El uso de la biología sintética para Ingeniero células vivas que interactúan con materiales programables

El objetivo general de estos procedimientos es utilizar E. coli modificada sintéticamente para controlar y manipular superficies de materiales programables mediante la combinación de estrategias de modificación genética y funcionalización de superficies. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en campos como la medicina molecular y el monitoreo ambiental. Mediante el uso de células programadas genéticamente para interpretar un entorno local y modificar un material funcionalizado en consecuencia, estamos proporcionando una herramienta modular para una amplia variedad de aplicaciones.

La principal ventaja de esta técnica es que las células vivas son capaces de actuar como sensores dinámicos capaces de leer, procesar y registrar las condiciones a su alrededor a través de interfaces funcionalizadas. Después de preparar soluciones y recolectar el sobrenadante enriquecido con biotina de E. coli productora de biotina de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 1,4 microlitros de solución SPDP a 20 microlitros de estreptavidina o solución SA. Envuelva el tubo en papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante una hora y media para permitir que el reticulante SPDP se una a SA a través de un grupo amino, formando un SA activado por piridilditio. Después de la incubación, agregue 2,4 microlitros de solución de DTT al tubo e incube la muestra a temperatura ambiente durante una hora para permitir una escisión de piridina-2-tiona que resulte en un SA activado por sulfhidrilo. A continuación, agregue 7,5 microlitros de solución SCC a 72 microlitros de solución HRP, envuélvala en papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante una hora y media.

Esto da como resultado una HRP activada por maleimida unida a un grupo amino. Mezcle 17 microlitros de solución de biotina LC-LC con 200 microlitros de solución BSA, envuelva el tubo en papel de aluminio e incube la muestra a temperatura ambiente durante una hora y media. Este paso permite que la biotina se conjugue con BSA a través de un enlace amida.

Transfiera la solución SA-SPDP, el HRP-SMCC y la solución de biotina conjugada con BSA a concentradores centrífugos separados en tubos de centrifugación. Centrifugar el SA-SPDP a 10.000 veces g hasta que el volumen del tubo alcance los 100 microlitros o durante 16 minutos, luego llene el tubo de centrifugado a 500 microlitros usando PBS-EDTA antes de repetir el centrifugado y la adición de PBS-EDTA cinco veces más. Después de girar la solución a 100 microlitros, almacene el caldo a cuatro grados centígrados.

Para el HRP SMCC, centrifugar los tubos a 10.000 veces g hasta que el volumen alcance los 25 microlitros o durante 16 minutos. Llene el tubo de centrifugado a 4500 microlitros usando PBS antes de repetir el centrifugado y la adición de PBS cinco veces más. Después de girar la solución a 100 microlitros, almacene el caldo a cuatro grados centígrados.

Para la biotina BSA, centrifugar la muestra a 10.000 veces g hasta que el volumen alcance los 100 microlitros o durante 12 minutos, luego llene el tubo de centrifugado a 500 microlitros usando PBS. Después de repetir el centrifugado y la adición de PBS cuatro veces más, centrifugar el tubo hasta que el volumen alcance los 100 microlitros o durante 12 minutos, luego agregue 100 microlitros de PBS al tubo y almacene el caldo a cuatro grados centígrados. A continuación, combine 25 microlitros de la solución de 10 miligramos por mililitro HRP con 25 microlitros de solución SA de 10 miligramos por mililitro y almacene el tubo a cuatro grados Celsius durante la noche, luego prepare dos alícuotas de biotina BSA en PBS agregando 10 microlitros de stock de biotina BSA a 490 microlitros de PBS.

Pipetee 100 microlitros de la solución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Envuelva la placa en papel de aluminio e incube a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, agregue 200 microlitros de 05%Tween 80 y BPS a los pocillos.

Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos minutos, luego aspirar y decantar el líquido. Después de repetir el lavado tres veces, agregue 200 microlitros de la solución de carcasa al 0,5% a cada uno de los pocillos, luego incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora. Después de otra ronda de lavados como antes, mezcle 12 mililitros de solución de tripa al 05% con 7,5 microlitros de 05%Tween 80, luego use esta solución para diluir la solución madre SA-HRP de uno a 10, 000.

