Name: Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende a medir el potencial de membrana en neuronas motoras de Danio rerio usando biosensores FRET no invasivos. Este método permite estudiar la excitabilidad neuronal en vivo y comprender trastornos neurológicos.

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Los autores quieren agradecer a Simona Rodighiero su inestimable apoyo con el análisis de imágenes FRET.

1. pHuC_Mermaid Plásmido Generación NOTA: Mermaid es un biosensor desarrollado mediante el acoplamiento del dominio de detección de voltaje (VSD) de la Ciona intestinalis (ahora Ciona robusta ) que contiene fosfatasa (Ci-VSP) con los fluoróforos del socio FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donante) y una versión monomérica de la proteína fluorescente emisora ​​de naranja Kusabira Orange (mKOk: acceptor). Para este biosensor, los cambios conformacionales del dominio VSD, inducidos por la despolarización de la membrana, aumentan la proximidad de las proteínas fluorescentes dadoras y aceptoras, aumentando así la transferencia de energía entre ellas (aumentando la relación FRET) 3 . El VSD asegura la localización eficiente del biosensor en la membrana plasmática. La expresión neuronal del biosensor (en la médula espinal, la señal es detectable tanto en interneuronas como en neuronas motoras) se logra clonando la sirena opEn marco de lectura (ORF) bajo el pez cebra pan-neuronal promotor HuC [ 6] . <ol><li> Se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el ORF Mermaid del plásmido 3 de la sirena pCS4 + con la polimerasa de ADN Pfu (corrección) utilizando el cebador T3 Universal y el cebador Mermaid Sma I (5&#39;TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) para insertar un sitio de restricción SmaI aguas arriba De la Sirena ORF. <ol><li> Utilizar la siguiente mezcla de PCR: 0,5 μl de DNA polimerasa Pfu, 7,5 μl del tampón 10x específico, 1 μl de dNTP 10 mM, 2,5 μl de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,5 μl (50 ng) de la preparación de plásmido y 1 Μl de soluciones madre de 20 μM de cada cebador en un volumen total de 50 μl. </li><li> Calentar la mezcla de PCR durante 15 s a 95 ° C, cebar durante 15 s a 50 ° C, y alargar durante 4 min a 72 ° C durante un total de 35 ciclos. </li></ol></li><li> Gel-purificar el concreto específicoPCR usando un kit comercial de purificación de gel, siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Clonar el fragmento de ADN en el vector blunt pCMV-SC siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Linearizar el plásmido positivo Mermaid (denominado pCMV-SC_Mermaid) con la enzima de restricción Sma I para la siguiente inserción del promotor HuC. <ol><li> Establecer la reacción de restricción de la siguiente manera: 0,5 μ l (10 U) de la enzima de restricción Sma I, 2 μ l del kit 10 x tampón, y 5 μ g de ADN plasmídico en un volumen total de 20 μ l. Incubar la reacción a 25 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Gel-purificar el plásmido digerido utilizando un kit comercial de purificación de gel siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> PCR-amplificar el promotor HuC (pHuC), con Pfu ADN polimerasa y zebrafish ADN genómico como plantilla, utilizando un par de HuC-primers específicos (HuCprom-forw1_SalI: 5&#39;-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA y HuCproM-rev1: 5&#39;-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) y abarcando una región de 3.150 pb aguas arriba del ATG. <ol><li> Se preparó la mezcla de PCR usando el siguiente esquema: 0,5 μl de DNA polimerasa Pfu, 7,5 μl del tampón 10x específico, 1 μl de dNTP 10 mM, 2,5 μl de DMSO, 200 ng de ADN genómico y 1 μl de 20 μM Stock de cada cebador en un volumen total de 50 μl. </li><li> Después de un paso inicial de 2 min a 95 ° C, calentar la mezcla de PCR