Name: La medición de células T Alorreactividad recurriendo a imágenes de Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a medir la alorreactividad de células T mediante citometría de flujo con imágenes. Este método de alto rendimiento permite analizar sinapsis inmunitarias individuales entre células T y células presentadoras de antígenos.

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SCJ fue apoyado por una Sociedad Internacional de Trasplante de Corazón y Pulmón beca de investigación y una Real Colegio de Médicos y Cirujanos de Canadá Detweiler Viajar Fellowship.SM fue apoyado en parte por una Sociedad Internacional para el corazón y el Premio del trasplante pulmonar Desarrollo de Carrera (a SCJ). SS fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud Oxford Research Investigación Biomédica Centre.JH es el receptor de una beca de investigación de riñón UK Crítico no clínica. Este trabajo fue financiado por las siguientes subvenciones a AB y KW: un Wellcome Trust Grant Program (082519Z07Z), una Fundación Británica del Corazón Grant Program (PG / 10 / 62.28504), y el Programa Marco de la UE 7 (un estudio; BioDRIM). Los autores desean agradecer a Michael Sistema de Salud Sinaí, Toronto Parsons y el Servicio de Citometría de Flujo Core en el Instituto de Investigación Lunenfeld-Tanenbaum, para proporcionar el acceso y el apoyo con el instrumento ImageStream Mark X.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Flujo Imaging citometría se ha utilizado para demostrar la formación de sinapsis inmune entre las células T monoclonales y APCs o en presencia de superantígenos 24, 25, 26, 27, 28. Este método aprovecha el hecho de que después de un T productiva de células-APC contacto, la célula T reorganiza su citoesqueleto de actina, polarizando hacia el sitio de contacto 21. Este reordenamiento no se produce sin la señalización de TCR, y por lo tanto es un correlato temprana de activación de células T 19, 20, 21. El método que aquí se presenta este enfoque se adapta a la medida de alorreactiva frecuencia de células T policlonales en poblaciones de células T. Como tal, es posible que en el futuro servirá de base para el desarrollo de ensayos para reactivi donante<html> ty en el trasplante clínico. Aunque aún no se han realizado comparaciones directas, la detección de alorreactivas sinapsis inmune parece tener capacidad de predicción superior a la MLR convencional. Por ejemplo, el trabajo previo ha demostrado que, en el protocolo de tolerización descrito anteriormente, los resultados de una MLR fallan para correlacionar de forma fiable con el resultado de injerto 2. Un número de ensayos se han desarrollado para el estado operacionalmente tolerantes en los seres humanos 9, 10, 11, aunque éstos no miden la función de células efectoras en respuesta a aloantígeno. Por el contrario, IFN ELISPOT ensayos de la función 8 medida efectora de las células T pero no puede capturar el espectro completo de la secreción de citoquinas que pueden ser relevantes para el rechazo agudo y crónico de aloinjerto, tales como IL-17 38,&gt; 39. El ensayo de dilución limitante 4, que es un trabajo intensivo, y el ensayo de trans-vivo 6, que requiere ratones, tienen limitaciones prácticas significativas que pudieran obstaculizar su aplicación en un entorno clínico. Las recientes mejoras en el análisis de células en proliferación mediante el análisis de secuencia de TCR de las células T que responden en la MLR pueden ser de valor, pero al igual que el ensayo que aquí se presenta, requerirá una validación adicional en estudios clínicos 18, 40. Un mayor desarrollo del ensayo de detección de sinapsis inmunológica, será necesario que un número importante de preguntas ser contestadas. En primer lugar, el ensayo como se desarrolló sólo mide alorreactividad directa. La vía directa implica la presentación de alogénicas complejos MHC / péptido en las APC derivadas del donante. Estos últimos son generalmente eliminado rápidamente después del trasplante, y aún más presentación aloantígeno es carried a cabo por APCs receptores que presentan donante intacta MHC (vía semi-directa) o antígenos del donante procesa en auto MHC (vía indirecta). La vía indirecta es un importante motor de rechazo de aloinjerto crónica 33, 41. En principio, debería ser posible detectar sinapsis inmunes indirectos usando este ensayo, pero indirectamente células T alorreactivas tener una frecuencia mucho más baja que los directos 42, 43, lo que significa que se requiere el análisis de un mayor número de eventos. Una segunda consideración es que sólo hemos probado este ensayo usando células T CD4 +, mientras que las células T CD8 + también son un componente importante de la respuesta anti-donante. Una vez más, debe ser posible detectar sinapsis + T CD8 células APC utilizando este método. Otra limitación es que el método requiere la revisión manual y el análisis de imágenes de células en el memb definitivaRane puerta de contacto, y actualmente estamos trabajando en la automatización de este paso. Por último, el método requiere pruebas y el desarrollo en seres humanos, y se están realizando actualmente estudios preliminares con muestras humanas. Un análisis más detallado fenotípica subconjunto de células T (es decir, efector, la memoria, de regulación, etc.) en combinación con la detección de las sinapsis inmune en receptores de trasplante representaría un enfoque poderoso para caracterizar el repertorio de células T alorreactivas y será un enfoque importante para trabajo futuro.

