Métodos de estudio de la función de proteínas de transporte epitelial y expresión en nativo Intestino y Caco-2 células cultivadas en 3D

El objetivo general de este protocolo es cultivar células intestinales Caco-2 en tres dimensiones y demostrar el uso de la cámara de Ussing en estudios sobre la regulación del transportador de serotonina. Los métodos mostrados aquí pueden responder a preguntas clave en el campo del transporte epitelial, como la forma en que se regula el transportador intestinal de serotonina, SERT. La principal ventaja de los Caco-2 3D es que reflejan las interacciones célula a célula y célula a matriz extracelular con mayor precisión que las monocapas.

Y la técnica de la cámara de Ussing permite mediciones precisas de la función de transporte en el epitelio intestinal. La implicación del 3D, los cultivos de Caco, se extiende hacia el descubrimiento de terapias porque estos modelos permiten el cribado de agentes contra enfermedades asociadas con la función de transporte alterada. Aunque este método proporciona información sobre la regulación del transportador de serotonina, también se puede aplicar a estudios de otros transportadores de electrolitos como el sodio y el cloruro.

La demostración visual de estas técnicas es fundamental, ya que la extracción de la capa seromuscular y el montaje de la mucosa intestinal en cámaras de Ussing son difíciles de aprender. La demostración de los procedimientos de la célula Caco-2 en 3D estará a cargo de Ishita Chatterjee, instructor, y Anoop Kumar, becario postdoctoral de nuestro grupo. La demostración de la extracción de la capa seromuscular del íleon de ratón estará a cargo de Sangeeta Tyagi, especialista en investigación sénior de mi laboratorio.

También demostrarán el montaje de mucosas extraídas e insertarlas en cámaras de Ussing Shubha Priyamvada y Arivarasu Natarajan, instructores de mi laboratorio. Para comenzar, descongele la solución de proteína gelatinosa reducida en factor de crecimiento durante la noche en hielo en un refrigerador de cuatro grados centígrados. Una vez descongelado, prepare un mililitro o 500 alícuotas de microlitro.

El día de la cultura, enfríe previamente los toboganes con cámara sobre hielo. Luego, agregue 30 microlitros de la solución de proteína gelatinosa a cada pocillo del portaobjetos de vidrio de ocho pocillos y extiéndalo uniformemente. Al colocar la mezcla gelatinosa en el portaobjetos o placas de la cámara, se debe tener cuidado para evitar la formación de burbujas, ya que las células pueden desprenderse.

Coloque la placa cultivada dentro de una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius durante 15 a 30 minutos para permitir que la solución se solidifique. A continuación, utilizando tripsina, separe las células confluentes de Caco-2 de un matraz de cultivo. Luego, cuente las células en un hemocitómetro y centrifuérrelas a 500 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Vuelva a suspender el pellet de celda resultante en medio 3D Caco-2 para obtener la suspensión de la densidad deseada. Usando la suspensión celular preparada, siembre 4.000 células por pocillo en los portaobjetos de la cámara de vidrio y déjelas crecer durante 12 a 14 días en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius. Para teñir las células, primero aspire el medio y fije las células con 400 microlitros de PFA al 2%.

Continúe fijando las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las células dos veces en PBS, permeabilícelas con una solución de Triton al 0,5% en PBS durante no más de 15 minutos. Enjuague las células dos veces en tampón de glicina PBS y luego lave las células permeabilizadas en tampón IF durante diez minutos a temperatura ambiente.

Bloquee las células usando suero de cabra normal al 5% en tampón IF. A continuación, incubar las células con 200 microlitros de anticuerpo primario diluido en tampón de FI suplementado con suero de cabra al 1% durante una o dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave las células tres veces con tampón IF.

Incubar las células lavadas con 200 microlitros de anticuerpo secundario diluido en tampón de FI suplementado con suero de cabra al 1% durante una hora a temperatura ambiente. Lave las células con tampón de FI tres veces durante diez minutos. Para separar la cámara del portaobjetos de vidrio, primero coloque el portaobjetos en el soporte de la base del portaobjetos, luego deslice el elevador blanco a través del soporte hasta que entre en contacto con el borde de los pocillos.

Tire suavemente de la cámara para sacarla de la corredera. Use una caja negra cubierta para proteger las diapositivas de la luz. Monte las correderas con medio anti-decoloración lento y cúbralas con cubreobjetos.

Después de dejar que los portaobjetos se sequen durante diez minutos a temperatura ambiente, séllelos con esmalte de uñas antes de tomar imágenes. Aísle el íleon de ratón siguiendo el procedimiento descrito en el protocolo de texto. Luego, con unas tijeras, abra el intestino longitudinalmente.

