Polidimetilsiloxano-policarbonato celular dispositivos de microfluidos para Estudios de Inmigración en virtud perpendicular Química y gradientes de oxígeno

El objetivo general de este experimento es establecer un dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano-policarbonato para estudiar la migración de células mamíferas bajo diversas combinaciones de gradientes químicos y de oxígeno perpendiculares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los estudios de migración de células mamíferas, incluyendo los efectos de estos gradientes sobre la migración de diferentes tipos de células o células con genes modificados. La principal ventaja de esta técnica es que todo el montaje experimental puede realizarse en un incubador convencional, lo que proporciona condiciones óptimas de cultivo celular sin necesidad de un montaje complicado ni de instrumentación voluminosa.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de la capacidad de metástasis de las células cancerosas, ya que la motilidad celular y los diversos gradientes relacionados fisiológicamente pueden caracterizarse mediante el uso del dispositivo microfluídico. Este método puede proporcionar información sobre la migración de células de mamífero. También puede aplicarse a otros estudios celulares, como pruebas farmacológicas in vitro basadas en células con combinaciones de concentraciones de fármacos y tensiones de oxígeno.

Transfiera dos gramos de polidimetilsiloxano, o prepolímero de PDMS, sobre el molde con los patrones de canales fluidicos de la capa superior para formar una capa delgada de PDMS. Luego, coloque el molde en un sistema de desecador para desgasificar el PDMS durante 60 minutos. Después de la desgasificación, coloque el molde durante toda la noche en un horno a 60 grados Celsius para el curado del PDMS.

Asegúrese de que el molde esté en un plano horizontal. Después de enfriar el molde a temperatura ambiente, vierta 13 gramos adicionales de prepolímero de PDMS sobre el molde y luego desgasifique el PDMS en el equipo de desecador durante 60 minutos. Incruste lentamente una película de policarbonato, o PC, de un milímetro de espesor en la capa fresca de PDMS como barrera de difusión de gases.

Extruir cualquier burbuja presente. Luego, coloque el molde en el horno a 60 grados Celsius durante la noche. Asegúrese de que el molde esté sobre un plano horizontal.

Después de enfriar el PDMS curado hasta temperatura ambiente, corte el dispositivo con un escalpelo hasta un área de aproximadamente 5,5 por cinco centímetros cuadrados, que pueda cubrir todos los patrones de los canales. Luego, desprenda la capa de PDMS del molde. A continuación, haga orificios para las entradas y salidas utilizando un punzón de biopsia de dos milímetros de diámetro.

Guarde la capa superior de PDMS-PC fabricada lejos del polvo ambiental para su posterior ensamblaje. Para ensamblar el dispositivo, coloque primero la capa superior de PDMS-PC fabricada y la oblea con la membrana de PDMS codificada por centrifugado en una máquina de tratamiento superficial con plasma de oxígeno, con las superficies de unión orientadas hacia arriba. Trate las superficies de PDMS con plasma de oxígeno de 90 vatios durante 40 segundos.

Una vez realizada la modificación superficial del PDMS mediante plasma de oxígeno, una inmediatamente la capa superior a la membrana de PDMS. Coloque un peso sobre las capas unidas y colóquelas en un horno a 60 grados Celsius durante la noche para favorecer la unión. Una vez que las capas unidas se hayan enfriado a temperatura ambiente, corte la membrana unida a la capa superior con un bisturí, dejándola con un área aproximada de 5,5 por cinco centímetros cuadrados.

Despegue la estructura unida de la oblea de silicio y haga perforaciones en las entradas y salidas del canal de gradiente químico utilizando un punzón de biopsia de dos milímetros de diámetro. Luego, coloque la capa superior con la membrana unida y la capa inferior de PDMS fabricada en la máquina de tratamiento superficial con plasma de oxígeno, con las superficies de unión orientadas hacia arriba. Para activar las superficies de PDMS, utilice el plasma a 90 vatios durante 40 segundos.

Una vez realizada la preparación de la superficie, una inmediatamente las capas superior e inferior para la unión. Coloque un peso encima de todo el dispositivo unido y déjelo durante la noche en un horno a 60 grados Celsius. Al día siguiente, saque todo el dispositivo fabricado del horno y enfríelo hasta temperatura ambiente.

Comience el ensayo de migración celular microfluídico con la preparación de las células en el dispositivo, tal como se describe en el protocolo escrito. En el día dos, aspire el medio de las células que se han cultivado desde el día cero y lave las células dos veces con cinco mililitros de DPBS. Aspire el DPBS y añada dos mililitros de tripsina-EDTA, luego incube las células en el incubador durante cinco minutos para desprenderlas de la superficie del frasco.

Una vez que las células se hayan desprendido y estén suspendidas en la solución, agregue ocho mililitros de medio sin suero al matraz. Transfiera todos los líquidos a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 140 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y agregue una cantidad adecuada de medio sin suero para obtener una densidad celular final de un millón de células por mililitro.

