Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

El objetivo general de este experimento es caracterizar in vivo a los progenitores hematopoyéticos del saco vitelino y su descendencia mediante un sistema de mapeo de linaje inducido por tamoxifeno en ratón y citometría de flujo. Esto puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre el desarrollo y la diferenciación de progenitores hematopoyéticos que son distintos de las células madre hematopoyéticas. La principal ventaja de esta técnica es que los progenitores hematopoyéticos marcados dentro de una ventana de tiempo limitada, así como su descendencia, como los macrófagos residentes, pueden monitorizarse durante el desarrollo y la vida adulta.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la cantidad de células del tejido embrionario y al gran volumen de las muestras tratadas simultáneamente. Para comenzar el experimento, primero transfiera los cuernos uterinos de ratón diseccionados a una placa de Petri de 10 milímetros llena con aproximadamente 30 mililitros de PBS frío con hielo. Inmediatamente después, sujete las capas musculares del útero en el extremo cervical del cuerno y deslice unas tijeras finas entre la capa muscular y un tejido decidua para liberar los embriones.

Luego, con pinzas finas, retire la membrana de Reichert y elimine la placenta. Diseque cuidadosamente el saco vitelino y transfiéralo a una placa de cultivo tisular de 24 pocillos que contenga 0,5 mililitros de la solución de digestión. Después de seccionar los vasos umbilicales y vitelinos, transfiera inmediatamente el embrión a una placa de cultivo tisular de 12 pocillos que contenga 2 mililitros de EDTA frío de 10 milimolar.

Después de retirar la cabeza del embrión con tijeras finas y afiladas, incube el cuerpo y la cabeza en hielo durante 10 a 15 minutos, luego retire el embrión y recoja el EDTA que contiene la sangre. A continuación, elimine el amnios que rodea al embrión. Posteriormente, retire las extremidades posteriores y las extremidades extrañas del embrión.

Utilizando un par de pinzas finas, abra el tórax. A continuación, sujete la parte anterior del corazón y tire suavemente del tejido mientras suelta los órganos internos del cuerpo con un segundo par de pinzas. Bajo un microscopio estereoscópico, separe el hígado fetal del corazón y del intestino.

Y transfiera el órgano a una placa de 24 pocillos llena con 0,5 mililitros de la solución de digestión. La conexión anatómica con el sistema cardiovascular es fundamental para la identificación del hígado fetal. El hígado fetal aún se encuentra en esta etapa de desarrollo y cuanto más jóvenes sean los embriones, más difícil puede resultar la disección.

Para preparar suspensiones celulares primarias, incube los órganos recolectados en la solución de digestión a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Coloque el tejido en la solución enzimática sobre un tamiz de 10 micrómetros colocado encima de un pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos que contenga 1 mililitro de tampón FACS. Utilice un émbolo de goma negro de una jeringa de 2 milímetros para disociar el tejido mediante una ligera trituración hasta obtener una suspensión de células individuales.

Luego, aspire la suspensión celular con una pipeta Pasteur y transfiérala a un tubo de 15 mililitros. Centrifugue la suspensión a 320 ×g a 4 grados Celsius durante 7 minutos. Tras la centrifugación, aspire y deseche el sobrenadante.

A continuación, prepare un tampón de bloqueo Fc fresco y resuspenda el precipitado en 60 microlitros. Luego, transfiera 50 microlitros de la suspensión celular individual a un pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Incube la placa en hielo durante al menos 15 minutos.

A continuación, transfiera los 10 microlitros restantes de la suspensión a un tubo FACS de poliestireno de 5 mililitros para obtener un grupo de muestras derivadas de diferentes tejidos. Transfiera 50 microlitros del grupo a la placa de 96 pocillos para los controles FMO de cada fluorocromo. Para continuar con la tinción de superficie de antígenos, utilice un conjunto de seis anticuerpos fluorocromados para preparar una solución de anticuerpos y tampón FACS.

Luego prepare seis soluciones de anticuerpos y el tampón FACS utilizado para la tinción de control FMO. Posteriormente, agregue 50 microlitros de las soluciones de anticuerpos a las muestras en la placa de 96 pocillos. Mezcle las muestras mediante pipeteo doble suave e incube la placa en hielo durante 30 minutos.

Centrifugar la placa de 96 pocillos a 320 × g a 4 grados Celsius durante 7 minutos y eliminar el sobrenadante. Lavar las células con 200 microlitros de tampón FACS y centrifugar la placa una vez más. Se debe tener especial cuidado al eliminar el sobrenadante mediante inversión de la placa.

La placa de 96 pocillos debe invertirse con un único movimiento brusco de muñeca para evitar soltar las células. Finalmente, filtre las muestras de tejido y control en tubos de poliestireno de 6 milímetros utilizando un colador de 70 micrómetros. Ahora puede realizarse el análisis citométrico de flujo.

Se analizó una población de células individuales citoplásmicas no eritrocíticas vivas para evaluar la expresión del marcador de progenitor KIT y del marcador de células hematopoyéticas CD45. Dentro de la población objetivo, se distinguieron tres subpoblaciones celulares diferentes: KIT positivo CD45 negativo, KIT positivo CD45 bajo y KIT negativo CD45 positivo.

Entre los precursores positivos para el kit del saco vitelino, tanto las poblaciones celulares CD45 negativas como CD45 bajas contenían células positivas para AA4.1 que expresan la proteína fluorescente amarilla o YFP, lo que indica que los precursores inmaduros positivos para KIT expresan primero AA4.1 independientemente de la expresión de CD45. Las células positivas para AA4.1 y positivas para YFP en el hígado y el cerebro solo se encontraron en la población precursora KIT positiva y CD45 baja, y probablemente corresponden a precursores circulantes que se originaron a partir de los precursores del saco vitelino. Los macrófagos se encontraron en la población precursora negativa para el kit y positiva para CD45, y se identificaron como células F480 brillantes y positivas para CD11B.

Los macrófagos en el saco vitelino, hígado y cerebro fueron etiquetados eficientemente mediante una única administración de 4-hidroxi-tamoxifeno, lo que podría indicar su origen a partir de ENP. Una vez dominado, el procedimiento de aislamiento y tinción celular puede realizarse en tres a cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener siempre las muestras en hielo tan pronto como se recolecten.

Los tampones FACS frescos deben prepararse diariamente y filtrarse. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otras líneas reporteras de mash o cepas de flujo, como las líneas Rosa MTMG o Rosa confetti, para responder preguntas adicionales sobre el potencial de indiferenciación y fase proto de las células marcadas posteriormente.