trasplante de órganos sólidos ha transformado el cuidado de pacientes con enfermedades terminales del riñón, el hígado, el corazón y los pulmones. Debido a las disparidades en los antígenos mayores y menores de histocompatibilidad, sin embargo, los aloinjertos son rechazados rápidamente por las células T del receptor si no se utilizan fármacos inmunosupresores. Estos agentes tienen numerosos efectos adversos, incluyendo los riesgos de cáncer y disfunción orgánica. Por consiguiente, un objetivo de mayor importancia clínica es disminuir la dosis de inmunosupresión para el nivel mínimo necesario para evitar el rechazo del injerto. Este nivel puede variar dependiendo del grado de activación del sistema inmune innato; el grado de donante-receptor desajuste aloantígeno; y las diferencias entre pacientes en la función inmune, farmacocinética, y farmacodinámica. Por desgracia, los médicos de trasplante no tienen ninguna herramienta para evaluar con precisión la reactividad de los donantes en pacientes individuales 1. el mixtareacción de leucocitos (MLR) puede detectar la reactividad de los donantes, pero falla para predecir de forma fiable los resultados de injerto 2, 3. Limitación de ensayos de dilución, ELISPOT de citocinas, y el ensayo de trans-vivo ya sea medir un rango limitado de respuestas o no son prácticos firmas 4, 5, 6, 7, 8 .Gene perfiles de expresión han revelado relacionados con la tolerancia operacional 9, 10, 11, 12 y rechazo 13, 14, 15, pero estos no siempre son generalizables a través de poblaciones 16 y puede en última instancia, tienen una utilidad limitada en pacientes individuales. Analy basada en la secuenciases del receptor de células T (TCR) de células T en la sangre periférica 17 o la proliferación en la MLR 18 también se han desarrollado pero requieren validación adicional. Conceptualmente, sería deseable tener un ensayo que detecta las medidas necesarias más tempranos en destinatario activación de células T por un antígeno del donante. Desde el cultivo de células sobre días (como en el MLR) se puede introducir artefactos, tal prueba sería idealmente no requiere la medición de eventos aguas abajo, tales como la proliferación o la función efectora. Igualmente, sin embargo, también sería deseable para que la prueba depende de algún elemento de función de las células T, ya que las evaluaciones puramente descriptivos (Por ejemplo, TCR secuenciación) puede ser incapaz de distinguir entre las células T anérgicas y funcionales. Numerosos estudios han indicado que se requiere prolongado contacto T-APC para la formación de una sinapsis inmune, que es una primera esencialpaso en la respuesta de células T 19, 20, 21, 22. Recientemente hemos informado de que, durante dinámica in vitro de formación de imágenes lapso de tiempo, aproximadamente 5 - 10% de ratón células T CD4 + se forman contactos de larga duración con células de médula alogénica derivadas de médula dendríticas (BMDCs) 23. La frecuencia de contacto prolongado se aumentó en los animales que rechazaron un injerto, mientras que en ratones previamente vuelto tolerantes a los mismos antígenos, se mantuvo en niveles observados en ratones no transplantado 23. Interacciones prolongados se redujeron en presencia de receptor Tregs y el aumento en su ausencia, y se observó un fenómeno similar utilizando células T humanas y DCs alogénicas derivadas de monocitos (moDCs) 23. Sin embargo, la enumeración de los contactos prolongados hizo dentro de un populatio policlonal de células Tn es mucho tiempo y mano de obra intensiva. Por lo tanto, hemos hecho uso de imágenes de citometría de flujo para examinar la formación de sinapsis inmune alogénico. flujo Imaging incorpora citometría de las capacidades de adquisición y análisis de datos multiparamétricos de citometría de flujo convencional con las capacidades de formación de imágenes de una sola célula de microscopía de fluorescencia. Esta