A continuación, retire el dispositivo microfluídico preparado el primer día según se describe en el protocolo escrito. Utilice una jeringa de un mililitro con una aguja romo de calibre 14 para inyectar el medio sin suero a través de la salida del canal de gradiente químico hasta que el medio salga por ambas agujas en las entradas. Luego, inyecte 200 microlitros de la suspensión celular desde la salida del canal de gradiente químico.

Observe la cámara de cultivo celular en el dispositivo bajo un microscopio para confirmar que las células han sido introducidas en el canal microfluídico. Luego, coloque el dispositivo en un recipiente húmedo y manténgalo en una incubadora de cultivo celular durante cinco horas para favorecer la adhesión de las células a la superficie del dispositivo. Mientras tanto, prepare el reactivo químico a la concentración deseada en medio sin suero.

Aspire el medio sin suero, con y sin el producto químico, a dos jeringas separadas de tres mililitros conectadas a un tubo de alta pureza. Luego, coloque las jeringas en una bomba de jeringas con un flujo de un microlitro por minuto para su uso posterior. A continuación, prepare 15 mililitros de una solución de hidróxido de sodio uno molar y 15 mililitros de una solución de pirogalol a 200 miligramos por mililitro.

Introduzca la solución de hidróxido de sodio en una jeringa de 15 mililitros conectada a un tubo de PFTE de alta pureza e introduzca la solución de pirogalol en una jeringa de 15 mililitros conectada a un tubo de alta pureza. Coloque las jeringas en una bomba de jeringas con un caudal de cinco microlitros por minuto para su uso posterior. Después de la incubación de cinco horas, retire todo el dispositivo y colóquelo sobre una placa de Petri de 15 centímetros de diámetro.

Sujete el dispositivo en la placa de Petri utilizando masilla adhesiva, luego transfiera la placa de Petri a un microscopio de imagen en tiempo real para células vivas dentro de un incubador. Conecte los tubos de las jeringas a las entradas del canal de gradiente químico para generar el gradiente químico. A continuación, conecte la salida al tubo que conduce a un depósito de desecho.

Encienda la bomba de jeringa con las jeringas para la generación del gradiente químico. A continuación, conecte el tubo de alta pureza desde las jeringas que contienen cloruro de sodio y pirogalol hasta las entradas del canal de gradiente de oxígeno. Conecte el tubo a la salida para recoger los desechos y encienda la bomba de jeringa con las jeringas para la generación del gradiente de oxígeno.

Añada aproximadamente 15 mililitros de agua doblemente destilada a la placa de Petri para mantener el dispositivo hidratado. Luego, prepare el microscopio de imagen en células vivas para la captura de imágenes con intervalos de tiempo y tome una imagen cada 15 minutos. Realice la recopilación y análisis de datos, así como la caracterización de gradientes, tal como se describe en el protocolo escrito.

Se muestran aquí resultados representativos de gradientes químicos generados dentro del dispositivo microfluídico para la migración celular. El resultado de la simulación numérica concuerda bien con la caracterización experimental utilizando solución de fluoresceína como el compuesto químico. Los gradientes de otros compuestos químicos, como la quimiocina SDF-1 alfa, también pueden estimarse previamente mediante la simulación.

Los gradientes de oxígeno generados dentro del dispositivo pueden caracterizarse experimentalmente mediante un colorante fluorescente sensible al oxígeno. Por lo general, se pueden establecer de forma estable gradientes de oxígeno desde 1 % en la corriente ascendente hasta 16 % en la corriente descendente dentro del dispositivo. Aquí se muestran imágenes típicas con intervalos de tiempo recopiladas durante los experimentos utilizando un microscopio de imagen de células vivas.

Después del análisis de la imagen, se pueden calcular las trayectorias de migración de las células A549 y sus movimientos promedio. En ausencia de gradientes, las células muestran migración aleatoria y el movimiento promedio es cercano a cero. Con un gradiente únicamente de la quimiocina SDF-1 alpha, las células muestran comportamiento quimiotáctico y migran hacia la dirección del gradiente alto de quimiocina, tal como se espera.

Con solo un gradiente de oxígeno, las células se mueven hacia la dirección de bajo oxígeno, mostrando un comportamiento aerotáctico que no ha sido ampliamente estudiado en células mamíferas. Curiosamente, con gradientes tanto de quimioquinas como de oxígeno, las células se desplazan hacia el gradiente de bajo oxígeno, lo que indica que el gradiente de oxígeno tiene efectos dominantes. Esta observación requiere un estudio más profundo.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar nivelar bien el dispositivo durante la fabricación y eliminar las burbujas de aire dentro del montaje del dispositivo microfluídico durante el experimento de migración celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar un dispositivo microfluídico de PDMS-PC y configurar los experimentos para estudiar la migración de células mamíferas bajo combinaciones de gradientes químicos y de oxígeno.