Name: Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende a medir el potencial de membrana en neuronas motoras de Danio rerio usando biosensores FRET no invasivos. Este método permite estudiar la excitabilidad neuronal en vivo y comprender trastornos neurológicos.

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Los autores quieren agradecer a Simona Rodighiero su inestimable apoyo con el análisis de imágenes FRET.

1. pHuC_Mermaid Plásmido Generación NOTA: Mermaid es un biosensor desarrollado mediante el acoplamiento del dominio de detección de voltaje (VSD) de la Ciona intestinalis (ahora Ciona robusta ) que contiene fosfatasa (Ci-VSP) con los fluoróforos del socio FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donante) y una versión monomérica de la proteína fluorescente emisora ​​de naranja Kusabira Orange (mKOk: acceptor). Para este biosensor, los cambios conformacionales del dominio VSD, inducidos por la despolarización de la membrana, aumentan la proximidad de las proteínas fluorescentes dadoras y aceptoras, aumentando así la transferencia de energía entre ellas (aumentando la relación FRET) 3 . El VSD asegura la localización eficiente del biosensor en la membrana plasmática. La expresión neuronal del biosensor (en la médula espinal, la señal es detectable tanto en interneuronas como en neuronas motoras) se logra clonando la sirena opEn marco de lectura (ORF) bajo el pez cebra pan-neuronal promotor HuC [ 6] . <ol><li> Se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el ORF Mermaid del plásmido 3 de la sirena pCS4 + con la polimerasa de ADN Pfu (corrección) utilizando el cebador T3 Universal y el cebador Mermaid Sma I (5&#39;TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) para insertar un sitio de restricción SmaI aguas arriba De la Sirena ORF. <ol><li> Utilizar la siguiente mezcla de PCR: 0,5 μl de DNA polimerasa Pfu, 7,5 μl del tampón 10x específico, 1 μl de dNTP 10 mM, 2,5 μl de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,5 μl (50 ng) de la preparación de plásmido y 1 Μl de soluciones madre de 20 μM de cada cebador en un volumen total de 50 μl. </li><li> Calentar la mezcla de PCR durante 15 s a 95 ° C, cebar durante 15 s a 50 ° C, y alargar durante 4 min a 72 ° C durante un total de 35 ciclos. </li></ol></li><li> Gel-purificar el concreto específicoPCR usando un kit comercial de purificación de gel, siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Clonar el fragmento de ADN en el vector blunt pCMV-SC siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Linearizar el plásmido positivo Mermaid (denominado pCMV-SC_Mermaid) con la enzima de restricción Sma I para la siguiente inserción del promotor HuC. <ol><li> Establecer la reacción de restricción de la siguiente manera: 0,5 μ l (10 U) de la enzima de restricción Sma I, 2 μ l del kit 10 x tampón, y 5 μ g de ADN plasmídico en un volumen total de 20 μ l. Incubar la reacción a 25 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Gel-purificar el plásmido digerido utilizando un kit comercial de purificación de gel siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> PCR-amplificar el promotor HuC (pHuC), con Pfu ADN polimerasa y zebrafish ADN genómico como plantilla, utilizando un par de HuC-primers específicos (HuCprom-forw1_SalI: 5&#39;-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA y HuCproM-rev1: 5&#39;-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) y abarcando una región de 3.150 pb aguas arriba del ATG. <ol><li> Se preparó la mezcla de PCR usando el siguiente esquema: 0,5 μl de DNA polimerasa Pfu, 7,5 μl del tampón 10x específico, 1 μl de dNTP 10 mM, 2,5 μl de DMSO, 200 ng de ADN genómico y 1 μl de 20 μM Stock de cada cebador en un volumen total de 50 μl. </li><li> Después de un paso inicial de 2 min a 95 ° C, calentar la mezcla de PCR durante 15 s a 95 ° C, cebar durante 15 s a 50 ° C, y alargarla durante 4 min a 72 ° C durante un total de 35 ciclos . </li></ol></li><li> Purificar con gel el producto