durante 15 s a 95 ° C, cebar durante 15 s a 50 ° C, y alargarla durante 4 min a 72 ° C durante un total de 35 ciclos . </li></ol></li><li> Purificar con gel el producto de PCR blunt específico usando un kit comercial de purificación de gel siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Ligar una cantidad equimolar del pCMV-SC_Mermaid purificado (etapa 1.5) y del ADN de pHuC (etapa 1.7) usando 1 μl de T4 DNA ligasa y 1 μl del tampón 10X específico en un volumen total de 10 μl. Incubar la reacción durante 16 h a4ºC. </li><li> Transformar una alícuota de células competentes con 5 μl de la reacción de ligación (paso 1.8) siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Seleccionar los clones pHuC positivos (pHuC_Mermaid) con el promotor insertado en la orientación apropiada por una doble digestión Sal I- Eco RV (el sitio de restricción Sal I se ha insertado antes del fragmento promotor en la etapa 1.6, mientras que el sitio de restricción Eco RV Se sitúa aguas abajo de la región de poliadenilación, PolyA, del plásmido pCMV-SC). <ol><li> Establecer la reacción de restricción de la siguiente manera: 0,5 μ l (10 U) de ambos Sal I y Eco RV enzimas de restricción, 2 μ l del kit10X buffer, y 1 μ g de pHuC_Mermaid ADN en un volumen total de 20 μL. Incubar la reacción a 37 ° C durante 1 h. Ejecutar las reacciones sobre un gel de agarosa. </li></ol></li></ol> 2. Microinyección de embriones <ol><li> Transferir el fertilizado por ejemploGs obtenido de cebra salvaje de tipo salvaje (cepa AB) o Sod1-G93R adulto 4 a una placa de Petri de 10 mm usando una pipeta de plástico. </li><li> Enjuague los embriones en agua de pescado fría (4 ° C) e inmediatamente microinyúdalos en la yema con 200 μg de plásmido pHuC_Mermaid usando un microinyector (para una descripción general y detallada del procedimiento de microinyección, ver Referencias 7 y 8). </li><li> Utilizando una pipeta de plástico, transfiera los embriones a una placa de Petri y los incube en agua de pescado a 28 ° C hasta que alcancen la etapa de desarrollo deseada (20-24 h después de la fertilización, hpf) para los siguientes análisis. </li></ol> 3. Análisis espontáneo de la cola de cola NOTA: Evaluar el comportamiento espontáneo de enrollamiento de la cola en embriones de 20-24 hpf con o sin el riluzol del fármaco. <ol><li> Transferir un embrión a una placa de Petri redonda de 90 mm llena de agua de pescado que contenga 0,2% de DMSO (vehículo riluzol) y descomprímala manualmente usando twO pinzas de joyería con puntas afiladas. Incubar el embrión durante 5 min. </li><li> Detectar el enrollamiento de cola a RT durante una grabación de vídeo de 1 minuto usando una cámara digital montada en un estereomicroscopio. Adquiera series temporales con una resolución de 30 fotogramas por segundo. </li><li> Calcule la frecuencia de las bobinas espontáneas de la cola contando el número de curvas (tanto contralateral como ipsilateral) por unidad de tiempo. </li><li> Para evaluar el efecto del fármaco riluzol, utilice suavemente una pipeta Pasteur de plástico para transferir el embrión a una nueva placa de Petri de 90 mm llena de agua de pescado que contenga riluzol 5 μM. <ol><li> Incubar el embrión durante 5 minutos antes de grabar un video de 1 minuto y realizar el análisis de comportamiento como el anterior. </li></ol></li></ol> 4. Configuración de imágenes para la visualización de biosensores de sirena en embriones vivos: detección simultánea de señales de donantes y aceptoras <ol><li> Montar los embriones de 20 - 24 hpf en 1% de agarosa de bajo punto de fusión en agua de pescado al37 ° C dentro de un plato de imagen de fondo de vidrio de 35 mm. Oriente los embriones en sus lados. Espere hasta que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente. </li><li> Transferir el plato de imagen a la etapa de un confocal invertido