Identificación de proteínas vegetales de hielo de unión a través de la evaluación de la inhibición de hielo-recristalización y Aislamiento Uso de purificación de hielo-afinidad
5 de mayo de 2017
Este documento describe la identificación de proteínas de unión de hielo a partir de plantas tolerantes a la congelación a través de la evaluación de la actividad de inhibición de hielo-recristalización y posterior aislamiento de IBP nativas utilizando purificación hielo-afinidad.
El objetivo general de este protocolo es identificar nuevas proteínas de unión al hielo o IBP de las plantas mediante pruebas de actividad de unión al hielo y el aislamiento de péptidos nativos mediante la purificación por afinidad del hielo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la tolerancia a la congelación de las plantas, específicamente las proteínas que se unen al hielo. La principal ventaja de esta técnica es que permite aislar las proteínas que se unen al hielo de los extractos nativos sin el uso de complicados métodos de purificación.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que la configuración del aparato puede ser difícil de conceptualizar. Comience este protocolo con la configuración del aparato splat como se describe en el protocolo de texto. Para inducir la expresión de proteínas de unión al hielo, o IBP, en pastos tolerantes a las heladas u otras especies de plantas tolerantes a las heladas, aclimaten las plantas al frío durante un máximo de una semana a cuatro grados centígrados en condiciones de poca luz.
Obtenga aproximadamente 0,1 gramos de tejido foliar cortando en la base del tallo y luego colocándolo en un tubo de 1,5 mililitros. Congele inmediatamente la muestra en nitrógeno líquido y guárdela a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Para lisar las células, muela la muestra de tejido hasta convertirla en un polvo fino utilizando un mortero bajo nitrógeno líquido.
Asegúrese de que el nitrógeno líquido no se evapore durante el proceso de homogeneización. Coloque inmediatamente las muestras molidas sobre hielo y deje que el nitrógeno líquido se evapore por completo. A continuación, añada un mililitro de un tampón de extracción de proteínas nativas y pipetea para mezclar.
Agite suavemente las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados y realice los pasos restantes a la misma temperatura. Al día siguiente, elimine los restos celulares centrifugando las muestras a aproximadamente 1.600 veces G durante cinco minutos. Retenga la fracción soluble y centrifugue durante cinco minutos adicionales si persisten los desechos celulares.
Las muestras clarificadas se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados hasta su uso. Vierta 100 mililitros de hexano en la cámara externa configurada con la película polarizada y agregue de cinco a seis perlas de desecación para evitar la acumulación de humedad en los portaobjetos. A continuación, añada una pequeña cantidad de grasa al vacío a la placa que cubre el baño y gírela para asegurar un sellado hermético y evitar la evaporación del hexano.
40 minutos antes de comenzar el experimento, coloque el bloque de enfriamiento en una caja de poliestireno directamente debajo del tubo de plástico y cúbralo completamente con hielo seco. Antes de comenzar el ensayo, asegúrese de que el tubo esté nivelado. A continuación, retire el hielo seco de la parte superior del bloque frío.
Primero, pruebe este procedimiento con agua para determinar en qué parte del bloque de enfriamiento caerá la muestra. Sumerja la punta desechable adherida a una pipeta automática en aceite de inmersión, lo que permitirá que la muestra caiga en lugar de adherirse al exterior de la pipeta. Use una toalla de papel para eliminar el exceso de aceite.
A continuación, aspire 10 microlitros de agua. Coloque la pipeta directamente sobre el tubo de plástico antes de soltar el agua. Se debe escuchar un sonido distintivo cuando el agua golpea el bloque de enfriamiento, creando una monocapa de cristales de hielo.
A continuación, coloque un portaobjetos de vidrio de la cubierta del microscopio sobre la marca de gota que se ha determinado con agua. Inmediatamente antes de comenzar el ensayo, encienda la fuente de luz y raspe el hielo que se haya formado en el fondo de la cámara de vidrio. A continuación, realice el ensayo de salpicadura con la muestra, como se hace con el agua, liberando 10 microlitros de la muestra en el portaobjetos de la cubierta de vidrio para crear una monocapa de cristales de hielo.
Retire rápida y cuidadosamente el portaobjetos del microscopio del bloque frío con unas pinzas y colóquelo en el baño de hexano encima de la película polarizadora. Mirando bajo el microscopio, coloque el portaobjetos del microscopio en el campo de visión y ajuste la lente del objetivo para que la polarización cruzada permita la visualización de cristales de hielo de alto contraste. Conecte la cámara al microscopio y ajuste la configuración a macro para permitir una visualización clara de los cristales de hielo y capturar la imagen.
