Name: Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprende a identificar progenitores eritromioideos y su descendencia en embriones de ratón mediante citometría de flujo. Este método permite rastrear macrófagos residentes durante el desarrollo y la adultez.

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Los autores agradecen al Prof. Frédéric Geissmann y al Profesor Christian Schulz por las discusiones perspicaces; Dr Hannah Garner para la lectura crítica del manuscrito, el Dr. Xavier Montagutelli y el Dr. Jean Jaubert y el personal de la instalación de animales del Instituto Pasteur para el apoyo con la cría de ratón; Y Pascal Dardenne y Vytaute Boreikaite, becario de Amgen, por su asistencia técnica. La investigación en el laboratorio de EGP está financiada por el Institut Pasteur, el CNRS, el Cercle FSER (FRM) y un paquete inicial del Institut Pasteur y el consorcio REVIVE, que cuenta con el apoyo de una beca de doctorado del consorcio REVIVE.

Los procedimientos en animales se realizaron de acuerdo con el comité institucional aprobado para el cuidado y uso de los animales del Institut Pasteur (CETEA). 1. En Utero Pulse Etiquetado en Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embriones <ol><li> Preparar la solución madre de 4-hidroxitamoxifeno (OH-TAM, 50 mg / mL). <ol><li> Bajo la campana, abra el vial de 25 mg de OH-TAM y agregue 250 μl de etanol (100%). </li><li> Transferir la solución de OH-TAM a un tubo de microcentrífuga de 2 ml con una punta truncada y agitar vórtex a velocidad máxima durante 10 min. </li><li> Sonicate 30 min en un baño de sonicador. </li><li> Añadir 250 μl de aceite de ricino PEG-35 bajo la humedad para obtener una solución madre de 50 mg / ml. NOTA: El aceite de ricino PEG-35 es un disolvente con propiedades anfifílicas que se une a las moléculas hidrófobas y las solubiliza en disolventes acuosos. </li><li> Vórtice durante aproximadamente 5 min.A velocidad máxima y sonicar durante 30 minutos en un baño sonicador. </li><li> Alícuota de 90 μl (4,5 mg) por tubo de microcentrífuga (1 alícuota por inyección). </li><li> Almacenar a 4 ° C durante 1 semana o a -20 ° C para el largo plazo como se ha descrito anteriormente 13 . </li></ol></li><li> Preparar la solución madre de Progesterona (10 mg / ml) <ol><li> Añadir 250 μl de Etanol al 100% a 25 mg de progesterona para preparar una suspensión de 10 mg / 100 μl bajo la humedad. Vórtice suavemente. </li><li> Agregue 2250 μl de aceite de girasol esterilizado en autoclave para preparar 10 mg / ml de solución de progesterona debajo del capó. </li><li> Vortex durante aproximadamente 5 min a velocidad máxima, alícuota y almacenar a 4 ° C. Tenga en cuenta que la solución es clara cuando se almacena. </li></ol></li><li> Administración de tamoxifeno NOTA: Se estimó el desarrollo embrionario considerando el día de la formación del tapón vaginal como día embrionario (E) 0,5. La recombinación se induce por inyección única a E8,5En embarazadas hembras MeriCreMer Csf1r 12 . Suplemento OH-TAM con 37,5 μ g por g de Progesterona para reducir las tasas de aborto después de la administración de tamoxifeno. Inyectar a la 1 pm (para tapón vaginal observado en la mañana). <ol><li> En la mañana de la inyección, sonicar una alícuota de la solución de OH-TAM durante 10 min (o hasta resuspender completamente). </li><li> Añadir 360 μL de NaCl al 0,9% bajo la humedad para obtener una solución de OH-TAM de 10 mg / ml y agitar bien el vórtice. Sonicar hasta que la solución es clara y completamente resuspendido (al menos 30 min). </li><li> Pre-caliente la progesterona a temperatura ambiente. </li><li> Mezcle 450 μL de OH-TAM y 225 μL de progesterona en un tubo de microcentrífuga. Vórtice. </li><li> Sonicar al menos 10 minutos y cargar en una jeringa de 1 ml con una aguja de 25G. </li><li> En las instalaciones de los animales, pesa la hembra embarazada ( Csf1r MeriCreMer las hembras están en un fondo genético FVB consanguíneo y el peso típico entre betweEn 25 y 33 g). </li><li> Realice una inyección intraperitoneal inyectando lentamente el volumen calculado en el ratón. Después de retirar la aguja, presione suavemente la herida punzante y masajee el abdomen para distribuir el OH-TAM. NOTA: La dosis de inyección de OH-TAM es de 75 mg / kg y la de progesterona es de 37,5 mg / kg. La Tabla 1 proporciona el volumen a inyectar en mujeres embarazadas. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Peso del ratón (g) </td><td> Volumen total a inyectar de la mezcla (μL) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 281 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 292 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 303 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 315 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 326 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 338 </td></tr><tr><td> 31 </td><td> 348 </td></tr><tr><td> 32 </td><td> 360 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 33 </td><td> 371 </td></tr><tr><td> 34 </td><td> 382 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 394 </td></tr></tbody></table> TABLA 1 Volumen de inyección de 4-OH-tamoxifeno (OH-TAM). Volumen requerido para una sola inyección a E8,5 de 75 μg por g (peso corporal) de OH-TAM suplementado con 37,5 μg por g de progesterona. 2. Disección del saco de yema de huevo (YS) y del hígado fetal (FL) NOTA: Las técnicas estériles rigurosas no son necesarias cuando se manipulan embriones a menos que se vayan a utilizar para la cultura a largo plazo. Sin embargo, el área de trabajo debe estar limpia y cubierta con papel absorbente. <ol><li> Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y mezcla de digestión (PBS que contiene 1 mg / ml de colagenasa D, 100 U / ml de desoxirribonucleasa I (DNasa I) y 3% de suero fetal bovino). </li><li> Sacrificar a mujeres embarazadas por cerVial en el día de gestación requerido ( p . Ej. Estadio embrionario E10.5). </li><li> Pellizque la piel justo por encima de los genitales y haga una pequeña incisión en la línea media con unas tijeras. Tire de la piel hacia la cabeza para exponer completamente la pared del cuerpo sin piel. Cortar los músculos abdominales para exponer los órganos internos y empujar el intestino para exponer los dos cuernos uterinos. </li><li> Con fórceps de tamaño mediano, agarre la almohadilla de grasa unida al ovario y tire suavemente del útero. Corte a nivel cervical de los cuernos uterinos y levante los cuernos de la cavidad peritoneal. Retire la almohadilla de grasa para liberar completamente los cuernos uterinos y corte los cuernos del ovario en cada lado. </li><li> Ponga los cuernos en PBS helado en una placa de Petri de 10 mm. Agarre rápidamente las capas del músculo del útero en una extremidad (extremo cervical) y deslice las tijeras finas entre la capa del músculo y el tejido decidual para liberar los embriones con el tejido decidual circundante. NOTA: Los músculos tienden a contraerse rápidamenteR la extracción, por lo que este paso debe ser lo más rápido posible. </li><li> Utilice un par de pinzas finas para cortar la membrana de Reichert y la placenta. </li><li> Retire suavemente el saco vitelino y colóquelo en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 0,5 ml de mezcla de digestión. NOTA: En este paso, se puede recolectar sangre embrionaria. <ol><li> Inmediatamente después de separar los vasos umbilicales y vitelinos, transferir el embrión a una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos que contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) enfriado con hielo 10 mM. Decapitar el embrión con tijera fina aguda, tratando de limitar lo más posible la dilaceración de los tejidos. Incubar en hielo durante 10-15 min y recoger el EDTA que contiene la sangre. </li></ol></li><li> Quite el amnio que rodea al embrión. </li><li> Para las etapas &lt;E11.5, cuente el número de pares de somitas para una mejor estadificación de los embriones y una mejor resolución temporal (cada par somite se desarrolla en ~ 1 h 30 min). </li><li> Cortar la cabeza del embrión nosotrosPinzas o tijeras finas. Transferir la cabeza a una placa de 24 pocillos con 0,5 ml de mezcla de digestión. NOTA: El neuroectodermo y el cerebro en etapas posteriores se diseccionan adicionalmente para análisis de citometría de flujo; Retire cuidadosamente el plexo vascular circundante. </li><li> Cortar el embrión por encima del miembro posterior y quitar