técnica ha sido utilizada por otros investigadores para estudiar la formación de sinapsis inmune por las células T monoclonales 24, 26, 27 o en presencia de superantígenos 28. En tales configuraciones, sin embargo, la frecuencia de células T que responden varía de 30-100%, mientras que las células T alorreactivas generalmente se estiman para representar el 5-15% del repertorio total de células T 29, 30, 31, 32. Es importante destacar, puso de manifiesto que el flujo de imágenes citometría puede producir avery medida comparable de alorreactivas frecuencia de células T 23 y que los cambios en la frecuencia de sinapsis dentro de una población de células T policlonales son predictivos de la evolución del injerto 23. Actualmente, este enfoque ha sido optimizado para medir la alorreactividad directa de las células T CD4 +, pero, en principio, también podría ser desarrollado para examinar las células T CD8 + y la vía indirecta. Alorreactividad indirecta se cree que es cada vez más relevante en tiempos más largos después del trasplante 33. Actualmente estamos desarrollando este método para utilizar células humanas, lo que permitirá para las pruebas en pacientes. Por lo tanto, en el futuro, el enfoque general puede ser útil para la evaluación funcional de las respuestas de células T en los receptores de trasplante antes del trasplante; inmediatamente después del trasplante; y en el largo plazo, cuando la minimización de drogas se convierte en un objetivo importante.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Varias</td><td>variaciones</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiamenetetraacético, solución 0,5 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 detergente no iónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>La solución de formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>tiene un 37% de formaldehído y, por lo tanto, debe diluirse 25 veces para obtener una solución al 1,5%</td></tr><tr><td>Filtros celulares, 70 &mu; m tamaño de poro</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de faloidina-fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomicina D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>Reconstituir en DMSO</td></tr><tr><td>Aloficocianina conjugada anti-ratón CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón conjugado azul del Pacífico CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>El azul del Pacífico ha sido reemplazado por eFluor 450</td></tr><tr><td>CD3 anti-ratón biotinilado</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>MHC biotinilado de ratón clase II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón biotinilado B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón biotinilado CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilado anti-ratón CD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>LS columnas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS separador de células magnéticas</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>ratón recombinante GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta humano recombinante; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>TGF humano y beta; 1 tiene actividad en las células de ratón</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II Amnis</td><td>/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Citómetro de flujo de imagen; detalles disponibles en http://www.emdmillipore.com/</td></tr> <tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A Descarga</td><td>gratuita (se requiere registro): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>Medio de cultivo celular&nbsp;</td><td>Varias</td><td>Variaciones Suero</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovino</td><td>Varias</td><td>Variaciones</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular</td><td>Varias</td><td>Variaciones</td><td></td></tr></tbody></table>