Repita estos pasos para todas las muestras. Por lo general, coloque hasta seis portaobjetos con una muestra diferente en la cámara de hexano. Una vez terminado, apague la fuente de luz.
A continuación, coloque una placa de plástico sobre el baño de hexano, asegurando un sellado hermético, y deje que los cristales de hielo se recocen durante la noche. Después de la incubación, capture imágenes de las películas de hielo como antes. Después de aclimatar el tejido vegetal en frío como antes, recoja aproximadamente de 100 a 150 gramos de biomasa molida en tubos de 20 mililitros.
Congele inmediatamente las muestras y manténgalas a menos 80 grados centígrados antes de usarlas. Prepare la muestra como antes, utilizando una proporción de uno a uno para la resuspensión del tejido de la hoja. Utilice comprimidos inhibidores de proteasas adicionales para evitar la degradación de las IBP por las proteasas endógenas.
Para eliminar los restos celulares, tamice el lisado a través de dos capas de gasa tres veces. Granular los residuos por centrifugación a 30.000 veces G durante 40 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, aumente el volumen de la muestra a 120 mililitros utilizando un tampón de extracción de proteínas nativo y utilice la lisa inmediatamente para la purificación por afinidad del hielo y evitar cualquier pérdida de actividad de unión al hielo.
Después de enfriar el dedo de hielo a menos 0,5 grados centígrados, sumérjalo en un tubo de 50 mililitros que contenga agua destilada fría. Agregue algunos trozos de hielo para facilitar la nucleación del hielo y permitir que se forme una fina capa de hielo en el dedo. Este proceso suele tardar entre 20 y 30 minutos.
Coloque la muestra en un vaso de vidrio de 150 mililitros que contenga una pequeña barra agitadora magnética, que se coloca en un recipiente de poliestireno encima del agitador magnético. Asegúrese de que el dedo de hielo esté centrado y bajado al menos hasta la mitad de la muestra líquida. A continuación, selle el recipiente.
Deje que el programa se ejecute durante aproximadamente dos días, comprobando cada 24 horas. Una vez que el 50% de la muestra esté congelada, detenga el programa. La incorporación de IBPs en el hemisferio de hielo dará lugar a la extracción de hielo.
Para eliminar el hemisferio de hielo, caliente la sonda a cuatro grados centígrados. Luego enjuague el hemisferio con agua destilada para eliminar la proteína no unida y descongele a cuatro grados centígrados. Si el hemisferio de hielo todavía contiene pigmento, o para aumentar la purificación de la muestra, repita los pasos de purificación dos o tres veces.
Aquí se muestran extractos recolectados de un control tampón que carece de IBP y extractos de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre que no contienen IBP. Después de 18 horas, el control tampón y los extractos de A. thaliana no pueden restringir el crecimiento de cristales de hielo. En contraste, los pequeños cristales de hielo observados con extractos de A. thaliana transgénica que expresan IBP de Lolium perenne aclimatado al frío restringen sustancialmente el crecimiento de los cristales de hielo.
Después de la primera ronda de purificación, el alto grado de grabado de hielo en la superficie del hemisferio indica que los IBP se han adsorbido al hielo y han modificado el crecimiento de los cristales de hielo. Para eliminar solutos, pigmentos y proteínas contaminantes adicionales, se utilizó una segunda ronda de afinidad por el hielo, lo que dio como resultado un hemisferio de hielo más claro. Siguiendo este procedimiento, la formación del hielo y la histéresis térmica se pueden evaluar utilizando un osmómetro de nanolitros para caracterizar aún más las proteínas de unión al hielo.
Además, las fracciones aisladas se pueden enviar para espectrometría de masas con el fin de identificar las secuencias peptídicas.
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Descripción general
Este artículo describe la identificación de proteínas de unión al hielo procedentes de plantas tolerantes a la congelación mediante la evaluación de la actividad de inhibición de la recristalización del hielo y el posterior aislamiento de IBPs nativas utilizando la purificación por afinidad al hielo. El método permite el aislamiento de estas proteínas a partir de extractos nativos sin necesidad de métodos de purificación complicados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vegetal
- Mecanismos de tolerancia a la congelación
- Técnicas de purificación de proteínas
Antecedentes
- Las proteínas de unión al hielo (IBPs) desempeñan un papel crucial en la tolerancia al congelamiento en plantas.
- Comprender las IBPs puede ayudar a mejorar la resiliencia de los cultivos frente al estrés por frío.
- Los métodos tradicionales de purificación pueden ser complejos e ineficientes.
- Este estudio presenta un enfoque simplificado para aislar IBPs.
Objetivo del estudio
- Identificar nuevas proteínas ligantes de hielo procedentes de plantas tolerantes a la congelación.
