Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las propiedades eléctricas de células excitables en condiciones fisiológicas no invasivas, empleando embriones de pez cebra junto con un indicador voltajemétrico basado en FRET. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología de las células excitables, como las neuronas. Por ejemplo, este método puede utilizarse para analizar el papel de la excitabilidad en la patogénesis de trastornos neurológicos.

Este enfoque emplea embriones transparentes de pez cebra que expresan indicadores genéticamente codificados de voltaje basados en FRET. El enfoque permite la medición de las propiedades eléctricas de las células in vivo de manera no invasiva. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la excitabilidad de las neuronas espinales en embriones de pez cebra.

También puede aplicarse a otros sistemas in vitro o in vivo susceptibles de estudios de imagen. Para comenzar este procedimiento, prepare la mezcla de PCR para amplificar la secuencia codificante del biosensor Mermaid. Caliente la mezcla de PCR durante 15 segundos a 95 grados Celsius.

Prime durante 15 segundos a 50 grados Celsius y elongue durante cuatro minutos a 72 grados Celsius durante un total de 35 ciclos. Después, purifique en gel el producto PCR romo específico utilizando un kit comercial de purificación en gel. Luego, clone el fragmento de ADN en el vector romo pCMV-SC y linealice el plásmido positivo para Mermaid con la enzima de restricción SmaI para la inserción del promotor HuC.

Prepare la reacción de restricción en un volumen total de 20 microlitros e incube la reacción a 25 grados Celsius durante una hora. Posteriormente, purifique por electroforesis en gel el plásmido digerido utilizando un kit comercial de purificación en gel. Luego, amplifique por PCR el promotor HuC con la ADN polimerasa PFU y el ADN genómico de pez cebra como molde.

Preparar la mezcla de PCR. Después de un paso inicial de dos minutos a 95 grados Celsius, calentar la mezcla de PCR durante 15 segundos a 95 grados Celsius. Entonces, cebarlo durante 15 segundos a 50 grados Celsius y alargarlo durante cuatro minutos a 72 grados Celsius, para un total de 35 ciclos.

Luego, purifique mediante gel el producto PCR específico con extremos romos. Una una cantidad equimolar del ADN pCMV-SC Mermaid purificado y del ADN pHuC utilizando un microlitro de ligasa T4 de ADN y un microlitro del tampón específico 10x en un volumen total de 10 microlitros. Posteriormente, incube la reacción durante 16 horas a cuatro grados Celsius.

Transforme un alícuota de células competentes con cinco microlitros de la reacción de ligación. Seleccione los clones positivos para pHuC con el promotor insertado en la orientación correcta mediante una doble digestión con CEL1-EcoRV. Transfiera los clones a tubos de 15 mililitros e incúbelos a 37 grados Celsius durante la noche.

Después, extraiga el plásmido de las células y prepare la reacción doble de restricción CEL1-EcoRV, incubando a 37 grados Celsius durante una hora. Luego, corra las reacciones en un gel de agarosa. En este procedimiento, transfiera los huevos fertilizados obtenidos de los peces cebra adultos tipo silvestre o sod1G93R a una placa de Petri de 10 milímetros.

Lave los embriones con agua fría para peces. A continuación, inyéctelos inmediatamente por microinyección en la yema con 200 picogramos del plásmido pHuC-Mermaid. Después, transfiera los embriones a una placa de Petri e incúbelos en agua para peces a 28 grados Celsius hasta que alcancen la etapa de desarrollo deseada para los siguientes análisis.

Para un análisis espontáneo de enrollamiento de la cola, transfiera los embriones a una placa de Petri redonda de 90 milímetros llena con agua para peces que contenga DMSO al 0,2 %. Y descorionicelos manualmente utilizando dos pinzas de joyero con puntas afiladas o agujas. Posteriormente, incube los embriones durante cinco minutos a 28 grados Celsius.