la medición de células t alorreactividad recurriendo a imágenes de citometría de flujo

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

es probable que sea crucial para el éxito de la reducción o retirada de la inmunosupresión la medición de la reactividad inmunológica a los antígenos del donante en receptores de trasplante. La reacción de leucocitos mixtos (MLR), limitando ensayos de dilución, y la hipersensibilidad de ensayo de tipo retardado trans-vivo (DTH) han sido aplicados a esta pregunta, pero estos métodos han limitado la capacidad de predicción y / o importantes limitaciones prácticas que reducen su utilidad. flujo de imágenes citometría es una técnica que combina los poderes cuantitativos multiparamétricos de citometría de flujo con las capacidades de imágenes de microscopía de fluorescencia. Recientemente hemos hecho uso de un enfoque de citometría de flujo de formación de imágenes para definir la proporción de células T del receptor capaces de formar sinapsis inmunes maduras con células presentadoras de antígeno (APCs) donantes. Utilizando un modelo de trasplante de corazón de ratón bien caracterizados, hemos demostrado que la frecuencia de las sinapsis inmunes in vitro entre T-APC Membreventos de contacto ane predijeron fuertemente resultado en el rechazo de aloinjertos, la tolerancia, y una situación en la que la supervivencia del trasplante depende de las células T reguladoras inducidas. La frecuencia de los contactos T-APC aumentó con las células T de los ratones durante el rechazo agudo y disminuyó con células T de ratones prestados que no responde a aloantígeno. La adición de las células T reguladoras en el sistema in vitro reduce prolongados contactos T-APC. Fundamentalmente, este efecto también se observó con policlonal humana expandida, de origen natural las células T reguladoras, que son conocidos para controlar el rechazo de tejidos humanos en modelos de ratón humanizado. Un mayor desarrollo de este enfoque puede permitir una caracterización más profunda del compartimento de células T alorreactivas en receptores de trasplante. En el futuro, el desarrollo y la evaluación de este método utilizando células humanas pueden formar la base para ensayos utilizados para seleccionar a los pacientes para la minimización de la inmunosupresión, y puede ser utilizado para medir el impacto de tolerógenoic terapias en la clínica.