de PCR blunt específico usando un kit comercial de purificación de gel siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Ligar una cantidad equimolar del pCMV-SC_Mermaid purificado (etapa 1.5) y del ADN de pHuC (etapa 1.7) usando 1 μl de T4 DNA ligasa y 1 μl del tampón 10X específico en un volumen total de 10 μl. Incubar la reacción durante 16 h a4ºC. </li><li> Transformar una alícuota de células competentes con 5 μl de la reacción de ligación (paso 1.8) siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Seleccionar los clones pHuC positivos (pHuC_Mermaid) con el promotor insertado en la orientación apropiada por una doble digestión Sal I- Eco RV (el sitio de restricción Sal I se ha insertado antes del fragmento promotor en la etapa 1.6, mientras que el sitio de restricción Eco RV Se sitúa aguas abajo de la región de poliadenilación, PolyA, del plásmido pCMV-SC). <ol><li> Establecer la reacción de restricción de la siguiente manera: 0,5 μ l (10 U) de ambos Sal I y Eco RV enzimas de restricción, 2 μ l del kit10X buffer, y 1 μ g de pHuC_Mermaid ADN en un volumen total de 20 μL. Incubar la reacción a 37 ° C durante 1 h. Ejecutar las reacciones sobre un gel de agarosa. </li></ol></li></ol> 2. Microinyección de embriones <ol><li> Transferir el fertilizado por ejemploGs obtenido de cebra salvaje de tipo salvaje (cepa AB) o Sod1-G93R adulto 4 a una placa de Petri de 10 mm usando una pipeta de plástico. </li><li> Enjuague los embriones en agua de pescado fría (4 ° C) e inmediatamente microinyúdalos en la yema con 200 μg de plásmido pHuC_Mermaid usando un microinyector (para una descripción general y detallada del procedimiento de microinyección, ver Referencias 7 y 8). </li><li> Utilizando una pipeta de plástico, transfiera los embriones a una placa de Petri y los incube en agua de pescado a 28 ° C hasta que alcancen la etapa de desarrollo deseada (20-24 h después de la fertilización, hpf) para los siguientes análisis. </li></ol> 3. Análisis espontáneo de la cola de cola NOTA: Evaluar el comportamiento espontáneo de enrollamiento de la cola en embriones de 20-24 hpf con o sin el riluzol del fármaco. <ol><li> Transferir un embrión a una placa de Petri redonda de 90 mm llena de agua de pescado que contenga 0,2% de DMSO (vehículo riluzol) y descomprímala manualmente usando twO pinzas de joyería con puntas afiladas. Incubar el embrión durante 5 min. </li><li> Detectar el enrollamiento de cola a RT durante una grabación de vídeo de 1 minuto usando una cámara digital montada en un estereomicroscopio. Adquiera series temporales con una resolución de 30 fotogramas por segundo. </li><li> Calcule la frecuencia de las bobinas espontáneas de la cola contando el número de curvas (tanto contralateral como ipsilateral) por unidad de tiempo. </li><li> Para evaluar el efecto del fármaco riluzol, utilice suavemente una pipeta Pasteur de plástico para transferir el embrión a una nueva placa de Petri de 90 mm llena de agua de pescado que contenga riluzol 5 μM. <ol><li> Incubar el embrión durante 5 minutos antes de grabar un video de 1 minuto y realizar el análisis de comportamiento como el anterior. </li></ol></li></ol> 4. Configuración de imágenes para la visualización de biosensores de sirena en embriones vivos: detección simultánea de señales de donantes y aceptoras <ol><li> Montar los embriones de 20 - 24 hpf en 1% de agarosa de bajo punto de fusión en agua de pescado al37 ° C dentro de un plato de imagen de fondo de vidrio de 35 mm. Oriente los embriones en sus lados. Espere hasta que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente. </li><li> Transferir el plato de imagen a la etapa de un confocal invertido montado en un microscopio invertido. Identificar las neuronas motrices que expresan el biosensor con un objetivo 20X (0.7 apertura numérica, NA) mediante la excitación de la mUKG con la línea de 488 nm de láser de argón y el registro de su emisión entre 495 y 525 nm. </li><li> Para una medición de FRET, excite mUKG, el donante