Utilizando una cámara digital montada en un estereomicroscopio, detecte el enrollamiento de la cola a temperatura ambiente durante una grabación de video de un minuto. A continuación, adquiera la serie temporal con una resolución temporal de 30 cuadros por segundo. Luego, calcule la frecuencia de los enrollamientos espontáneos de la cola contando el número de dobleces por unidad de tiempo.

Para evaluar el efecto del fármaco riluzol, transfiera los embriones a un nuevo plato de Petri de 90 milímetros lleno con agua para peces que contenga riluzol a cinco micromolares. Luego, incube los embriones durante cinco minutos a 28 grados Celsius antes de grabar un video de un minuto y realizar el análisis conductual. Ahora, monte los embriones de 20 a 24 hpf en agarosa al uno por ciento de punto de fusión bajo en agua para peces dentro de un plato de imagen de 35 milímetros con fondo de vidrio a 37 grados Celsius.

Oriente los embriones de lado y espere hasta que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente. A continuación, transfiera la placa de imágenes al portaobjetos de un microscopio confocal. Identifique las neuronas motoras que expresan el biosensor excitando Umikinoko-Green monomérico con un láser de argón de 488 nanómetros.

Luego, ajuste su emisión entre 495 y 525 nanómetros y presione grabar. Para una medición de FRET, excite mUKG, el donador del par FRET, con el láser de 488 nanómetros. Simultáneamente, utilizando dos fotomultiplicadores, detecte la fluorescencia emitida por el donador y la fluorescencia emitida por el aceptor monomérico Kusibira-Orange.

Al comienzo del experimento, optimice la ganancia y el desplazamiento del fotomultiplicador uno donde se registra la fluorescencia de mUKG y manténgalos constantes durante toda la sesión. Para ajustar el desplazamiento, cambie el color de la imagen a los valores de intensidad utilizando la tabla de consulta Q. Mientras escanea con el láser apagado, use el control deslizante de desplazamiento para que los píxeles de fondo tengan una intensidad ligeramente superior a cero.

Utilizando la misma tabla de búsqueda, encienda el láser. Durante el escaneo, use el control deslizante de ganancia para maximizar la relación señal-ruido, teniendo cuidado de evitar píxeles saturados. En la ventana de adquisición del software, seleccione el modo de adquisición xyt y un tamaño de campo de imagen de 512 por 64 píxeles en el menú desplegable.

Luego, configure la grabación de los cambios en el voltaje de las neuronas espinales del embrión para adquirir un único plano XY cada 30 milisegundos durante un minuto. Para evaluar el efecto de la administración de riluzol en la despolarización de la membrana en la misma neurona, adquiera un nuevo conjunto de datos cinco minutos después de la adición de agua de pez que contiene riluzol a cinco micromolares. En esta película se registraron enrollamientos espontáneos, respuestas motoras que consisten exclusivamente en una contracción del cuerpo completo que lleva la punta de la cola hacia la cabeza, en el estadio de 20 a 24 hpf en medio de pez normal.

Esta película muestra los enrollamientos espontáneos de un embrión tras la incubación en riluzol de cinco micromolares. Para comprobar si las alteraciones en la actividad eléctrica de las neuronas motoras espinales estaban en la base de los cambios inducidos por el riluzol en la frecuencia de enrollamiento espontáneo, se estudió el potencial de membrana en neuronas motoras espinales de embrión de forma completamente no invasiva mediante la medición de la relación de intensidad de fluorescencia del par donador-aceptor FRET del biosensor Mermaid. Se identificaron neuronas motoras espinales primarias que expresaban el biosensor y se registraron sus actividades espontáneas de despolarización basal.

Junto con la reducción en la frecuencia de los movimientos de enrollamiento de la cola, la administración de riluzol redujo la frecuencia de los eventos de despolarización espontánea. Una vez dominado, este enfoque permitirá a los investigadores estudiar las propiedades eléctricas de las redes neuronales de embriones intactos, preservando completamente la complejidad de las interacciones entre las células en el sistema funcional en desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo la actividad eléctrica de las neuronas espinales se correlaciona con la frecuencia de los enrollamientos espontáneos de la cola.