Este método se utilizó para investigar CD4 + alorreactividad de las células T en ratones vuelto tolerantes a aloantígenos del donante antes de heterotópico trasplante de aloinjerto cardiaco. Ratones CBA (H-2 K) se les dio un protocolo de tolerización que consiste de un donante-específica (B6, H-2 b) transfusión de sangre se combina con una de no-agotamiento anticuerpo CD4 un mes antes de recibir un trasplante cardíaco B6. Este protocolo da como resultado la supervivencia del aloinjerto a largo plazo que es dependiente de células T reguladoras Foxp3 + 36, 37. Siete días después del trasplante, se obtuvieron las células T CD4 + esplénicas de tolerantes y receptores no tolerantes de aloinjertos cardíacos B6 y se co-incubaron con DCs derivadas de médula ósea B6 de acuerdo con este protocolo. La Figura 2 muestra los datos representativos de este experimento. La puerta de contactos de membrana se muestra en la Figura 2A, con punto de mira verdes colocan en un evento sináptica (panel de la izquierda, 1) y en un evento no sináptica (panel derecho). La Figura 2B muestra los canales de campo claro y fluorescencia para este evento. Para reducir el sesgo, los datos fueron analizados por un observador ciego para la asignación de tratamiento 23. Como se muestra en varios ejemplos en la Figura 3, ambos de no tolerantes (Figura 3A-B) y tolerantes (Figura 3C-D) los receptores CBA de corazones B6, sinapsis se distinguen fácilmente de contactos no sinápticas por la presencia de una cresta FITC-positivo densa en la interfaz T-APC. Estos resultados muestran que la detección visual de las sinapsis inmunes producidas por las células T del receptor rastrea con el grado de alorreactividad en el receptor. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> Figura 2. Identificación de T-APC dobletes con membranaContacto y la formación de sinapsis inmune. Se analizan Eventos en la puerta doblete final (Figura 1F). A. fluorescencia marcador de células T en la máscara objeto APC se representa frente a APC fluorescencia marcador en la máscara objeto DC. Algunos eventos tienen un doblete de APC y una célula T sin contacto célula-célula y aparecen en la esquina inferior izquierda de la trama (imágenes no se muestra). Una puerta de contacto membrana así se puede extraer que incluye sólo dobletes en el que las células T y APCs están en contacto. Las imágenes de cada evento en esta puerta se revisan para detectar evidencia de reordenamiento del citoesqueleto de actina en el canal de faloidina-FITC y se pueden etiquetar con el software de análisis. El panel izquierdo indica un evento sinapsis inmune (con la etiqueta 1 y se indica por retículos verde), mientras que el panel de la derecha indica un evento de contactos de membrana sin la formación de sinapsis inmune (con la etiqueta 2 y se indica por retículos verde). La determinación de la formación de sinapsis requiere revisión manual de estosimágenes, se muestra en B. B. La fila superior muestra de campo claro y fluorescencia de canal imágenes para un doblete con una sinapsis inmune (corresponde al caso 1 en A); La fila inferior muestra un doblete con contactos de membrana, pero que carece de la formación de sinapsis (corresponde al caso 2 en A). Los datos se analizaron de una manera ciega con respecto a la asignación de tratamiento y son de un experimento publicado previamente 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> Figura 3. Ejemplos de T-APC Synapse de formación. Ratones CBA recibieron aloinjertos cardiacos de donantes B6 después de que cualquiera no pre-tratamiento (AB) o después de la inducción de tolerancia con sangre entera B6 debajo de la cubierta de un anticuerpo anti-CD4 de no-agotamiento ( <st<html> rong&gt; CD). Después de 7 días, se ensayaron las células T CD4 + esplénicas para la formación de sinapsis con DCs B6. A. Tres ejemplos de dobletes no sinápticas con contactos de membrana a partir de un animal no tolerizado. B. Tres ejemplos de las sinapsis inmune de un animal no tolerizado. C. Tres ejemplos de dobletes no sinápticas con contacto con la membrana de un animal tolerizado. D. Tres ejemplos de las sinapsis inmune de un animal tolerizado. la formación de sinapsis se indica por la presencia de una cresta brillante, FITC-positiva en la interfaz T-APC (Ch03). Los datos se analizaron de una manera ciega con respecto a la asignación de tratamiento y son de un experimento publicado previamente 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> ays &quot;&gt; <tbody><tr><td> Anticuerpo / Tinte </td><td> fluorocromo </td><td> Canal </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> eF450 </td><td> CH02 </td><td> 5 mg / ml, titule empíricamente </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> CH06 </td><td> 5 mg / ml, titule empíricamente </td></tr><tr><td> faloidina </td><td> FITC </td><td> CH03 </td><td> 0,05 a 0,5 g / ml </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> CH05 </td><td> 25 g / ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los anticuerpos y colorantes utilizados en este estudio. anticuerpos conjugados con fluorocromo, colorantes, proveedores y concentraciones recomendadas se presentan en la tabla. El flujo de imágenes citómetro de canal que se utiliza para detectar cada fluorocromo también se muestra en la tabla.

Este documento describe un método para medir alorreactividad en una población mixta de células T usando flujo de imágenes citometría.

