Polidimetilsiloxano-policarbonato celular dispositivos de microfluidos para Estudios de Inmigración en virtud perpendicular Química y gradientes de oxígeno

El objetivo general de este experimento es establecer un dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano-policarbonato para la migración de células de mamíferos bajo varias combinaciones de gradientes químicos y de oxígeno perpendiculares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los estudios de migración de células de mamíferos, incluidos los efectos de estos gradientes en la migración de diferentes tipos de células o células con genes ote. La principal ventaja de esta técnica es que toda la configuración experimental se puede llevar a cabo en una incubadora convencional para obtener condiciones óptimas de cultivo celular sin una configuración tediosa y una instrumentación voluminosa.

Las implicaciones de esta técnica se extendieron hacia el diagnóstico de la metástasis de las células cancerosas, ya que la motilidad celular y los diversos gradientes fisiológicamente relacionados se pueden caracterizar utilizando el dispositivo microfluídico. Este método puede proporcionar información sobre la migración de células de mamíferos. También se puede aplicar a otros estudios celulares, como las pruebas de fármacos in vitro basadas en células sobre las combinaciones de concentraciones de fármacos y tensiones de oxígeno.

Transfiera dos gramos de polidimetilsiloxano, o prepolímero de PDMS, al molde con los patrones de canal fluídico de la capa superior para hacer una capa delgada de PDMS. Luego, coloque el molde en una configuración de desecador para desgasificar el PDMS durante 60 minutos. Después de la desgasificación, coloque el molde durante la noche en un horno a 60 grados centígrados para el curado de PDMS.

Asegúrate de que el molde esté en un plano horizontal. Después de enfriar el molde a temperatura ambiente, vierta 13 gramos adicionales de prepolímero PDMS en el molde, luego desgasifique el PDMS en la configuración del desecador durante 60 minutos. Incrustó lentamente una película de policarbonato o PC de un milímetro de espesor en la capa fresca de PDMS como barrera de difusión de gas.

Expulsa las burbujas que estén presentes. Luego, coloque el molde en el horno a 60 grados centígrados durante la noche. Asegúrate de que el molde esté en un plano horizontal.

Después de enfriar el PDMS curado a temperatura ambiente, corte el dispositivo con un bisturí a un área de aproximadamente 5,5 por cinco centímetros cuadrados que pueda cubrir todos los patrones de canales. A continuación, retire el laboratorio de PDMS del molde. A continuación, perfore los orificios de entrada y salida con un punzón de biopsia de dos milímetros de diámetro.

Guarde la capa superior PDMS-PC fabricada lejos del polvo ambiental para su posterior montaje. Para ensamblar el dispositivo, primero coloque la capa superior de PDMS-PC fabricada y la oblea con la membrana PDMS codificada por espín en una máquina de tratamiento de superficies de plasma de oxígeno con las superficies de unión hacia arriba. Trate las superficies del PDMS con 90 vatios de plasma de oxígeno durante 40 segundos.

Adhiera la capa superior a la membrana PDMS inmediatamente después del tratamiento de la superficie del plasma de oxígeno. Coloque un peso encima de las capas adheridas y póngalas en un horno a 60 grados centígrados durante la noche para promover la unión. Una vez que las capas adheridas se hayan enfriado a temperatura ambiente, corte la membrana unida a la capa superior con un bisturí en un área de aproximadamente 5,5 por cinco centímetros cuadrados.

Pegue la estructura adherida de la oblea de silicio y perfore los orificios en las entradas y salidas del canal de gradiente químico con un punzón de biopsia de dos milímetros de diámetro. Luego, coloque la capa superior unida a la membrana y la capa inferior de PDMS fabricada en la máquina de tratamiento de superficies con plasma de oxígeno con las superficies de unión hacia arriba. Para activar las superficies PDMS, utilice el plasma a 90 vatios durante 40 segundos.

Fije las capas superior e inferior juntas para unirlas inmediatamente después del tratamiento de la superficie. Coloque el peso encima de todo el dispositivo adherido y déjelo toda la noche en un horno a 60 grados centígrados. Al día siguiente, saque todo el dispositivo fabricado del horno y enfríelo a temperatura ambiente.

Comience el ensayo de migración celular microfluídica mediante la preparación de las células en el dispositivo como se describe en el protocolo de texto. En el segundo día, aspire el medio de las células que se cultivaron desde el día cero y lave las células con cinco mililitros de DPBS dos veces. Aspire el DPBS y agregue dos mililitros de tripsina-EDTA, luego incube las células en la incubadora durante cinco minutos para separar las células de la superficie del matraz.

Una vez que las células se hayan desprendido y suspendido en la solución, agregue ocho mililitros de medio libre de suero al matraz. Transfiera todos los líquidos a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 140 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y agregue una cantidad adecuada de medio libre de suero para obtener una densidad celular final de un millón de células por mililitro.