los miembros anteriores. </li><li> Para aislar el hígado, abra el tórax usando un par de pinzas finas. Pellizque antes hacia el corazón y tire suavemente mientras usa la segunda pinza para liberar los órganos del cuerpo. <ol><li> Separar cuidadosamente el hígado fetal del corazón y el intestino. Transferir el hígado fetal a una placa de 24 pocillos con 0,5 ml de mezcla de digestión. Vigilar cuidadosamente la transferencia bajo el microscopio de disección. </li></ol></li><li> Recoger la región de la cola (o cualquier otra parte del embrión) para genotipificación mediante el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). NOTA: Otros tejidos y órganos pueden ser cosechados de embriones E10.5 para un análisis similar usando citometría de flujo. Sangre, cabeza de esquíN, región aorta-gónada-mesonefrosa (AGM), corazón y neuroectodermo se pueden recoger en E10.5. En etapas posteriores, también se pueden recoger pulmón, riñón, bazo y páncreas. Una descripción detallada de la disección de la AGM en diferentes etapas de desarrollo se ha descrito anteriormente [ 14] . </li></ol> 3. Procesamiento de tejidos embrionarios para citometría de flujo <ol><li> Incubar los órganos (colocados en la mezcla de digestión) durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Transferir el tejido y la solución enzimática a un colador de 100 μm colocado en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos llena con 6 ml de tampón FACS (albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA) y EDTA 2 mM en 1x PBS). Disociar mecánicamente suavemente macerando con el émbolo de caucho negro de una jeringa de 2 ml para obtener una suspensión de una sola célula. NOTA: De ahora en adelante, todos los pasos deben ser realizados a 4 ° C. </li><li> Recoger la suspensión celular con una pipeta Pasteur y transferirla a un tubo de 15 mL. </li><li> SpiN durante 7 min a 320 xg a 4 ° C. Desechar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Resuspender el sedimento en 60 mu l de tampón de bloqueo Fc (anticuerpo bloqueante CD16 / CD32 diluido 1/50 en tampón FACS). <ol><li> Transferir 50 μl de la suspensión de una sola célula por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Incubar durante al menos 15 minutos en hielo. NOTA: La tinción también puede realizarse en tubos FACS de poliestireno de 5 mL cuando se manipula un pequeño número de muestras. </li><li> Transfiera los 10 μl restantes a un tubo FACS de poliestireno de 5 ml para obtener un conjunto de muestras de cada tejido. Esta piscina servirá como controles ( es decir, muestras sin color y controles fluorescentes menos uno (FMO) para cada fluorocromo). Transferir 50 μL de la piscina para cada uno de los controles fluorescentes menos uno (FMO) (uno por fluorocromo) a la placa de 96 pocillos múltiples. NOTA: Cada control de FMO contiene todos los anticuerpos acoplados con fluorocromo del panel de anticuerpos, excepto el unoQue se está midiendo. Los FMO se utilizan para identificar los límites de las puertas y para controlar la superposición espectral en los paneles multicolor. Para abordar correctamente las variaciones en el fondo y la autofluorescencia entre diferentes tejidos, es importante preparar estos controles del conjunto de muestras de cada tejido. El control apropiado para la expresión de YFP serán las muestras de embriones Cre-negativos, que se confirman por genotipificación de PCR. </li></ol></li></ol> 4. Tinción del antígeno de superficie <ol><li> Preparar la mezcla de anticuerpos en tampón FACS (Tabla 2). Preparar 50 μl de mezcla de anticuerpos por muestra. <ol><li> Utilizar los siguientes anticuerpos acoplados al fluorocromo: anti-CD45.2 (clon 104); Anti - CD11b (clon M1 / ​​70); Anti - F4 / 80 (clon BM8); Anti - AA4.1 (clon AA4.1); Anti - Kit (clon 2B8); Y anti - Ter119 (clon Ter119). </li><li> Preparar seis mezclas de anticuerpos para los controles FMO en tampón FACS. Preparar 50 μL de mezcla de anticuerpos por muestra de control. NOTE: La dilución de anticuerpos en la mezcla de anticuerpos es dos veces más concentrada que la concentración final indicada en la tabla de materiales. Para un panel con seis anticuerpos acoplados con fluorocromo, se preparan 6 controles de FMO. La Tabla 2 proporciona la composición de la mezcla de anticuerpos y controles FMO para un tubo. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="7"> Volumen (μl) de anticuerpo (Volumen Final 50 μL) </td></tr><tr><td> Anticuerpo </td><td> Clon </td><td> Mezcla de anticuerpos </td><td> FMO CD45.2 </td><td> FMO CD11b </td><td> FMO F4 / 80 </td><td> FMO AA4.1 </td><td> Kit FMO </td><td> FMO Ter119 </td></tr><tr><td> Anti-CD45.2 </td><td> 104 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b </td><td> M1 / 70 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Anti-F4 / 80 </td><td> BM8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-AA4.1 </td><td> AA4.1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-kit </td><td> 2B8 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Anti-Ter119 </td><td> Ter119 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> Tampón FACS </td><td> 45,5 </td><td> 46,5 </td><td> 46 </td><td> 46,5 </td><td> 46,5 </td><td> 46 </td><td> 46 </td></tr></tbody></table>Tabla 2: Volumen de anticuerpos usando para tinción y controles fluorescentes menos uno (FMO). Volumen (μl) de anticuerpo requerido para un volumen final de 50 μl. <ol start="2"><li> Añadir 50 μl de la mezcla de anticuerpos a las muestras en la placa de 96 pocillos múltiples (el volumen final durante la tinción es de 100 μl). Pipetar suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces e incubar en hielo durante 30 min. </li><li> Girar la placa de 96 pocillos múltiples durante 7 min a 320 xg a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Resuspender en 200 μl de tampón FACS. </li><li> Repetir el procedimiento de lavado (paso 4.3) dos veces con 150 μl de tampón FACS. </li><li> Filtrar las muestras y los controles (FMOs y muestras sin revestimiento) en tubos de poliestireno de 5 ml a través de un filtro de 70 μm. Almacenar en hielo hasta la adquisición. </li></ol> 5. Identificación de EMPs y macrófagos derivados de YS por citometría de flujo NOTA: Este protocolo se optimizó utilizando un ecuador de flujo láser de 4 eqUipped con un láser violeta de 405 nm, un láser azul 488 nm, un láser amarillo 562 nm y un láser rojo 638 nm. <ol><li> Prepare perlas de compensación para cada anticuerpo acoplado siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice muestras sin contener y perlas de compensación para optimizar las intensidades del láser. </li><li> Para identificar los límites de la puerta, utilice controles FMO (Fluorescencia menos uno) para cada anticuerpo. </li><li> Para excluir células muertas, añadir 1 μl de DAPI (1 mg / ml) al tubo (que contiene 200 μl de suspensión de células teñidas) 1 min antes de la adquisición. Utilice la fuerte señal DAPI y el parámetro de dispersión directa (FSC) para realizar la exclusión de las células muertas y los desechos. NOTA: Utilice software del citómetro de flujo para extraer puertas durante la adquisición. La matriz de compensación y el análisis se pueden realizar después de la adquisición de la muestra usando otro software comercialmente disponible. </li><li> Utilice la dispersión directa y lateral (FSC vs SSC) para realizar la discriminación de células vivas y dobletes de los eventos totales. </li><li> Crear gráficos de puntos de fluorescencia en el eje log-escala y dibujar puertas hija para, primero, excluir eritrocitos (Ter119 +) y, a continuación, para identificar las células progenitoras (Kit +) y células hematopoyéticas (CD45 + neg Kit) (Ver Figura 1). </li><li> Crear histogramas de fluorescencia para cuantificar la eficiencia de etiquetado de YFP entre las diferentes poblaciones identificadas en el YS ( Figura 2 ], el hígado fetal ( Figura 3 ] y el cerebro ( Figura 4 ]. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las diferentes ondas de células precursoras hematopoyéticas se solapan parcialmente en un corto período de tiempo, lo que hace que el análisis de la contribución de cada onda de hematopoyesis de desarrollo a las células inmunológicas sea técnicamente muy difícil. Los sistemas de Cre inducibles con tamoxifeno ofrecen la oportunidad de marcar células específicas de una manera inducible en el tiempo y realizar análisis de linaje en embriones o adultos, sin necesidad de cultivo ex vivo ...

