Métodos de estudio de la función de proteínas de transporte epitelial y expresión en nativo Intestino y Caco-2 células cultivadas en 3D

El objetivo general de este protocolo es cultivar células intestinales Caco-2 en tres dimensiones y demostrar el uso de la cámara de Ussing en estudios sobre la regulación del transportador de serotonina. Los métodos mostrados aquí pueden responder preguntas clave en el campo del transporte epitelial, como la forma en que se regula el transportador intestinal de serotonina, SERT. La principal ventaja de las Caco-2 en 3D es que reflejan las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular de manera más precisa que las monocapas.

Y la técnica de la cámara de Ussing permite mediciones precisas de la función de transporte en el epitelio intestinal. La implicación de los cultivos Caco en 3D se extiende hacia el descubrimiento de terapéuticas, ya que estos modelos posibilitan la selección de agentes contra enfermedades asociadas con una función de transporte alterada. Aunque este método proporciona información sobre la regulación del transportador de serotonina, también puede aplicarse a estudios de otros transportadores de electrolitos, como los de sodio y cloruro.

La demostración visual de estas técnicas es fundamental, ya que retirar la capa seromuscular y montar la mucosa intestinal en cámaras de Ussing son procedimientos difíciles de aprender. Las demostraciones de los procedimientos con células Caco-2 en 3D estarán a cargo de Ishita Chatterjee, instructora, y Anoop Kumar, investigador posdoctoral de nuestro grupo. La demostración del procedimiento para retirar la capa seromuscular del íleon de ratón estará a cargo de Sangeeta Tyagi, especialista sénior en investigación de mi laboratorio.

También demostrarán el montaje de la mucosa desprovista e insertarlas en cámaras de Ussing Shubha Priyamvada y Arivarasu Natarajan, instructores de mi laboratorio. Para comenzar, descongele la solución proteica gelatinosa con factores de crecimiento reducidos durante la noche sobre hielo en un refrigerador a cuatro grados Celsius. Una vez descongelada, prepare alícuotas de un mililitro o 500 microlitros.

El día del cultivo, enfríe previamente las placas con cámaras sobre hielo. Luego, agregue 30 microlitros de la solución proteica gelatinosa a cada pocillo de la placa de vidrio con ocho pocillos y extiéndala uniformemente. Al sembrar la mezcla gelatinosa en la placa con cámaras o placas, debe tenerse cuidado de evitar la formación de burbujas, ya que las células podrían desprenderse.

Coloque el plato de cultivo dentro de un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius durante 15 a 30 minutos para permitir que la solución se solidifique. A continuación, utilizando tripsina, desprenda las células Caco-2 confluentes de un frasco de cultivo. Luego, cuente las células en un hemocitómetro y centrifúgelas a 500 veces g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

Re-suspenda el pellet celular resultante en medio 3D Caco-2 para obtener la suspensión con la densidad deseada. Utilizando la suspensión celular preparada, siembre 4.000 células por pocillo en placas portaobjeto con cámaras de vidrio y permita que crezcan durante 12 a 14 días en un incubador húmedo con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. Para teñir las células, primero aspire el medio y fije las células con 400 microlitros de PFA al 2%.

Continúe fijando las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las células dos veces en PBS, permeabilícelas con una solución de Triton al 0,5 % en PBS durante no más de 15 minutos. Enjuague las células dos veces en tampón de glicina en PBS y luego lave las células permeabilizadas en tampón IF durante diez minutos a temperatura ambiente.

Bloquee las células usando suero de cabra normal al 5 % en tampón IF. A continuación, incube las células con 200 microlitros de anticuerpo primario diluido en tampón IF suplementado con suero de cabra al 1 % durante una a dos horas a temperatura ambiente. Tras la incubación, lave las células tres veces con tampón IF.

Incube las células lavadas con 200 microlitros de anticuerpo secundario diluido en tampón IF suplementado con 1% de suero de cabra durante una hora a temperatura ambiente. Lave las células con tampón IF tres veces durante diez minutos cada vez. Para separar la cámara del portaobjetos de vidrio, coloque primero el portaobjetos en el soporte base para portaobjetos y luego deslice el elevador blanco a través del soporte hasta que toque el borde de los pozos.

Retire suavemente la cámara para retirarla del portaobjetos. Utilice una caja negra cubierta para proteger los portaobjetos de la luz. Monte los portaobjetos con medio antifade lento y cúbralos con cubreobjetos.

Después de dejar secar las laminillas durante diez minutos a temperatura ambiente, séllelas con esmalte de uñas antes de la obtención de imágenes. Aísle el íleon de ratón siguiendo el procedimiento descrito en el protocolo escrito. Luego, utilizando tijeras, abra el intestino longitudinalmente.