- Evaluar la actividad ligante de hielo mediante la inhibición de la recristalización del hielo.
- Mostrar un método para aislar péptidos nativos utilizando purificación por afinidad al hielo.
Métodos Utilizados
- Adaptación al frío de las plantas a bajas temperaturas.
- Evaluación de la actividad de unión al hielo mediante ensayos específicos.
- Aislamiento de las proteínas de unión al hielo utilizando técnicas de purificación por afinidad al hielo.
- Demuestras visuales para facilitar la comprensión del montaje del aparato.
Resultados principales
- Identificación exitosa de proteínas ligadoras de hielo a partir de extractos vegetales nativos.
- Demostración de la inhibición efectiva de la recristalización del hielo mediante IBPs aisladas.
- Validación del método de purificación por afinidad al hielo como una técnica confiable.
- Conocimientos sobre el papel de las IBPs en el aumento de la tolerancia al congelamiento en plantas.
Conclusiones
- El estudio proporciona un método novedoso para aislar IBPs de plantas tolerantes a la congelación.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de las respuestas de las plantas a condiciones de congelación.
- La investigación futura puede basarse en estos métodos para explorar IBPs en otras especies.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación y aislamiento rápidos de proteínas vegetales de unión al hielo (IBPs) mediante ensayos de inhibición de la recristalización del hielo (IRI) y purificación por afinidad al hielo permite reducir los riesgos mecanicistas en las vías de tolerancia a la congelación en la biotecnología agrícola. Este flujo de trabajo respalda la confianza predictiva en la validación de dianas para rasgos de resistencia al estrés y facilita la selección de carteras en programas de mejora de cultivos. El enfoque proporciona un punto de entrada escalable para el descubrimiento funcional de proteínas sin necesidad de conocimientos bioquímicos previos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de los mecanismos de tolerancia a la congelación mediante la selección funcional de extractos vegetales nativos.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante el aislamiento de IBP activas basado en sus propiedades de unión al hielo.
- Facilita la confianza predictiva en la selección de proteínas candidatas para validación posterior.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un ensayo de impresión estandarizado para la evaluación rápida y cuantitativa de la actividad de IRI en extractos vegetales.
- Ofrece resultados reproducibles e interpretables para el cribado paralelo de múltiples muestras.
- Prepara fracciones proteicas validadas para análisis bioquímicos o estructurales posteriores.
Investigación Translacional y Preclínica
- Se alinea con el descubrimiento traslacional de biomarcadores al permitir la identificación mediante espectrometría de masas de secuencias peptídicas de IBP.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica de rasgos de resistencia al estrés en plantas.
- Reduce el riesgo al avanzar en el desarrollo de IBP candidatos para aplicaciones agrícolas o industriales.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de candidatos, permitiendo la selección funcional, aislamiento y caracterización de PBIs a partir de tejidos vegetales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la tolerancia a la congelación mediante la medición directa de la actividad de inhibición del crecimiento de cristales de hielo (IRI) en extractos nativos.
- Selección: Proporciona resultados listos para ensayos y reproducibles para análisis comparativos entre líneas vegetales o tratamientos.
- Análisis: Ofrece lecturas cuantitativas y permite espectrometría de masas posterior para la identificación de secuencias.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al suministrar proteínas antipépticas purificadas (IBPs) para estudios funcionales adicionales.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para la identificación de IBPs en diversas especies vegetales y condiciones de estrés.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos de tolerancia a la congelación y reduce la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Optimiza el aislamiento de proteínas mediante protocolos estandarizados, escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o descarte para candidatos de PBI y potencia la eficiencia del capital en el descubrimiento de rasgos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos de resistencia al estrés en las líneas de biotecnología agrícola.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos vegetales, extracción de proteínas y ensayos basados en microscopía.
- Necesita acceso a instalaciones de aclimatación al frío, centrifugación y equipo para purificación por afinidad al hielo.
- Exige la estandarización entre equipos de las condiciones del ensayo y la interpretación de los datos.
- Adaptable a diversas especies vegetales tolerantes a la congelación mediante la optimización del protocolo.
- Depende del mantenimiento de la actividad proteica y de la minimización de la degradación proteolítica durante la extracción y purificación.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Title
9:15
Conclusion
8:14
Results: Ice-hemispheres Grown Using IBP Extracts Collected from the Freeze-tolerant Grass, L. perenne
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Preparation of Native Protein Extracts for Ice-recrystalization Inhibition (IRI) Analysis
2:30
Splat Assay Pre-experiment Set Up and Conducting the Splat Assay
5:32
Preparation of Samples for Ice-affinity Purification
6:36
Conducting Ice-affinity Purification
