Los análisis de linaje celular y el gen de Estudios de la función Uso MARCM Twin-situ
2 de marzo de 2017
Aquí, se presenta un protocolo para una técnica de etiquetado mosaico que permite la visualización de las neuronas derivadas de una célula progenitora común en dos colores distintos. Esto facilita el análisis de linaje neural con la capacidad de las neuronas individuales de nacimiento actualización y el estudio de la función de genes en las mismas neuronas de diferentes individuos.
El objetivo general de este protocolo MARCM de doble punto es realizar análisis de linaje celular de alta resolución y mejores estudios de función génica. El tejido cerebral está compuesto por una gran cantidad de neuronas diversas, es un desafío estudiar el mecanismo subyacente a cómo se ensamblan las neuronas durante el desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es etiquetar las neuronas derivadas de progenitores de neuronas comunes en dos colores distintos.
Que permiten la recuperación del nacimiento de la información de las neuronas individuales. Por lo tanto, esta técnica puede ayudar a los investigadores a explorar el mecanismo celular y molecular que subyace al desarrollo neuronal. Demostrando el procedimiento hoy estará Pei-Chi Chung.
Un técnico del laboratorio del profesor Yu. Comience combinando machos y hembras listos para MARCM de doble punto en un vial de alimento para moscas con levadura fresca en el vial. Mantenga las moscas listas para MARCM de doble punto cruzadas a 25 grados centígrados durante dos días para aumentar las posibilidades de apareamiento antes de recolectar los huevos fertilizados.
Para evitar el hacinamiento cuando las larvas eclosionan, golpee las moscas listas MARCM cruzadas de doble punto y transfiéralas a viales recién fermentados. Cultive la descendencia de MARCM de doble mancha, hasta que alcancen la etapa deseada de desarrollo. Aquí, las moscas en la etapa larvaria serán sometidas a una descarga térmica para inducir la expresión de flippasa.
Transfiera los viales de mosca a un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10, 20, 30, 40 y 50 minutos para determinar el choque térmico óptimo para la expresión de flippasa. Para generar los clones MARCM de doble punto de interés. El momento del choque térmico determina la etapa de generación del aclarado, mientras que el período de choque térmico define cuántos aclarados se generarán.
Cultive los animales MARCM de doble punto de choque térmico a 25 grados centígrados, hasta la etapa de desarrollo deseada. A continuación, proceda a teñir y montar. Agregue PBS a las placas de protección de fórceps.
Y luego, transfiera los animales MARCM de doble punto a los platos. Mientras observa a través de un microscopio de disección, use fórceps para diseccionar los cerebros de los animales MARCM de doble punto. Primero, retira la cabeza del cuerpo de la mosca.
A continuación, retire suavemente la cutícula sin dañar el cerebro. A continuación, retire con cuidado las tráqueas que aparecen como fibras de color blanco. Transfiera los cerebros a un plato de vidrio que contenga 4% de formaldehído y PBS.
Y fijar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Comience el procedimiento de tinción enjuagando los cerebros de las moscas tres veces con 1% de PBT. Y luego lavar con 1%PBT tres veces.
Con agitación durante 30 minutos cada vez. Incubar los cerebros de las moscas con una mezcla de anticuerpos primarios durante la noche a cuatro grados centígrados o durante cuatro horas a temperatura ambiente. Enjuague y lave los sesos de mosca tres veces cada uno con 1% de PBT, agitando como antes.
A continuación, incubar los cerebros de las moscas con una mezcla de anticuerpos secundarios durante cuatro horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Después de enjuagar y lavar los cerebros como antes, monte los sesos en un microportaobjetos con un reactivo anti-enfriamiento. Y luego coloque un cubreobjetos para cubrir y proteger los cerebros de las moscas.
Selle los bordes de la microcubierta de vidrio y el microdeslizamiento con esmalte de uñas transparente. Por último, capture imágenes fluorescentes de clones de MARCM de doble punto a partir de las muestras utilizando el sistema de microscopía confocal de su elección. Esta figura muestra los resultados del clon MARCM de doble punto, una neurona de proyección olfativa antero dorsal VL2p derivada de la inducción de flippasa.
Para mediar la recombinación mítica en el neuroblasto adPN en la etapa embrionaria. Este primer diagrama muestra el patrón de neurogénesis. En esta imagen de microscopio confocal del cerebro, los adPN VL2p se muestran en verde y se asocian con adPN neuroblastos multicelulares en magenta.
Esta imagen muestra las células en el cuerno lateral. Aquí se observa la morfología neuronal del lóbulo antenal. En esta imagen se muestran los datos de los adPN DL1.
Como se ve aquí, los adPN DL1 aparecen más tarde en el desarrollo que los adPN VL2p. La inducción de clones MARCM de puntos gemelos de ADPNs DC3 demuestra que este tipo neuronal aparece más tarde en el desarrollo. Esta imagen muestra que el evento MARCM de doble punto ocurre en una neurona GAL4 negativa dentro del linaje adPN.