del par FRET, con la línea láser de 488 nm. Detecta simultáneamente, con un escáner resonante que opera a 8.000 Hz en el modo bidireccional, la fluorescencia emitida por el donante (entre 495 y 525 nm) y la fluorescencia emitida por el receptor mKOk (entre 550 y 650 nm, canal FRET). Si está disponible, utilice el láser de 473 nm. NOTA: La eficiencia de excitación del donante se reducirá ligeramente (85% en lugar de 93% con 488 nm), pero la excitación cruzada del aceptor será(Del 17% con el 488 nm al 9% con línea láser de 473 nm). </li><li> Para reducir la fototoxicidad y el blanqueo con fluoróforos, minimice la iluminación de la muestra reduciendo la potencia de la línea láser (en la ventana de la trayectoria del haz del software de adquisición). </li><li> Optimice la excitación para que coincida con los parámetros de ganancia y compensación que se establecen al comienzo del experimento y se mantienen constantes durante toda la sesión. Para ajustar el offset, cambie el color de la imagen a los valores de intensidad (usando la tabla de búsqueda Q) y, mientras escanea con el láser apagado, gire la perilla de desplazamiento (offset inteligente) para que los píxeles de fondo tengan una intensidad ligeramente Mayor que cero. Con la misma tabla de consulta, encendiendo el láser durante la exploración, gire la perilla de ganancia (ganancia inteligente) para maximizar la relación señal-ruido, teniendo cuidado de evitar píxeles saturados. </li><li> Usando un agujero abierto (2 unidades aireadas), adquiera imágenes de 16 bits para proporcionar un rango dinámico suficiente para el cuantitativoE análisis. Evite promediar para aumentar la velocidad de adquisición y para minimizar el fotoblanqueo. </li><li> En la ventana de adquisición de software, seleccione un tamaño de campo de imagen de 512 x 64 píxeles (tamaño de píxel: 605 nm) en el menú desplegable. </li><li> Desde la ventana del modo de adquisición, seleccione xyt (lapso de tiempo en un solo plano xy) desde el menú desplegable y registre los cambios en el voltaje de la neurona espinal embrionaria mediante la adquisición de un solo plano xy, estableciendo los parámetros de adquisición para grabar una imagen cada 30 Ms durante 1 min. </li><li> Para evaluar el efecto de la administración de riluzol en la despolarización de la membrana en la misma neurona, adquirir un nuevo conjunto de datos 5 min después de la adición de agua de pescado que contiene 5 μ M riluzol. </li><li> Para el análisis FRET, utilice la macro ImageJ Biosensor_FRET (que expresa biosensores FRET de cadena sencilla. </li><li> Evaluar la relación de FRET de membrana basal de cada neurona en t 1 como ((FRET media - FRET fondo) / (Donante medio - Donante de fondo)), donde FRET y DonO intensidad media es la intensidad media de fluorescencia calculada en la misma región de interés (ROI) dibujada alrededor de la célula para cada canal adquirido y FRET y donante de fondo es la intensidad de fluorescencia media calculada en un ROI del campo de visión sin la muestra fluorescente. NOTA: Una descripción detallada paso a paso del uso del plugin se puede encontrar en el sitio web <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret</a> . </li><li> Utilice un software gráfico para comparar la frecuencia, amplitud y duración de la despolarización entre diferentes paradigmas experimentales. Comparar dos grupos usando un test t de Student no pareado y considerar los valores medios como estadísticamente diferentes cuando P &lt;0,05. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado aquí nos permitió explorar la asociación entre las propiedades eléctricas de las neuronas motoras espinales embrionarias del pez cebra y el comportamiento de bobinado espontáneo, la primera actividad motora estereotípica, que aparece alrededor de 17 hpf de desarrollo embrionario y dura hasta 24 hpf 10 . Nuestro enfoque proporciona a los investigadores una herramienta para estudiar el sistema neural de embriones intactos, preservando completamen...