montado en un microscopio invertido. Identificar las neuronas motrices que expresan el biosensor con un objetivo 20X (0.7 apertura numérica, NA) mediante la excitación de la mUKG con la línea de 488 nm de láser de argón y el registro de su emisión entre 495 y 525 nm. </li><li> Para una medición de FRET, excite mUKG, el donante del par FRET, con la línea láser de 488 nm. Detecta simultáneamente, con un escáner resonante que opera a 8.000 Hz en el modo bidireccional, la fluorescencia emitida por el donante (entre 495 y 525 nm) y la fluorescencia emitida por el receptor mKOk (entre 550 y 650 nm, canal FRET). Si está disponible, utilice el láser de 473 nm. NOTA: La eficiencia de excitación del donante se reducirá ligeramente (85% en lugar de 93% con 488 nm), pero la excitación cruzada del aceptor será(Del 17% con el 488 nm al 9% con línea láser de 473 nm). </li><li> Para reducir la fototoxicidad y el blanqueo con fluoróforos, minimice la iluminación de la muestra reduciendo la potencia de la línea láser (en la ventana de la trayectoria del haz del software de adquisición). </li><li> Optimice la excitación para que coincida con los parámetros de ganancia y compensación que se establecen al comienzo del experimento y se mantienen constantes durante toda la sesión. Para ajustar el offset, cambie el color de la imagen a los valores de intensidad (usando la tabla de búsqueda Q) y, mientras escanea con el láser apagado, gire la perilla de desplazamiento (offset inteligente) para que los píxeles de fondo tengan una intensidad ligeramente Mayor que cero. Con la misma tabla de consulta, encendiendo el láser durante la exploración, gire la perilla de ganancia (ganancia inteligente) para maximizar la relación señal-ruido, teniendo cuidado de evitar píxeles saturados. </li><li> Usando un agujero abierto (2 unidades aireadas), adquiera imágenes de 16 bits para proporcionar un rango dinámico suficiente para el cuantitativoE análisis. Evite promediar para aumentar la velocidad de adquisición y para minimizar el fotoblanqueo. </li><li> En la ventana de adquisición de software, seleccione un tamaño de campo de imagen de 512 x 64 píxeles (tamaño de píxel: 605 nm) en el menú desplegable. </li><li> Desde la ventana del modo de adquisición, seleccione xyt (lapso de tiempo en un solo plano xy) desde el menú desplegable y registre los cambios en el voltaje de la neurona espinal embrionaria mediante la adquisición de un solo plano xy, estableciendo los parámetros de adquisición para grabar una imagen cada 30 Ms durante 1 min. </li><li> Para evaluar el efecto de la administración de riluzol en la despolarización de la membrana en la misma neurona, adquirir un nuevo conjunto de datos 5 min después de la adición de agua de pescado que contiene 5 μ M riluzol. </li><li> Para el análisis FRET, utilice la macro ImageJ Biosensor_FRET (que expresa biosensores FRET de cadena sencilla. </li><li> Evaluar la relación de FRET de membrana basal de cada neurona en t 1 como ((FRET media - FRET fondo) / (Donante medio - Donante de fondo)), donde FRET y DonO intensidad media es la intensidad media de fluorescencia calculada en la misma región de interés (ROI) dibujada alrededor de la célula para cada canal adquirido y FRET y donante de fondo es la intensidad de fluorescencia media calculada en un ROI del campo de visión sin la muestra fluorescente. NOTA: Una descripción detallada paso a paso del uso del plugin se puede encontrar en el sitio web <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret</a> . </li><li> Utilice un software gráfico para comparar la frecuencia, amplitud y duración de la despolarización entre diferentes paradigmas experimentales. Comparar dos grupos usando un test t de Student no pareado y considerar los valores medios como estadísticamente diferentes cuando P &lt;0,05. </li></ol>