Incubar la sección de tejido resultante en un tampón KBR gaseado helado que contenga un micromolar de indometacina durante diez minutos. Sujete con alfileres una sección intestinal de aproximadamente un centímetro de largo, con el lado de la mucosa hacia abajo, a una placa que contenga 0,5 centímetros de grosor 7% de agarosa o elastómero de silicona curada. Usando un microscopio estereoscópico de disección con iluminación inferior, extraiga las capas seromusculares.

Luego, corte la capa seromuscular con una hoja de bisturí de plumas. Use pinzas finas para levantar el borde de la capa a lo largo del eje longitudinal del intestino. Finalmente, monte la mucosa con cuidado en los pines del deslizador.

Sostenga el tejido mucoso despojado por los bordes para evitar desgarros. Al montar la mucosa ilial despojada en los clavos del deslizador, se deben tomar precauciones para evitar desgarrar el tejido en las cabezas de los alfileres y minimizar el daño a los bordes del tejido. Antes del tratamiento de tejidos, prepare la solución de Krebs gaseada con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono.

Luego, vierta la solución en una cámara de uso. Añadir 10 micromolares de glucosa como sustrato energético al baño seroso y 10 micromolares de manitol para mantener el equilibrio osmótico al baño de mucosa. Posteriormente, inserte el deslizador con la mucosa montada en la cámara para exponer tanto el lado apical como el basolateral del tejido a la solución de Krebs.

Equilibre el tejido ileal en el baño durante diez minutos. A continuación, pretrate el lado apical con fluoxetina 10 micromolares durante 30 minutos para medir el flujo de la mucosa al seroso. En última instancia, trate el lado basolateral del tejido con 10 nanogramos por mililitro de TGF beta 1 durante una hora y luego incube el lado apical con 5-HT tritiado de 20 nanomolares durante 30 minutos.

Para calcular las tasas de flujo de la mucosa a la serosa, recoja alícuotas de 0,75 mililitros del depósito de seroso, reemplazándolas con volúmenes idénticos del medio de baño para evitar diferencias de presión hidrostática a través de la mucosa. Para cuantificar el 5-HT tritiado acumulado en el tejido, retire la mucosa del deslizador. Lávelo una vez con tampón KRB helado y colóquelo en un tubo de cultivo de vidrio.

Incubar la mucosa en 0,5 mililitros de 10%KOH durante la noche a 37 grados centígrados para lisar el tejido. A continuación, mida la radiactividad en alícuotas de 150 microlitros de los lisados por triplicado utilizando un contador de centelleo líquido. Usando el método de Bradford, mida la concentración de proteína en alícuotas de tres a cinco microlitros de los lisados.

Aquí se muestran quistes de Caco-2 cultivados en cultivo 3D teñidos para actina y quistes 3D de Caco-2 teñidos simultáneamente para actina, núcleos y proteína SERT. La SERT es visible en la membrana luminal y en los compartimentos subapicales. Para confirmar aún más la ventaja de las esferas 3D de Caco-2 sobre las monocapas de Caco-2 2D, se realizó un análisis de Western blot de la expresión de la proteína SERT.

Los resultados mostraron una mayor expresión de la proteína SERT en esferas 3D de Caco-2 en comparación con las células Caco-2 2D. Finalmente, se utilizó un sistema de cámara de Ussing para mostrar que el TGF beta aumenta el flujo de la mucosa a la serosa, lo que refleja una mayor absorción de 5-HT de la membrana luminal y una mayor acumulación de 5-HT observada en la mucosa ileal. Tales hallazgos están respaldados por la sensibilidad observada de la absorción de 5-HT al tratamiento con fluoxetina que corresponde a la expresión de SERT en la membrana luminal.

Una vez dominada, esta técnica de extracción y montaje de la mucosa ileal se puede completar en 15 minutos. Al adoptar este procedimiento, es importante recordar que al retirarse del animal, la preparación intestinal extravio tiene una viabilidad limitada y puede durar hasta tres horas. Los quistes 3D de Caco-2 podrían utilizarse para diversos estudios, como eventos de tráfico de membrana, expresión génica o interacción proteína-proteína de los transportadores epiteliales.

Tras su desarrollo, la técnica 3D Caco-2 abre el camino para que los investigadores en el campo del transporte intestinal exploren el movimiento de los fluidos y estudien la fisiopatología de las enfermedades dariales. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de EPI y los procedimientos de descontaminación adecuados. Después de ver este video, podrá cultivar células Caco-2 en cultivos 3D y utilizar estos cultivos para investigar la expresión del transportador epitelial.

También podrá utilizar la cámara de Ussing para estudiar la función de transporte de serotonina en el intestino del ratón nativo.