El análisis in vivo del componente sistémico permite a los científicos investigar el comportamiento celular de la manera más confiable. Esto es particularmente cierto cuando la actividad bajo escrutinio está fuertemente influenciada por las interacciones célula-célula (tanto contacto como no contacto), como en el sistema nervioso, donde los cambios de voltaje de la membrana impulsan la comunicación entre las células excitables. La comprensión de la información codificada por estas señales eléctricas es la clave para entender la forma en que el sistema nervioso funciona tanto en estados fisiológicos como en estados de enfermedad. Con el fin de estudiar las propiedades eléctricas de las células en las condiciones fisiológicas más no invasivas, varios indicadores de voltaje genéticamente codificados se han desarrollado recientemente 1 . A diferencia de las generaciones anteriores de sensores de voltaje óptico (principalmente sensibles a la tensión) 2 , las GEVI permiten análisis in vivo del sistema neural intacto, ySu expresión puede limitarse a tipos o poblaciones de células específicas. El embrión de pez cebra es el &quot;sustrato&quot; in vivo de elección para aprovechar el gran potencial atribuido a los GEVI. De hecho, gracias a su claridad óptica y su sistema nervioso simplificado pero evolutivamente conservado, el modelo de pez cebra permite la identificación y manipulación directa de cada componente celular en una red. De hecho, el empleo de la GEVI basada en FRET Mermaid 3 condujo a la identificación de las alteraciones pre-sintomáticas en el comportamiento de la neurona motora espinal en un modelo de pez cebra de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) [ 4] . El siguiente protocolo in vivo describe cómo monitorear las propiedades eléctricas de las neuronas motoras espinales en embriones intactos de pez cebra que expresan Mermaid de una manera neuronal específica. Por otra parte, se demuestra cómo farmacológicamente inducida chanEstas propiedades eléctricas pueden asociarse con alteraciones en la frecuencia de las bobinas espontáneas embrionarias, la actividad motora estereotípica que caracteriza el comportamiento del movimiento del pez cebra en etapas muy tempranas de desarrollo.

<table><tbody><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Riluzole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R116</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra HQ ADN polimerasa&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - División de productos Stratagene</td><td>600389</td><td></td></tr><tr><td>T3 Imprimación universal&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel y sistema de limpieza PCR</td><td>Promega</td><td>A9280</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación universal SmaI&nbsp;</td><td>Sistema de vectores de expresión de mamíferos Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StrataClone / vector romo pCMV-SC&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - División de Productos Stratagene&nbsp;</td><td></td><td></td>240228</tr><tr><td>SmaI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>35 mm, plato de imágenes con fondo de vidrio&nbsp;</td><td>Pinza Ibidi</td><td>81151</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems</td><td>M10 F</td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC 310 FX</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 4.7.1 software&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuickTime Player, v10.4</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal (invertido)</td>Microinyector <td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ macro Biosensor_FRET&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma GraphPad 6.0c&nbsp;</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

potencial de membrana de la neurona motora de biosensing en los embriones vivos de pez cebra

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Los protocolos descritos aquí están diseñados para permitir a los investigadores estudiar la comunicación celular sin alterar la integridad del entorno en el que se encuentran las células. En concreto, se han desarrollado para analizar la actividad eléctrica de las células excitables, como las neuronas espinales. En tal escenario, es crucial preservar la integridad de la célula espinal, pero también es importante preservar la anatomía y la forma fisiológica de los sistemas involucrados. De hecho, la comprensión de la manera en que funciona el sistema nervioso -y otros sistemas complejos- debe basarse en un enfoque sistémico. Por esta razón, se eligió el embrión vivo de pez cebra como sistema modelo, y se evaluaron los cambios de voltaje de la membrana de la neurona espinal sin interferir con las condiciones fisiológicas de los embriones. 
Aquí, se describe un enfoque que combina el empleo de embriones de pez cebra con un biosensor basado en FRET. Los embriones de pez cebra se caracterizan por un sistema nervioso muy simplificado y son particularmente adecuados para aplicaciones de imagen gracias a su transparencia, lo que permite el empleo de indicadores de voltaje basados en fluorescencia en la membrana plasmática durante el desarrollo del pez cebra. La sinergia entre estos dos componentes permite analizar la actividad eléctrica de las células en organismos vivos intactos, sin perturbar el estado fisiológico. Por último, este enfoque no invasivo puede coexistir con otros análisis (por ejemplo, registros de movimientos espontáneos, como se muestra aquí).

Un vector de expresión que portaba la secuencia codificante de biosensor Mermaid basada en FRET bajo el control del promotor pan-neuronal pHuC, que impulsa la síntesis de la proteína exclusivamente en el sistema nervioso, se suministró en huevos fertilizados de una sola célula por medio de una microinyección en Con el fin de obtener embriones transgénicos transitorios ( Figura 1 , Panel izquierdo). Después de dominar la técnica de microinyección, el po...