La medición de células T Alorreactividad recurriendo a imágenes de Citometría de Flujo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la aloreactividad de los linfocitos T mediante citometría de flujo con imágenes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología de trasplantes, como qué proporción de los linfocitos T de un receptor reacciona frente a aloantígenos del donante. Esta técnica combina el poder cuantitativo multiparamétrico de la citometría de flujo con las capacidades de imagen de la microscopía fluorescente, lo que permite examinar de forma de alto rendimiento las sinapsis individuales entre linfocitos T y células presentadoras de antígenos.El procedimiento será demostrado por Sajad Moshkelgosha, un posdoctorado de mi laboratorio. Comience sembrando cero punto cinco por diez a la sexta células dendríticas en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos, seguido de una por diez a la sexta células T, y un volumen final de hasta 50 microlitros de medio de cultivo por pocillo.Incube las cultivos frías durante cuatro horas a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono. Luego, añada tres veces el volumen de la cultura de formaldehído al uno punto cinco por ciento en PBS a cada pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al finalizar la fijación, transfiera las células de cada pocillo a un tubo de poliestireno correspondiente de cinco mililitros.Incube las células con los anticuerpos conjugados con fluorocromo apropiados en 100 microlitros de tampón de lavado durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. A continuación, lave las células con un mililitro de tampón de lavado y re suspenda los pellet en tampón de permeabilización/lavado que contenga FITC de faloidina. Tras otros 30 minutos a temperatura ambiente y protegidos de la luz, lave las células con un mililitro de tampón de permeabilización/lavado fresco.ReSuspender los pellet en el colorante nuclear de interés en tampón de permeabilización/lavado durante una incubación final de 30 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Lavar las células con un mililitro de tampón de permeabilización/lavado, seguido de un lavado con tampón de lavado solo. Luego, resuspender las células en 50 a 100 microlitros de tampón de lavado fresco.Transfiera las células a tubos pequeños de microcentrifuga con tapa. Para analizar las interacciones entre célula y célula, primero reserve un canal para la adquisición de imágenes de campo claro y cargue el primer tubo control. Con el canal de campo claro apagado, en la ventana de trabajo, cree un nuevo diagrama de dispersión para cada canal utilizado con la relación de aspecto sobre el área.Ingrese los eventos simples en los que la relación de aspecto sea cercana a uno. Para cada fluorocromo, verifique la población positiva y ajuste el voltaje del láser en el cuadro de iluminación, según sea necesario. En el cuadro de canales, seleccione los canales apropiados para los fluorocromos utilizados en la tinción.Luego, haga clic en grabar. Cuando el número de eventos alcance el umbral especificado, la adquisición se detendrá automáticamente. Después de haber adquirido todos los controles de tinción simple, cargue el primer tubo de muestra experimental y adquiera varias decenas de miles de eventos en los canales de análisis apropiados, incluido el canal de campo brillante.Para generar una matriz de compensación, cargue los archivos de datos de control de tinción individual en el asistente de compensación y seleccione los canales fluorescentes apropiados para el experimento. Después de confirmar que se han seleccionado las poblaciones positivas correctas, haga doble clic en un valor de la matriz y agregue el gráfico al área de análisis para cada canal. Haga clic en finalizar para guardar la matriz de compensación como un archivo CTM.Cargue el archivo RIF en el software de análisis adecuado. Convierta el archivo RIF en un archivo DAF para análisis de datos. Abra el primer archivo de muestra.Represente gráficamente la raíz cuadrada media de la tasa de cambio de la intensidad de la imagen en el canal de campo claro. Luego, represente gráficamente la relación de aspecto frente al área para el marcador de células presentadoras de antígenos. Seleccione los dobletes que contienen una única célula presentadora de antígenos.Represente gráficamente la relación de aspecto frente al área para el marcador de células T. Seleccione los dobletes que contienen una única célula T. Para identificar las células en contacto entre sí, utilice, en el menú de análisis, la opción máscaras para abrir el administrador de máscaras, y denomine la nueva máscara como máscara de objeto de célula T.Haga clic en el botón de función y, en el cuadro de diálogo, seleccione objeto. Seleccione el canal en el que se detecta el marcador de célula T y haga clic en Aceptar. Cree una máscara para el marcador de célula presentadora de antígeno en el canal adecuado de la misma manera. Represente gráficamente la intensidad de fluorescencia del marcador de célula T en la máscara de objeto de célula presentadora de antígeno frente a la intensidad de fluorescencia de la célula presentadora de antígeno en la máscara de objeto de célula T.Luego, dibuje una puerta que incluya únicamente las células en contacto unas con otras. Finalmente, revise manualmente las imágenes de FITC de faloidina de los eventos dentro de esta puerta para distinguir las sinapsis inmunitarias maduras de los simples contactos célula a célula, utilizando la función de imágenes de etiquetas para marcar estas imágenes. Aquí, se muestra la puerta de contacto de membrana para linfocitos T positivos para CD4 esplénicos obtenidos de receptores tolerizados y no tolerizados de aloinjertos cardíacos B6 siete días después del trasplante, coincubados con células dendríticas derivadas de médula ósea B6, como se demuestra.Con los eventos sinápticos y no sinápticos indicados por las cruces verdes. Los análisis de los canales fluorescentes y de brillo también permiten la visualización de los eventos sinápticos y no sinápticos individuales. De hecho, las sinapsis de receptores CDA no tolerizados y tolerizados de corazones B6 se distinguen fácilmente de los contactos no sinápticos por la presencia de crestas densas positivas para FITC en la interfaz entre la célula T y la célula presentadora de antígenos.Después de un mayor desarrollo, esta técnica podría aplicarse en entornos clínicos, como en la reducción o suspensión de la inmunosupresión o en la predicción del resultado del injerto en receptores humanos de trasplantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este artículo describe una técnica simple para inducir aloantígenos específicos de anergia en las células mononucleares de sangre periférica. La técnica puede aplicarse clínicamente para generar no aloreactivas células del donante. La infusión de estas células podría mejorar la reconstitución inmune y reducir la toxicidad después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