Existen varias olas sucesivas pero superpuestas de progenitores hematopoyéticos durante el desarrollo cuya progenie mieloide permanece en la edad adulta. En primer lugar, los progenitores &quot;primitivos&quot; unipotentes emergen en el saco de yema de ratón 1 , 2 entre E7.5-E8.25 y dan lugar a macrófagos embrionarios sin ningún intermediario monocítico. Si los macrófagos derivados de progenitores primitivos persisten en el cerebro adulto como microglia sigue siendo un sujeto de investigación activa. En segundo lugar, Erythro-Myeloid precursores (EMPs) surgen en el saco vitelino en E8.5, entrar en el torrente sanguíneo y colonizar el embrión. EMP emerjan de la vaina vitelino endotelio hemogénico en un Runx1 dependiente de la transición endotelial a hematopoyética 3 , 4 . Mientras EMP puede diferenciarse en macrófagos dentro del saco vitelino, también colonizar el hígado fetal de día embrionario (E) 9 5 y differenEn eritrocitos, megacariocitos, macrófagos, monocitos granulocitos y mastocitos [ 6] . Los macrófagos que derivan de las PEM exhiben capacidad proliferativa en tejidos adultos y de desarrollo. Si los macrófagos derivados de EMP pasan por alto la etapa de diferenciación de los monocitos sigue siendo controvertido, ya que se sabe muy poco sobre su vía de diferenciación 7 , 8 . Finalmente, las células madre hematopoyéticas (HSCs) emergen a E10.5 dentro del embrión propio de la región aorta-gonad-mesonefros y migran al hígado fetal. Los HSC con capacidad de repoblación a largo plazo sólo se detectan después de E11 (en el estadio de 42 somites) 9 . Allí, se expanden y se diferencian de E12.5 hasta que la hematopoyesis definitiva comienza a desplazarse a la médula ósea, que se convierte en el sitio predominante de la producción de células sanguíneas durante la vida postnatal 10 . El SPLa superposición temporal y temporal en la aparición, así como los marcadores inmuno-fenotípicos compartidos, han obstaculizado hasta ahora nuestra capacidad para distinguir las contribuciones específicas de estas ondas de progenitores hematopoyéticos embrionarios. Mientras tanto EMP y HSC se generan de una manera dependiente de Runx1 y expresan el factor de transcripción Myb y el receptor del factor de crecimiento Csf1r (Receptor del Factor Estimulador de Colonia 1, también conocido como Receptor de Factor Estimulador de Colonias de Macrófagos) entre otros, los EMPs pueden distinguirse de HSCs por su falta de potencial linfoide, tanto in vitro e in vivo , su falta de repoblación a largo plazo potencial y la falta de expresión superficial de la línea Sca-1 11 . Modelos genéticos de cartografía de destino son necesarios para caracterizar la ontogenia de macrófagos, ya que permiten la orientación de progenitores embrionarios en una célula específica y tiempo específico. Aquí presentamos el protocolo de asignación de destino utilizado en nuestro laboratorio para discriminar entre los dos linajesS de macrófagos que se encuentran en la mayoría de los tejidos adultos: macrófagos infiltrantes derivados de HSC y macrófagos residentes independientes de HSC. Macrófagos residentes de tejidos se han rastreado a Myb-células precursoras independientes que expresan el receptor de citoquinas Csf1r 12 y están presentes en el embrión en E8.5-E10.5 utilizando tres complementarias estrategias de cartografía de destino [ 6] . Con el fin de estudiar la hematopoyesis de saco vitelino sin etiquetar HSC fetal, utilizamos una cepa transgénica, Csf1r MeriCreMer , que expresa una proteína de fusión inducible por el tamoxifeno de recombinación Cre mejorada y dos receptores de estrógenos de ratón (Mer-iCre-Mer) bajo el control de El promotor Csf1r. Por tanto, la recombinasa Cre estará activa en células que expresan Csf1r durante un intervalo de tiempo limitado. Cuando se utiliza con una cepa informadora