Incubar la sección de tejido resultante en tampón KBR gaseado y frío (a temperatura de hielo) que contenga un micromolar de indometacina durante diez minutos. Fijar una sección intestinal de aproximadamente un centímetro de longitud, con la cara mucosa hacia abajo, a una placa que contenga agarosa al 7% de un grosor de 0,5 centímetros o elastómero de silicona curado. Utilizando un estereomicroscopio de disección con iluminación inferior, separar las capas seromusculares.

Luego, corte la capa seromuscular con una hoja de bisturí tipo pluma. Utilice pinzas finas para levantar el borde de la capa a lo largo del eje longitudinal del intestino. Finalmente, monte cuidadosamente la mucosa sobre las agujas del portaobjetos.

Sujete el tejido mucoso desprovisto por los bordes para evitar rasgarlo. Al montar la mucosa ileal desprovista en los pasadores del portaobjetos, se deben tomar precauciones para evitar romper el tejido en las cabezas de los pasadores y para minimizar el daño en los bordes del tejido. Antes del tratamiento del tejido, prepare una solución de Krebs aireada con 95% oxígeno, 5% dióxido de carbono.

Luego, vierta la solución en una cámara de Ussing. Añada 10 micromoles de glucosa como sustrato energético al baño seroso y 10 micromoles de manitol para mantener el equilibrio osmótico al baño mucoso. Posteriormente, inserte el deslizador con la mucosa montada dentro de la cámara para exponer tanto la cara apical como la basolateral del tejido a la solución de Krebs.

Equilibrar el tejido ileal en el baño durante diez minutos. A continuación, pretender el lado apical con fluoxetina 10 micromolar durante 30 minutos para la medición del flujo de mucosa a serosa. Finalmente, tratar el lado basolateral del tejido con TGF beta 1 a 10 nanogramos por mililitro durante una hora, y luego incubar el lado apical con 5-HT tritiado a 20 nanomolar durante 30 minutos.

Para calcular las tasas de flujo de mucosa a serosa, recolecte alícuotas de 0,75 mililitros del reservorio seroso, reemplazándolas con volúmenes idénticos del medio de baño para evitar diferencias de presión hidrostática a través de la mucosa. Para cuantificar la 5-HT marcada con tritio acumulada en el tejido, retire la mucosa del portaobjetos. Lávela una vez con tampón KRB frío y colóquela en un tubo de cultivo de vidrio.

Incube la mucosa en 0,5 mililitros de KOH al 10 % durante toda la noche a 37 grados Celsius para lisar el tejido. Luego, mida la radioactividad en alícuotas de 150 microlitros de los lisados por triplicado utilizando un contador de centelleo líquido. Mediante el método de Bradford, determine la concentración de proteína en alícuotas de tres a cinco microlitros de los lisados.

Se muestran aquí quistes de Caco-2 cultivados en cultivo 3D teñidos para actina y quistes 3D de Caco-2 teñidos simultáneamente para actina, núcleos y la proteína SERT. SERT es visible en la membrana luminal y en compartimentos subapicales. Para confirmar aún más la ventaja de las esferas 3D de Caco-2 frente a las monocapas 2D de Caco-2, se realizó un análisis por inmunotransferencia de la expresión de la proteína SERT.

Los resultados mostraron una expresión aumentada de la proteína SERT en esferas tridimensionales de Caco-2 en comparación con células Caco-2 en cultivo bidimensional. Finalmente, se utilizó un sistema de cámara de Ussing para demostrar que el TGF beta incrementa el flujo de mucosa a serosa, lo que refleja una mayor captación de 5-HT desde la membrana luminal y una acumulación aumentada de 5-HT observada en la mucosa ileal. Estos hallazgos se respaldan por la sensibilidad observada de la captación de 5-HT al tratamiento con fluoxetina, lo cual corresponde a la expresión de SERT en la membrana luminal.

Una vez dominada, esta técnica de disección y montaje de la mucosa ileal puede completarse en 15 minutos. Al adoptar este procedimiento, es importante recordar que, tras su extracción del animal, el preparado intestinal extra vivo tiene una viabilidad limitada y puede durar hasta tres horas. Los quistes tridimensionales de Caco-2 podrían utilizarse en diversos estudios, como eventos de tráfico de membranas, expresión génica o interacciones proteína-proteína de transportadores epiteliales.

Después de su desarrollo, la técnica 3D de Caco-2 allana el camino para que los investigadores en el campo del transporte intestinal exploren el movimiento de fluidos y estudien la fisiopatología de enfermedades intestinales. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de EPP y procedimientos adecuados de descontaminación. Después de ver este video, usted será capaz de cultivar células Caco-2 en cultivos 3D y utilizar estos cultivos para investigar la expresión de transportadores epiteliales.

También podrá utilizar la cámara de Ussing para estudiar la función del transporte de serotonina en el intestino nativo del ratón.