<ol><li>Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+voltage+indicators+for+large+scale+cortical+imaging+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age.</a> Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado aquí nos permitió explorar la asociación entre las propiedades eléctricas de las neuronas motoras espinales embrionarias del pez cebra y el comportamiento de bobinado espontáneo, la primera actividad motora estereotípica, que aparece alrededor de 17 hpf de desarrollo embrionario y dura hasta 24 hpf 10 . Nuestro enfoque proporciona a los investigadores una herramienta para estudiar el sistema neural de embriones intactos, preservando completamen...

El análisis in vivo del componente sistémico permite a los científicos investigar el comportamiento celular de la manera más confiable. Esto es particularmente cierto cuando la actividad bajo escrutinio está fuertemente influenciada por las interacciones célula-célula (tanto contacto como no contacto), como en el sistema nervioso, donde los cambios de voltaje de la membrana impulsan la comunicación entre las células excitables. La comprensión de la información codificada por estas señales eléctricas es la clave para entender la forma en que el sistema nervioso funciona tanto en estados fisiológicos como en estados de enfermedad. Con el fin de estudiar las propiedades eléctricas de las células en las condiciones fisiológicas más no invasivas, varios indicadores de voltaje genéticamente codificados se han desarrollado recientemente 1 . A diferencia de las generaciones anteriores de sensores de voltaje óptico (principalmente sensibles a la tensión) 2 , las GEVI permiten análisis in vivo del sistema neural intacto, ySu expresión puede limitarse a tipos o poblaciones de células específicas. El embrión de pez cebra es el &quot;sustrato&quot; in vivo de elección para aprovechar el gran potencial atribuido a los GEVI. De hecho, gracias a su claridad óptica y su sistema nervioso simplificado pero evolutivamente conservado, el modelo de pez cebra permite la identificación y manipulación directa de cada componente celular en una red. De hecho, el empleo de la GEVI basada en FRET Mermaid 3 condujo a la identificación de las alteraciones pre-sintomáticas en el comportamiento de la neurona motora espinal en un modelo de pez cebra de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) [ 4] . El siguiente protocolo in vivo describe cómo monitorear las propiedades eléctricas de las neuronas motoras espinales en embriones intactos de pez cebra que expresan Mermaid de una manera neuronal específica. Por otra parte, se demuestra cómo farmacológicamente inducida chanEstas propiedades eléctricas pueden asociarse con alteraciones en la frecuencia de las bobinas espontáneas embrionarias, la actividad motora estereotípica que caracteriza el comportamiento del movimiento del pez cebra en etapas muy tempranas de desarrollo.

<table><tbody><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Riluzole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R116</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra HQ ADN polimerasa&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - División de productos Stratagene</td><td>600389</td><td></td></tr><tr><td>T3 Imprimación universal&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel y sistema de limpieza PCR</td><td>Promega</td><td>A9280</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación universal SmaI&nbsp;</td><td>Sistema de vectores de expresión de mamíferos Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StrataClone / vector romo pCMV-SC&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - División de Productos Stratagene&nbsp;</td><td></td><td></td>240228</tr><tr><td>SmaI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>35 mm, plato de imágenes con fondo de vidrio&nbsp;</td><td>Pinza Ibidi</td><td>81151</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems</td><td>M10 F</td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC 310 FX</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 4.7.1 software&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuickTime Player, v10.4</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal (invertido)</td>Microinyector <td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ macro Biosensor_FRET&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma GraphPad 6.0c&nbsp;</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

potencial de membrana de la neurona motora de biosensing en los embriones vivos de pez cebra

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Los protocolos descritos aquí están diseñados para permitir a los investigadores estudiar la comunicación celular sin alterar la integridad del entorno en el que se encuentran las células. En concreto, se han desarrollado para analizar la actividad eléctrica de las células excitables, como las neuronas espinales. En tal escenario, es crucial preservar la integridad de la célula espinal, pero también es importante preservar la anatomía y la forma fisiológica de los sistemas involucrados. De hecho, la comprensión de la manera en que funciona el sistema nervioso -y otros sistemas complejos- debe basarse en un enfoque sistémico. Por esta razón, se eligió el embrión vivo de pez cebra como sistema modelo, y se evaluaron los cambios de voltaje de la membrana de la neurona espinal sin interferir con las condiciones fisiológicas de los embriones. 
Aquí, se describe un enfoque que combina el empleo de embriones de pez cebra con un biosensor basado en FRET. Los embriones de pez cebra se caracterizan por un sistema nervioso muy simplificado y son particularmente adecuados para aplicaciones de imagen gracias a su transparencia, lo que permite el empleo de indicadores de voltaje basados en fluorescencia en la membrana plasmática durante el desarrollo del pez cebra. La sinergia entre estos dos componentes permite analizar la actividad eléctrica de las células en organismos vivos intactos, sin perturbar el estado fisiológico. Por último, este enfoque no invasivo puede coexistir con otros análisis (por ejemplo, registros de movimientos espontáneos, como se muestra aquí).

