insectos muertos de los campos. Los esporas de los cadáveres micóticos se separan transfiriéndolos a Tween 80 y luego mediante vortexado.La suspensión de esporas se siembra luego en una placa de agar. Se obtienen cultivos puros mediante subcultivos adicionales en el mismo medio. Para atraer hongos entomopatógenos del suelo, se utilizan larvas de arroz malteado.Se añaden cuatro larvas de gorgojo del arroz a un vial que contiene una muestra de suelo de 60 gramos. Los viales se incuban a 28 grados. Estas larvas normalmente se desplazan profundamente en el suelo, por lo que los viales se invierten diariamente durante hasta 14 días para facilitar el contacto entre las larvas y las esporas fúngicas en el suelo.Las larvas muertas se retiran de vez en cuando y se conservan para la esporulación en un incubador húmedo. El proceso para el aislamiento del hongo es el mismo que el utilizado para los cadáveres de insectos. Después de obtener cultivos puros, los aislados se mantienen en tubos con agar PDA inclinado, y los cultivos madre se conservan a ocho grados centígrados hasta su uso.Para la identificación de los hongos, se extrae ADN genómico de la biomasa micelial. Para la identificación de aislamientos de Metarhizium, los cebadores utilizados son cinco prime, tres prime, ITS1 e ITS4. Los amplicones de tamaño esperado se eluyen mediante gel, se cuantifican y se secuencian.Las secuencias fueron verificadas posteriormente con la base de datos NCBI GenBank para la identificación a nivel de especie de los aislamientos. Muestras de suelo e insectos muertos recolectados en los distritos de Pune y Buldana, Maharashtra, India, proporcionaron 68 aislamientos distintos de Metarhizium. De estos, 58 fueron aislados de suelos y 10 de insectos.55 eran Metarhizium anisopliae, ocho eran Metarhizium flavoviride y cinco, Metarhizium robertsii. Los esporas de los cultivos en pendiente se añaden a 10 ml de Tween 80 y se mezclan en vórtex. Para el bioensayo con insectos, la concentración de esporas se mide utilizando un hemocitómetro.Y el conteo se ajusta a 10 elevado a siete esporas por ml. Un conjunto de 30 larvas, en réplicas triples, se sumerge individualmente en una suspensión de esporas de 10 ml de cada aislado de Metarhizium durante cinco segundos. Para los bioensayos con insectos se utilizan larvas de segundo instar tardío o tercer instar temprano de Helicoverpa armigera.Después del tratamiento, cada larva se transfiere a un vial estéril que contiene papel filtro Whatman número uno humedecido y un trozo de okra desinfectado como alimento. Un grupo de 30 larvas por triplicado tratadas con Tween 80 al 0,1 % en agua destilada estéril sirve como control. Las larvas se mantienen hasta su muerte y se monitorean durante un período de hasta 14 días.Estos pasos se repitieron para todos los 68 aislamientos. El porcentaje de mortalidad se calcula contando las larvas muertas y vivas. Las larvas muertas se transfieren a placas de Petri estériles, que contienen principalmente hisopos de algodón, y se mantienen a 28 grados centígrados y una humedad relativa del 70 al 80 % durante tres a siete días para observar micosis y esporulación.Los datos sobre el porcentaje de mortalidad de tres experimentos se agrupan para obtener valores promedio, los cuales luego se corrigen utilizando la fórmula de Abbott. Se seleccionaron 12 aislamientos de Metarhizium que mostraron más del 90 % de mortalidad para determinar el tiempo letal mediano frente a larvas de tercer estadio de Helicoverpa armigera. Basándose en los valores de LT50, se identificaron cinco aislamientos que actúan más rápidamente en la eliminación de insectos.Las concentraciones letales medianas para los cinco aislamientos identificados se determinaron utilizando cuatro concentraciones diferentes de suspensión de esporas. Basándose en los valores de CL50, se seleccionaron tres aislamientos de Metarhizium para la producción de esporas mediante fermentación en estado sólido. El medio YPD se prepara y se esteriliza por autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos.Los esporas de las pendientes se transfieren al Tween 80 al 0,1%. Las suspensiones de esporas de los tres aislamientos seleccionados de Metarhizium se añaden al medio YPD. Luego, los matraces se incuban en agitador.Las bolsas autoclavables de Unicorn llenas con dos kilogramos de arroz se remojan durante la noche en un litro de agua destilada y luego se autoclavan a 121 grados centígrados durante 45 minutos. La fermentación en estado sólido se probó en sustratos como arroz, sorgo, maíz y trigo. Entre los sustratos evaluados, el arroz favoreció la esporulación máxima de los aislamientos de Metarhizium.Las bolsas se inoculan con un 10% de biomasa micelial de 48 horas de antigüedad. Esto se mezcla bien y se incuba durante 14 días. Los esporas se pueden recolectar utilizando diferentes métodos.Para el aislamiento utilizando Mycoharvester y Vibrosifter, las bolsas que contienen micelio esporulado se secan a 37 grados centígrados durante dos días para reducir el contenido de humedad a menos del 20 %. La extracción líquida es un método más eficiente. El arroz con esporas se coloca en recipientes grandes. Se vierte 0,1 % Tween 80 en los recipientes y la mezcla se agita bien.El sobrenadante se filtra para eliminar cualquier partícula de arroz. Las esporas se concentran y separan mediante centrifugación. Luego, las esporas se secan a 37 grados Celsius durante dos días.Estas esporas pueden almacenarse a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Para aumentar la vida útil durante el almacenamiento, se añade talco y se mezcla con las esporas. Para que sean efectivas, las esporas deben ser viables, por lo que es necesario identificar el aislado que produzca el número máximo de esporas viables.Las suspensiones de esporas se preparan en Tween 80 al 0,1 % y el recuento se ajusta a 10 elevado a