El aislamiento y enriquecimiento de hígado progenitoras subconjuntos identificados por una combinación de marcadores de superficie Novel

Los objetivos generales de este protocolo de digestión hepática son evaluar los diversos subconjuntos de progenitores hepáticos mediante citometría de flujo y aislar estas células con alta pureza utilizando un cóctel novedoso de marcadores de superficie para análisis posteriores. Este método puede ayudar a responder diversas preguntas sobre la biología de las células progenitoras hepáticas, por ejemplo, cuáles son sus características específicas de subconjunto y cuál es su participación durante la lesión hepática. La ventaja principal de esta técnica es que permite el aislamiento de células progenitoras con alta pureza y viabilidad, lo cual es importante para el análisis in vitro.

Aunque esta técnica de digestión proporciona información sobre la biología de las células progenitoras, en realidad puede utilizarse para el aislamiento de poblaciones de células hematopoyéticas y endoteliales. Para preparar una suspensión de células individuales a partir de un hígado de ratón, transfiera los lóbulos a una placa de Petri seca y use un escalpelo para cortar los tejidos en cubos homogéneos de aproximadamente dos milímetros cúbicos. Transfiera los fragmentos a dos tubos cónicos de centrífuga de 15 mililitros por hígado, conteniendo cada uno 2,5 mililitros de tampón de digestión.

Y coloque las muestras en un baño de agua a 37 grados Celsius con agitación suave a los cinco y diez minutos. Después de 15 minutos de digestión, utilice una pipeta de 1.000 microlitros con la punta cortada para titular suavemente los trozos de hígado. Luego, devuelva los tubos al baño y deje que los trozos sedimenten durante dos minutos.

A continuación, filtre dos alícuotas de aproximadamente 700 microlitros del sobrenadante a través de un tamiz de 100 micrones previamente humedecido con 800 microlitros de tampón de recolección. Y reemplace el sobrenadante eliminado con tampón de digestión fresco. Cuando el tejido hepático ya no sea visible, pase todo el sobrenadante de los tubos de digestión a través del filtro.

Y recoger todas las células mediante centrifugación. Suspender los pellets en un mililitro de tampón de lisis de cloruro amónico potásico a temperatura ambiente, deteniendo la lisis con cinco mililitros de tampón de recolección fresco después de un minuto. Recoger las células mediante otra centrifugación.

Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento suelto. Y resuspenda las células en cuatro mililitros de tampón de recolección fresco sobre hielo. Para determinar el número de células en la muestra de hígado mediante citometría de flujo, primero mezcle 20 microlitros de la suspensión celular de hígado con 174 microlitros de PBS en un tubo de poliestireno de 1,5 mililitros y seis microlitros de yoduro de propidio.

Agregue perlas de conteo que permitan la cuantificación celular y cargue la mezcla de perlas y células en el citómetro de flujo. Seleccione según los parámetros de dispersión lateral frente a dispersión anterior para evitar restos celulares. Excluya los dobletes mediante una puerta de altura de dispersión anterior frente a área de dispersión anterior y las células muertas positivas para yoduro de propidio.

Luego, cargue una muestra de 30 microlitros en el citómetro de flujo y registre los eventos. Para teñir las células hepáticas y analizar mediante citometría de flujo los subconjuntos de progenitores, transfiera alícuotas de 2x10^5 células a tubos de reacción de 1,5 mililitros. Y pelete las células mediante centrifugación.

ReSuspender los pellet en bloqueo Fc durante cinco minutos de incubación en hielo. Luego, añadir 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos para tinción de superficie celular de interés a los tubos correspondientes y realizar una incubación de 20 minutos en hielo protegidos de la luz. Al final de la incubación, lavar las muestras con 400 microlitros de tampón de tinción por muestra.

Y re suspenda los pellet en 100 microlitros del cóctel adecuado de anticuerpos secundarios durante 20 minutos en hielo protegido de la luz. Luego lave las células con otros 400 microlitros de tampón de tinción. Y re suspenda los pellet en 300 microlitros de tampón de tinción que contenga yoduro de propidio.

Mida la muestra utilizando un citómetro de flujo. Para enriquecer la población de células progenitoras mediante separación basada en microperlas magnéticas, transfiera 1,5-2x10^6 células al número adecuado de tubos cónicos de 15 mililitros y recolecte las células por centrifugación. Re_suspenda los pellets en 400 microlitros de HBSS suplementado con BSA.

Añada 40 microlitros de microperlas anti-CD31 y 30 microlitros de microperlas anti-CD45 para una incubación de 15 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, lave las células con cinco mililitros de HBSS más BSA. Y resuspenda los pellet en 100 microlitros de microperlas para eliminación de células muertas durante una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente.

Mientras las células están en incubación, equilibre una columna de selección positiva de tamaño adecuado por hígado con tres mililitros de HBSS más BSA. Luego, agregue 900 microlitros de HBSS más BSA a las células y filtre las células a través de una malla de filtro de poliamida de 100 micrones. Cargue las células incubadas con perlas filtradas sobre las columnas, recolectando el eluato en el tubo de centrífuga.

Cuando todas las células hayan pasado a través de la columna, lave las columnas tres veces con tres mililitros de HBSS más BSA. Precipite las células por centrifugación y re suspenda el sedimento celular en 100 microlitros de tampón de lavado y bloqueador de Fc. Recolecte los sedimentos celulares de cuatro a seis hígados o hasta menos de 1x10^6 células negativamente seleccionadas.

Después de cinco minutos, etiquete las células con el anticuerpo biotinilado anti-GP38 durante 10 minutos en hielo. Al final de la incubación, recupere las células por centrifugación para resuspenderlas en 400 microlitros de tampón de lavado y cinco microlitros de Microperlas Anti-Biotina. Después de 15 minutos a cuatro grados Celsius, lave inmediatamente las células con cinco mililitros de tampón de lavado.

Y re-suspender el precipitado en un mililitro de tampón de lavado fresco. Colocar las células re-suspendidas en una gradilla de 15 tubos refrigerada e iniciar la separación magnética automática. Luego, centrifugar el flujo pasante y re-suspender los precipitados en la solución adecuada para el análisis experimental posterior planeado.

Al seleccionar las células negativas para CD45, CD31 y el receptor de asialoglicoproteína uno, se enriquecen las células progenitoras hepáticas, que luego pueden agruparse según su expresión de glicoproteína 38 y CD133. Las células gp38 positivas CD133 positivas y las células gp38 negativas CD133 positivas representan las poblaciones celulares más abundantes entre las células CD45 negativas, CD31 negativas y ASGPR1 negativas en el hígado de ratón adulto sano, con diferencias evidentes en su expresión de diversos marcadores de superficie previamente asociados con células progenitoras. El aislamiento de estas células progenitoras mediante microesferas magnéticas, como se acaba de demostrar, da como resultado una pureza superior al 90 % de las células hepáticas con un alto grado de viabilidad.

Al intentar aislar estas células poco comunes, es importante tener en cuenta las enzimas utilizadas durante los pasos de digestión hepática, ya que diferentes enzimas pueden producir preferentemente subpoblaciones específicas de progenitores y reducir considerablemente los niveles de expresión de CD133. Es fundamental recordar que la pureza y el rendimiento celular dependen de la preparación suave de las suspensiones de células individuales del hígado. Asimismo, una gran cantidad de restos celulares y contaminación por células en muerte pueden afectar negativamente el éxito de este protocolo.