A continuación, saque el dispositivo microfluídico preparado el primer día como se describe en el protocolo de texto. Use una jeringa de un mililitro con una aguja roma de calibre 14 para inyectar el medio libre de suero a través de la salida del canal de gradiente químico hasta que el medio salga de ambas agujas en las entradas. A continuación, inyecte 200 microlitros de la suspensión celular desde la salida del canal de gradiente químico.

Observe la cámara de cultivo celular en el dispositivo bajo un microscopio para confirmar que las células se han introducido en el canal microfluídico. Luego, coloque el dispositivo en un recipiente húmedo y manténgalo en una incubadora de cultivo celular durante cinco horas para promover la adhesión de las células a la superficie del dispositivo. Mientras tanto, prepare el producto químico a la concentración deseada en un medio libre de suero.

Extraiga el medio libre de suero con y sin el producto químico en dos jeringas separadas de tres mililitros conectadas al tubo de alta pureza. Luego, coloque las jeringas en una bomba de jeringa con un caudal de un microlitro por minuto para su uso posterior. A continuación, prepare 15 mililitros de una solución de hidróxido de sodio de un molar y 15 mililitros de 200 miligramos por mililitro de solución de pirogalol.

Extraiga la solución de hidróxido de sodio en una jeringa de 15 mililitros conectada a un tubo PFTE de alta pureza y extraiga la solución de pirogalol en una jeringa de 15 mililitros conectada a un tubo de alta pureza. Coloque las jeringas en una bomba de jeringa con un caudal de cinco microlitros por minuto para su uso posterior. Después de las cinco horas de incubación, saque todo el dispositivo y colóquelo en una placa de Petri de 15 centímetros de diámetro.

Fije el dispositivo en la placa de Petri con masilla adhesiva, luego transfiera la placa de Petri a un microscopio de imágenes de células vivas en una incubadora. Conecte el tubo de las jeringas a las entradas del canal de gradiente químico para la generación del gradiente químico. Luego, conecte la salida a la tubería que conduce a un depósito de desechos.

Encienda la bomba de jeringa con las jeringas para la generación de gradiente químico. A continuación, conecte el tubo de alta pureza de las jeringas que contienen cloruro de sodio y pirogalol a las entradas del canal de gradiente de oxígeno. Conecte el tubo a la salida para recoger los desechos y encienda la bomba de jeringa con las jeringas para la generación de gradiente de oxígeno.

Agregue unos 15 mililitros de agua destilada doble a la placa de Petri para mantener el dispositivo hidratado. A continuación, configure el microscopio de imágenes de células vivas para la captura de imágenes en intervalos de tiempo y tome una imagen cada 15 minutos. Realizar la recopilación y el análisis de datos, así como la caracterización de gradientes como se describe en el protocolo de texto.

Aquí se muestran resultados representativos de los gradientes químicos generados dentro del dispositivo microfluídico para la migración celular. El resultado de la simulación numérica concuerda bien con la caracterización experimental utilizando la solución de fluoresceína como producto químico. Los gradientes de otros productos químicos, como la quimiocina SDF-1 alfa, también se pueden estimar de antemano mediante la simulación.

Los gradientes de oxígeno generados dentro del dispositivo se pueden caracterizar experimentalmente utilizando un tinte de fluorescencia sensible al oxígeno. Por lo general, los gradientes de oxígeno del 1 % en la parte superior al 16 % en la parte posterior se pueden establecer de manera estable dentro del dispositivo. Aquí se muestran imágenes típicas de lapso de tiempo recopiladas durante los experimentos utilizando un microscopio de imágenes de células vivas.

Después del análisis de imágenes, se pueden calcular las trayectorias de migración de las células A549 y sus movimientos promedio. Sin gradientes, las celdas muestran una migración aleatoria y el movimiento promedio es cercano a cero. Con solo un gradiente de quimiocinas alfa SDF-1, las células muestran un comportamiento quimiotáctico y migran hacia la dirección de alto gradiente de quimiocinas como se esperaba.

Con solo un gradiente de oxígeno, las células se mueven hacia la dirección de bajo oxígeno, mostrando un comportamiento aerotáctico que no ha sido bien estudiado para las células de mamíferos. Curiosamente, con los gradientes de quimiocina y oxígeno, las células se mueven hacia el gradiente de bajo oxígeno, lo que demuestra que el gradiente de oxígeno tiene efectos dominantes. Esta observación requiere un estudio más profundo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar nivelar bien el dispositivo durante la fabricación y eliminar las burbujas de aire dentro de la configuración del dispositivo microfluídico durante el experimento de migración celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar un dispositivo microfluídico PDMS-PC y configurar los experimentos para estudiar la migración de células de mamíferos bajo combinaciones de gradientes químicos y de oxígeno.