siete esporas por ml. Se distribuyen 10 microlitros de la suspensión de esporas sobre láminas de PDA por triplicado y luego se incuban. En un plazo de 12 horas, las esporas viables comienzan a germinar.Después de 12 horas, se cuentan microscópicamente las esporas que forman tubos germinativos. La hidrofilicidad de las esporas es importante para que el hongo se adhiera al cutículo de los insectos. Se toma una suspensión de esporas en sulfato de amonio y Tween 80 en una cureta.El otro, sin las esporas, se utiliza como control. El recuento de la suspensión de esporas se ajusta a aproximadamente siete a diez elevado a siete esporas por ml para obtener una absorbancia inicial de 0,6 a 540 nanómetros. Se deja que las cubetas reposen sin perturbaciones durante unas seis horas para permitir la sedimentación de las esporas.Se registra la absorbancia y se calcula el tiempo necesario para el 50 % de alimentación. En función de los resultados, se seleccionó una cepa para aplicaciones en campo. Las otras dos sirvieron como cepas de respaldo.Se llevó a cabo el desempeño en campo de esporas del aislado seleccionado de Metarhizium M34412 para controlar la infestación de Helicoverpa armigera en cultivo de garbanzo, utilizando un diseño de bloques al azar con cuatro repeticiones. Existen dos formulaciones diferentes de aspersión. La formulación en Tween 80 al 0,1 % se aplica con un pulverizador de mochila.Una formulación oleosa de esporas se rocía con un pulverizador de volumen ultra bajo. La pulverización se realiza ya sea por la mañana o por la tarde. La primera pulverización se lleva a cabo durante la fase de floración y se repite otras dos veces con un intervalo de 14 días.Se recolectaron Helicoverpa armigera a los cero, tres, cinco, siete y 14 días posteriores a la pulverización y se mantuvieron en una cámara de humedad para la micosis. Durante los ensayos de campo para el control de Helicoverpa armigera en el gandul, se obtuvo una eficacia superior al 70 % con Metarhizium anisopliae M34412. Se observó que el daño en las vainas en las parcelas tratadas con Metarhizium anisopliae fue el menor en comparación con las parcelas tratadas con pesticidas químicos y las parcelas control sin tratar.Se examinaron las hojas de chícharo caupí en busca de efectos derivados de la formulación de mycoinsecticida con aceite de girasol diésel. Se recolectaron artrópodos del suelo e insectos que habitan en las hojas de las parcelas tratadas con Metarhizium anisopliae. No se observó ningún efecto perjudicial sobre los artrópodos no objetivo.Los ensayos demostrativos se realizaron en una aldea, doo-lally-pra-va-da, con la participación de 20 agricultores. La formulación es eficaz contra otras plagas de insectos como la oruga grasienta, el perforador moteado de las vainas, el cochinilla harinosa, los áfidos lanudos y los mosquitos. Los experimentos han permitido identificar los parámetros esenciales de control de calidad en la producción de micoinsecticidas.La viabilidad de las esporas, medida como germinación de esporas, debe ser superior al 90 % en PDA después de 16 horas a 28 grados centígrados y una humedad relativa del 70 al 80 %. La mortalidad de Helicoverpa armigera debe ser superior al 90 % con 10 elevado a siete esporas en un bioensayo de laboratorio. Al subcultivarse repetidamente en un medio artificial de laboratorio, el organismo pierde su virulencia.Después de cultivar el hongo en medio con quitina durante 72 horas, se miden las actividades de enzimas degradadoras de la cutícula, como quitinasa, quitina desacetilasa, quitinasana, proteasa y lipasa. Estas sirven como marcadores bioquímicos de virulencia. Se utilizaron cuatro conjuntos diferentes de tres enzimas de restricción para la digestión de los genes de quitinasa.Los aislamientos con más del 90 % de mortalidad mostraron el patrón específico para los tres genes. Estos patrones muestran una correlación significativa con los perfiles de enzimas degradadoras de la cutícula producidos extracelularmente por los aislamientos de Metarhizium. Por primera vez, sugerimos que la actividad de la enzima quitinasa y el patrón de PCR del gen de quitinasa pueden utilizarse como marcadores de virulencia.Esto puede servir como indicadores de calidad para la producción a escala comercial. Para hacer que el producto sea más rentable, podemos utilizar el biomasa del micelio para la promoción del crecimiento radicular. También puede emplearse en el aislamiento de quitosanasa para aplicaciones en el sector sanitario.Estos productos con valor añadido harán que este micoinsecticida basado en Metarhizium sea más rentable.

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Este protocolo se muestran dos métodos de inoculación para introducir el hongo...

Establecimiento de hongos entomopatógenos como endófitos: Hacia Control Biológico Endofítico

Aquí presentamos un protocolo basado en el sistema de cebo del gusano de la harina (Tenebrio molitor) que se utilizó para aislar y seleccionar hongos entomopatógenos (EPF) a partir de muestras de suelo. Se utiliza una fórmula efectiva de número de conidios (ECN) para seleccionar EPF altamente tolerante al estrés en función de las características fisiológicas para el control microbiano de plagas en el campo.

Aislamiento y selección de hongos entomopatógenos a partir de muestras de suelo y evaluación de la virulencia fúngica contra plagas de insectos

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Lago eutrofización es un problema de la calidad del agua en todo el mundo, por lo que la necesidad de identificar y controlar las fuentes de nutrientes críticos. Determinación de laboratorio de las tasas de liberación de fósforo de los núcleos de sedimentos es un enfoque valioso para determinar el papel de la carga de fósforo interno y orientar las decisiones de gestión.

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