La inducción de anergia aloantígenos específicos en las células mononucleares de sangre periférica mediante estimulación aloantígeno con bloqueo de señales co-estimuladoras

Este video muestra un método para evaluar la aloreactividad en poblaciones mixtas de células T mediante la observación de interacciones con células dendríticas portadoras de aloantígenos, lo que conduce a la formación de sinapsis inmunológicas. La tinción diferencial y la cuantificación de dobletes que contienen sinapsis mediante citometría de flujo revelan la aloreactividad de las células T.

Medición de la aloreactividad en una población mixta de células T

Este video muestra una técnica basada en citometría de flujo que utiliza dos fluorocromos para identificar linfocitos T CD4+ y CD8+, linfocitos T γδ, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK) y monocitos en linfocitos mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs). Al incubar las células con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra los marcadores de superficie, los subconjuntos de células se identifican utilizando una estrategia óptima de activación por citometría de flujo.

Ensayo de citometría de flujo para identificar subconjuntos de células inmunitarias en células mononucleares de sangre periférica

El video muestra un método inmunológico para monitorear in vivo la producción de linfocitos T citotóxicos o CTL inducidos por adyuvantes. A un ratón se le inyectan previamente linfocitos T CD8+ de donantes modificados genéticamente, teñidos con colorante proliferativo. La inyección subcutánea de ovoalbúmina con adyuvantes genera linfocitos T CD8+ citotóxicos que se identifican después de la cosecha mediante inmunotinción y citometría de flujo.

Una técnica inmunológica para monitorizar la generación de linfocitos T citotóxicos mediados por adyuvantes

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

Este artículo describe un método para la generación y propagación de clones de células T humanas que responden específicamente a un aloantígeno definido. Este protocolo se puede adaptar para la clonación de células T humanas específicas para una variedad de ligandos péptidos-MHC.

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

Describimos un protocolo para monitorizar la movilidad radial de las células inmunitarias no adherentes in vitro utilizando un aparato de sedimentación celular. La migración celular se rastrea en monocapas de células tumorales o en proteínas de la matriz extracelular. El examen por microscopía óptica y fluorescencia permite observar la movilidad celular y la funcionalidad citotóxica.

Radial Movilidad y citotóxicos Función de Retroviral Replicar Vector transducidas, no adherente Alloresponsive linfocitos T

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El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.

Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo

La afluencia de calcio, una medida de la señalización de las células T, es una forma efectiva de analizar las respuestas a la estimulación del receptor de células T. Este protocolo para multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de superficie celular aprovecha las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo.

Análisis de la afluencia de calcio inducida por receptores de células T en células T murinas primarias mediante citometría de flujo de espectro completo

El presente protocolo describe un flujo de trabajo experimental que permite el análisis ex vivo de la estimulación de células T humanas en un sistema de cocultivo alogénico con células tumorales pretratadas.

Análisis de la actividad de las células T humanas en un entorno de cocultivo alogénico de células tumorales pretratadas

Aprenda a medir la alorreactividad de células T mediante citometría de flujo con imágenes. Este método de alto rendimiento permite analizar sinapsis inmunitarias individuales entre células T y células presentadoras de antígenos.

La medición de células T Alorreactividad recurriendo a imágenes de Citometría de Flujo

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