Los protocolos descritos aquí permiten el estudio de las propiedades eléctricas de las células excitables en las condiciones fisiológicas más no invasivas mediante el empleo de embriones de pez cebra en un sistema in vivo junto con un indicador de voltaje genéticamente codificado (GEVI) basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) expresado selectivamente en el tipo de célula de interés.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las propiedades eléctricas de células excitables en condiciones fisiológicas no invasivas, empleando embriones de pez cebra junto con un indicador voltajemétrico basado en FRET. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología de las células excitables, como las neuronas. Por ejemplo, este método puede utilizarse para analizar el papel de la excitabilidad en la patogénesis de trastornos neurológicos.Este enfoque emplea embriones transparentes de pez cebra que expresan indicadores genéticamente codificados de voltaje basados en FRET. El enfoque permite la medición de las propiedades eléctricas de las células in vivo de manera no invasiva. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la excitabilidad de las neuronas espinales en embriones de pez cebra.También puede aplicarse a otros sistemas in vitro o in vivo susceptibles de estudios de imagen. Para comenzar este procedimiento, prepare la mezcla de PCR para amplificar la secuencia codificante del biosensor Mermaid. Caliente la mezcla de PCR durante 15 segundos a 95 grados Celsius.Prime durante 15 segundos a 50 grados Celsius y elongue durante cuatro minutos a 72 grados Celsius durante un total de 35 ciclos. Después, purifique en gel el producto PCR romo específico utilizando un kit comercial de purificación en gel. Luego, clone el fragmento de ADN en el vector romo pCMV-SC y linealice el plásmido positivo para Mermaid con la enzima de restricción SmaI para la inserción del promotor HuC.Prepare la reacción de restricción en un volumen total de 20 microlitros e incube la reacción a 25 grados Celsius durante una hora. Posteriormente, purifique por electroforesis en gel el plásmido digerido utilizando un kit comercial de purificación en gel. Luego, amplifique por PCR el promotor HuC con la ADN polimerasa PFU y el ADN genómico de pez cebra como molde.Preparar la mezcla de PCR. Después de un paso inicial de dos minutos a 95 grados Celsius, calentar la mezcla de PCR durante 15 segundos a 95 grados Celsius. Entonces, cebarlo durante 15 segundos a 50 grados Celsius y alargarlo durante cuatro minutos a 72 grados Celsius, para un total de 35 ciclos.Luego, purifique mediante gel el producto PCR específico con extremos romos. Una una cantidad equimolar del ADN pCMV-SC Mermaid purificado y del ADN pHuC utilizando un microlitro de ligasa T4 de ADN y un microlitro del tampón específico 10x en un volumen total de 10 microlitros. Posteriormente, incube la reacción durante 16 horas a cuatro grados Celsius.Transforme un alícuota de células competentes con cinco microlitros de la reacción de ligación. Seleccione los clones positivos para pHuC con el promotor insertado en la orientación correcta mediante una doble digestión con CEL1-EcoRV. Transfiera los clones a tubos de 15 mililitros e incúbelos a 37 grados Celsius durante la noche.Después, extraiga el plásmido de las células y prepare la reacción doble de restricción CEL1-EcoRV, incubando a 37 grados Celsius durante una hora. Luego, corra las reacciones en un gel de agarosa. En este procedimiento, transfiera los huevos fertilizados obtenidos de los peces cebra adultos tipo silvestre o sod1G93R a una placa de Petri de 10 milímetros.Lave los embriones con agua fría para peces. A continuación, inyéctelos inmediatamente por microinyección en la yema con 200 picogramos del plásmido pHuC-Mermaid. Después, transfiera los embriones a una placa de Petri e incúbelos en agua para peces a 28 grados Celsius hasta que alcancen la etapa de desarrollo deseada para los siguientes análisis.Para un análisis espontáneo de enrollamiento de la cola, transfiera los embriones a una placa de Petri redonda de 90 milímetros llena con agua para peces que contenga DMSO al 0,2 %. Y descorionicelos manualmente utilizando dos pinzas de joyero con puntas afiladas o agujas. Posteriormente, incube los embriones durante cinco minutos a 28 grados Celsius.Utilizando una cámara digital montada en un estereomicroscopio, detecte el enrollamiento de la cola a temperatura ambiente durante una