Un vector de expresión que portaba la secuencia codificante de biosensor Mermaid basada en FRET bajo el control del promotor pan-neuronal pHuC, que impulsa la síntesis de la proteína exclusivamente en el sistema nervioso, se suministró en huevos fertilizados de una sola célula por medio de una microinyección en Con el fin de obtener embriones transgénicos transitorios ( Figura 1 , Panel izquierdo). Después de dominar la técnica de microinyección, el po...

Los protocolos descritos aquí permiten el estudio de las propiedades eléctricas de las células excitables en las condiciones fisiológicas más no invasivas mediante el empleo de embriones de pez cebra en un sistema in vivo junto con un indicador de voltaje genéticamente codificado (GEVI) basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) expresado selectivamente en el tipo de célula de interés.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las propiedades eléctricas de células excitables en condiciones fisiológicas no invasivas, empleando embriones de pez cebra junto con un indicador voltajemétrico basado en FRET. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología de las células excitables, como las neuronas. Por ejemplo, este método puede utilizarse para analizar el papel de la excitabilidad en la patogénesis de trastornos neurológicos.Este enfoque emplea embriones transparentes de pez cebra que expresan indicadores genéticamente codificados de voltaje basados en FRET. El enfoque permite la medición de las propiedades eléctricas de las células in vivo de manera no invasiva. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la excitabilidad de las neuronas espinales en embriones de pez cebra.También puede aplicarse a otros sistemas in vitro o in vivo susceptibles de estudios de imagen. Para comenzar este procedimiento, prepare la mezcla de PCR para amplificar la secuencia codificante del biosensor Mermaid. Caliente la mezcla de PCR durante 15 segundos a 95 grados Celsius.Prime durante 15 segundos a 50 grados Celsius y elongue duran

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

Las larvas de pez cebra representan el sistema de vertebrados primer modelo que permite la grabación simultánea de patch clamp de una neurona motora espinal y el objetivo del músculo esquelético. Este video muestra los métodos microscópicos para identificar un CaP segmentaria neurona motora y las células diana muscular, así como las metodologías para la grabación de cada tipo de célula.

Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

Este video describe técnicas optogenéticas mediante la activación de neuronas somatosensoriales modificadas genéticamente y el registro de la respuesta conductual provocada con una cámara de video de alta velocidad.

Optogenética del pez cebra: activación de neuronas somatosensoriales modificadas genéticamente para estudiar las respuestas conductuales de las larvas

Este video muestra un ensayo no invasivo para estudiar la electrofisiología de las neuronas motoras en embriones de pez cebra. Al medir el enrollamiento de la cola en los embriones como resultado de la despolarización espontánea de las neuronas motoras de la médula espinal, se aplica un bloqueador de los canales de sodio para reducir la frecuencia de enrollamiento. A continuación, los embriones se inmovilizan en agarosa y se colocan bajo un microscopio de fluorescencia. Las neuronas motoras...

Un enfoque no invasivo para estudiar la electrofisiología de las neuronas motoras en embriones de pez cebra

Este video muestra el registro de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra paralizada colocando una micropipeta cerca del ganglio de la línea lateral y formando un sello suelto para la captura de señales. La solución extracelular mantiene la viabilidad neuronal durante este proceso.

Monitoreo de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra inmovilizada

Los procesos de desarrollo tales como la proliferación, el patrón, la diferenciación, y guía de axones se pueden modelar fácilmente en la médula espinal pez cebra. En este artículo se describe un procedimiento de montaje para los embriones de pez cebra, que optimiza la visualización de estos eventos.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Describimos un protocolo para supervisar cambios en la actividad aferente de la neurona durante comandos del motor en un sistema de la célula de pelo vertebrado modelo.

Actividad De Las Neuronas Aferentes De La Línea Lateral Posterior Durante La Natación En El Pez Cebra

La unión neuromuscular de las larvas de pez cebra es un modelo atractivo para el estudio de la fisiología sináptica. Es susceptible de muchas técnicas experimentales, como la electrofisiología y las imágenes ópticas. Aquí, describimos un protocolo para la transmisión sináptica de imágenes utilizando una sonda basada en pHluorin bajo un microscopio de epifluorescencia vertical.

Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas

Aprende a medir el potencial de membrana en neuronas motoras de Danio rerio usando biosensores FRET no invasivos. Este método permite estudiar la excitabilidad neuronal en vivo y comprender trastornos neurológicos.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

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