Pipetee 80 microlitros de SA-HRP diluido en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, luego agregue 20 microlitros de la muestra de biotina preparada a cada pocillo de la placa. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora. Este paso permite una unión competitiva entre la biotina libre y la biotina BSA inmovilizada para los sitios de unión de SA-HRP.

Luego, después de lavar la placa tres veces como antes, prepare una solución de 20 mililitros de acetato de sodio de 50 milimolares, 1% de TMB y 3% de peróxido de hidrógeno en una proporción de 1.000 a 10 a uno. Agregue 200 microlitros de la solución a cada pocillo del plato, envuélvalo en papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Pipetee 50 microlitros de ácido sulfúrico molar en cada pocillo para detener la reacción, luego use un lector de placas para medir el OD 450.

Después de la preparación de soluciones de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 7,5 microlitros de biotina LC-LC a 72 microlitros de HRP. Envuelva la solución en papel de aluminio e incube la muestra a temperatura ambiente durante una hora y media con agitación. Este paso hace que la biotina se conjugue a HRP a través de un enlace amida.

Transfiera la solución a un concentrador centrífugo dentro de un tubo de centrifugación y centrifugue la solución a 10.000 veces g hasta que el volumen alcance los 100 microlitros o durante 12 minutos, luego use PBS para llenar el tubo de centrifugación a 500 microlitros y repita la centrifugación y la adición de tampón cuatro veces. A continuación, agregue 100 microlitros de 0,17 microgramos por mililitro SA en PBS a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Envuelva la placa en papel de aluminio e incube a 37 grados centígrados durante una hora.

Para lavar los pocillos de la placa, pipetee 200 microlitros de 05%Tween 80 en cada pocillo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos minutos y decantar el líquido. Después de repetir el lavado tres veces más, agregue 200 microlitros de la solución de carcasa al 0,5% a los pocillos.

Incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora antes de lavar los pocillos tres veces como antes. Usando la solución de biotina HRP lavada y concentrada previamente preparada, diluya la solución madre de biotina HRP de uno a 10, 000, luego agregue 80 microlitros de la solución a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Agregue 20 microlitros de muestra de biotina preparada a cada pocillo de la placa e incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora para permitir una unión competitiva entre la biotina libre y la biotina HRP para los sitios de unión SA inmovilizados.

Después de lavar los pocillos tres veces como antes, prepare una solución de 20 mililitros de acetato de sodio de 50 milimolares, 1% de TMV y 3% de peróxido de hidrógeno en una proporción de 1.000 a 10 a uno. Agregue 200 microlitros de la solución a cada pocillo de la placa, cúbralo con papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego agregue 50 microlitros de ácido sulfúrico molar a cada pocillo para detener la reacción. Por último, utilice un lector de placas para medir el diámetro exterior 450.

Las células de tipo salvaje de E. coli MG1655 inducibles diseñadas se cultivaron y monitorearon en un medio mínimo, así como en un medio mínimo suplementado con DTB y/o IPTG. Estos gráficos muestran la lectura de OD 600 medida cada cinco minutos durante 24 horas. En este experimento, se utilizó la proteína fluorescente mCherry en lugar del gen bioB para poder medir el perfil de inducción cuando las células modificadas fueron inducidas con IPTG.

Estos resultados demuestran la eficacia de la red de genes inducibles. Aquí se representan las señales ópticas a OD 450 en respuesta a concentraciones variables de biotina para los esquemas de superficie funcionalizados indirectos y directos. En este experimento, se utilizaron productos de células de ingeniería inducida para modificar químicamente la superficie funcionalizada.

Las diferentes concentraciones de biotina se presentan medidas por la superficie funcionalizada del esquema de control indirecto para células de tipo salvaje, células no inducidas que contienen el plásmido pKE1-lacI-bioB y células inducidas que contienen el plásmido pKE1-lacI-bioB. Una vez dominadas, las células pueden ser modificadas genéticamente en dos días, mientras que las técnicas de funcionalización directa e indirecta de la superficie se pueden hacer en cinco horas si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar la contaminación del cultivo de células bacterianas y cubrir las superficies durante la funcionalización para evitar el fotoblanqueo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo funcionalizar superficies para los esquemas de control directo e indirecto. No olvide que trabajar con bromuro de etidio puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este procedimiento.