grabación de video de un minuto. A continuación, adquiera la serie temporal con una resolución temporal de 30 cuadros por segundo. Luego, calcule la frecuencia de los enrollamientos espontáneos de la cola contando el número de dobleces por unidad de tiempo.Para evaluar el efecto del fármaco riluzol, transfiera los embriones a un nuevo plato de Petri de 90 milímetros lleno con agua para peces que contenga riluzol a cinco micromolares. Luego, incube los embriones durante cinco minutos a 28 grados Celsius antes de grabar un video de un minuto y realizar el análisis conductual. Ahora, monte los embriones de 20 a 24 hpf en agarosa al uno por ciento de punto de fusión bajo en agua para peces dentro de un plato de imagen de 35 milímetros con fondo de vidrio a 37 grados Celsius.Oriente los embriones de lado y espere hasta que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente. A continuación, transfiera la placa de imágenes al portaobjetos de un microscopio confocal. Identifique las neuronas motoras que expresan el biosensor excitando Umikinoko-Green monomérico con un láser de argón de 488 nanómetros.Luego, ajuste su emisión entre 495 y 525 nanómetros y presione grabar. Para una medición de FRET, excite mUKG, el donador del par FRET, con el láser de 488 nanómetros. Simultáneamente, utilizando dos fotomultiplicadores, detecte la fluorescencia emitida por el donador y la fluorescencia emitida por el aceptor monomérico Kusibira-Orange.Al comienzo del experimento, optimice la ganancia y el desplazamiento del fotomultiplicador uno donde se registra la fluorescencia de mUKG y manténgalos constantes durante toda la sesión. Para ajustar el desplazamiento, cambie el color de la imagen a los valores de intensidad utilizando la tabla de consulta Q. Mientras escanea con el láser apagado, use el control deslizante de desplazamiento para que los píxeles de fondo tengan una intensidad ligeramente superior a cero.Utilizando la misma tabla de búsqueda, encienda el láser. Durante el escaneo, use el control deslizante de ganancia para maximizar la relación señal-ruido, teniendo cuidado de evitar píxeles saturados. En la ventana de adquisición del software, seleccione el modo de adquisición xyt y un tamaño de campo de imagen de 512 por 64 píxeles en el menú desplegable.Luego, configure la grabación de los cambios en el voltaje de las neuronas espinales del embrión para adquirir un único plano XY cada 30 milisegundos durante un minuto. Para evaluar el efecto de la administración de riluzol en la despolarización de la membrana en la misma neurona, adquiera un nuevo conjunto de datos cinco minutos después de la adición de agua de pez que contiene riluzol a cinco micromolares. En esta película se registraron enrollamientos espontáneos, respuestas motoras que consisten exclusivamente en una contracción del cuerpo completo que lleva la punta de la cola hacia la cabeza, en el estadio de 20 a 24 hpf en medio de pez normal.Esta película muestra los enrollamientos espontáneos de un embrión tras la incubación en riluzol de cinco micromolares. Para comprobar si las alteraciones en la actividad eléctrica de las neuronas motoras espinales estaban en la base de los cambios inducidos por el riluzol en la frecuencia de enrollamiento espontáneo, se estudió el potencial de membrana en neuronas motoras espinales de embrión de forma completamente no invasiva mediante la medición de la relación de intensidad de fluorescencia del par donador-aceptor FRET del biosensor Mermaid. Se identificaron neuronas motoras espinales primarias que expresaban el biosensor y se registraron sus actividades espontáneas de despolarización basal.Junto con la reducción en la frecuencia de los movimientos de enrollamiento de la cola, la administración de riluzol redujo la frecuencia de los eventos de despolarización espontánea. Una vez dominado, este enfoque permitirá a los investigadores estudiar las propiedades eléctricas de las redes neuronales de embriones intactos, preservando completamente la complejidad de las interacciones entre las células en el sistema funcional en desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo la actividad eléctrica de las neuronas espinales se correlaciona con la frecuencia de los enrollamientos espontáneos de la cola.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

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Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

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