Una vez dominada, esta técnica puede ayudar a los investigadores a analizar el linaje neuronal y proporcionar diferentes marcadores para distinguir las neuronas de los clones de neuroblastos. Además, MARCM de doble punto puede producir clones mutantes homocigotos para explorar el mecanismo molecular. En un trasfondo genético heterocigótico.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo MARCM de dos marcadores diseñado para análisis de linaje celular de alta resolución y estudios de función génica en neuronas. Al etiquetar neuronas procedentes de células progenitoras comunes con dos colores distintos, los investigadores pueden rastrear eficazmente el desarrollo y la datación del nacimiento de neuronas individuales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- El tejido cerebral consiste en una diversa variedad de neuronas.
- Comprender el ensamblaje de neuronas durante el desarrollo es complejo.
- Las técnicas actuales podrían no proporcionar una resolución suficiente para el rastreo de linajes.
- Este protocolo tiene como objetivo abordar estos desafíos.
Objetivo del estudio
- Realizar análisis detallados de linajes celulares.
- Mejorar los estudios sobre la función génica en neuronas.
- Facilitar la exploración de los mecanismos celulares y moleculares en el desarrollo neural.
Métodos Utilizados
- Protocolo Twin-spot MARCM para la marcación de neuronas.
- Uso de marcadores de colores distintos para el seguimiento de linajes.
- Técnicas de imagen de alta resolución.
- Análisis del desarrollo neuronal y la función génica.
Resultados principales
- Etiquetado exitoso de neuronas procedentes de progenitores comunes.
- Capacidad para recuperar la información sobre el nacimiento de neuronas individuales.
- Mejor comprensión de la linaje neural y del desarrollo.
- Aplicaciones potenciales en el estudio de la función génica en diferentes individuos.
Conclusiones
- El protocolo MARCM de dos puntos gemelos es una herramienta valiosa para la investigación en neurociencia.
- Permite un análisis detallado de la línea celular neuronal y la función génica.
- Esta técnica puede avanzar significativamente nuestra comprensión del desarrollo neural.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la linaje neural y la función de los genes en organismos modelo proporciona conocimientos fundamentales para la validación de dianas en el desarrollo de neuroterapias. La técnica twin-spot MARCM permite el mapeo de alta resolución del orden de nacimiento neuronal y el análisis fenotípico de neuronas genéticamente idénticas entre individuos, lo que apoya la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. Este enfoque mejora la confianza predictiva al vincular mecanismos de desarrollo con resultados funcionales en sistemas relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el seguimiento de la linaje neuronal desde progenitores comunes para analizar la función génica en poblaciones celulares definidas.
- Valor operativo: Facilita la desviación biológica mediante el análisis fenotípico de clones mutantes homocigotos en contextos heterocigotos, reduciendo la ambigüedad mecanicista.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al proporcionar datos cuantitativos de linaje que se correlacionan con los mecanismos de enfermedades neurodesarrolladoras.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce sistemas neuronales validados y codificados por colores adecuados para la selección de compuestos posteriores en circuitos neuronales relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante la generación clonal inducible y específica por etapa, controlada por la duración del choque térmico.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en múltiples subtipos neuronales (por ejemplo, linajes de adPN) para la selección fenotípica comparativa.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor traslacional: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades al permitir el análisis del orden de nacimiento de neuronas implicadas en trastornos del neurodesarrollo.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite el análisis fenotípico de neuronas idénticas entre animales para distinguir la variabilidad genética de la estocástica en estudios de función génica.
- Continuidad preclínica: Conecta el descubrimiento con la validación al proporcionar datos resueltos por linaje para estudios de interacción con dianas y modulación de vías.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método MARCM de puntos gemelos se integra en la continuación del descubrimiento desde la validación inicial de objetivos hasta estudios mecanicistas preclínicos, particularmente para indicaciones neurodesarrolladoras donde el origen neuronal y la conectividad son fundamentales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al vincular la perturbación génica con fenotipos neuronales específicos de la línea celular.
- Selección: Proporciona preparaciones neuronales listas para ensayos y reproducibles, con resultados cuantitativos basados en el momento clonal de nacimiento y en la expresión de marcadores.
- Análisis: Permite el análisis comparativo de la morfología neuronal y la expresión génica a lo largo de las etapas del desarrollo mediante lecturas de doble color.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica al ofrecer modelos alineados con la línea celular para la modulación de dianas alineadas con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable para generar cohortes neuronales estandarizadas en diversos proyectos y sistemas modelo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir los factores de confusión relacionados con la linaje en estudios de función génica.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante la inducción clonal controlada y protocolos estandarizados de tinción y montaje.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la detección temprana de efectos fenotípicos específicos del linaje, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar claridad mecanicista sobre los objetivos neuronales en tejidos heterogéneos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en genética de Drosophila, técnicas de marcado clonal y microscopía confocal para una interpretación precisa de la linaje.
- Depende de instrumentación que incluye aparatos de choque térmico, microscopios de disección y sistemas de imagen confocal para la inducción y visualización clonal.
- Necesita una estandarización entre equipos en cuanto al momento del choque térmico, protocolos de tinción y parámetros de imagen para garantizar la consistencia clonal entre diferentes usuarios.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes linajes neuronales o etapas de desarrollo distintas del modelo adPN mostrado.
- Incluye limitaciones prácticas, como la dependencia de la eficiencia clonal respecto a la duración del choque térmico y la necesidad de optimización para cada linaje objetivo, tal como se indica en el protocolo.