que contiene una proteína fluorescente corriente abajo de un casete lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), dará lugar a la permanenciaEtiquetado genético de las células presentes en el momento de la inducción, pero también de su progenie. La administración en E8.5 de la forma activa de tamoxifeno, 4-hidroxitamoxifeno (OH-TAM), etiqueta EMPs y macrófagos, sin etiquetar progenitores &quot;primitivos&quot; unipotentes de saco vitelino o HSCs fetales. Por lo tanto, hemos caracterizado el inmunofenotipo de EMPs y su progenie durante el desarrollo embrionario, así como evaluado la contribución de los macrófagos derivados del saco vitelino a las piscinas de macrófagos adultos. Se requiere trabajo adicional para caracterizar si los macrófagos derivados de progenitores primitivos también se etiquetan utilizando este enfoque y si pueden contribuir a piscinas de macrófagos para adultos.

<table><tbody><tr><td>#5 Pinzas rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>MC19/B Tijeras de resorte Pascheff-Wolff&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras rectas de 8,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Kit-PE (clon 2B8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553355</td><td>dilución 1/200 en FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clon 104)</td><td>Sony</td><td>1149120</td><td>dilución 1/100 en FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clon AA4.1)</td><td>eBioscience</td><td>17-5892</td><td>Dilución 1/100 en FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clon Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>560512</td><td>dilución 1/200 en FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80-BV421 (clon BM8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>123137</td><td>dilución 1/100 en FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clon M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>552850</td><td>Dilución 1/200 en FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block, clon 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fischer Scientific</td><td>12559069</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Fischer Scientific Fischer Scientific</td><td>11570506</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I</td><td>Sigma</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353224</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Fischer Scientific 11874235</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos Cultivo de tejidos con fondo en forma de U placa</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Jeringa Plastipak 2 mL&nbsp;</td><td>Dutscher Dominique</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Rejilla de nylon 100 &micro; coladores de celdas m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Rejilla de nylon 70 &micro; Filtros de células m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubos Falcon</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GP Millipore kit de filtración, 0.2 &mu; m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-HIDROXITAMOXIFENO 25mg</td><td>Sigma</td><td>H7904-25MG</td><td>Se debe tener especial cuidado al preparar y trabajar con tamoxifeno y sus derivados. Utilice siempre el equipo de protección personal adecuado</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P3972</td><td>Utilice siempre el equipo de protección personal adecuado</td></tr><tr><td>Aceite de ricino PEG-35 (Kolliphor/Cremophor EL)</td><td>Sigma</td><td>C5135</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de girasol</td><td>Sigma</td><td>S5007-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>24103-1L-R-D</td><td>Utilice siempre el equipo de protección personal adecuado y lo utilice bajo la campana extractora</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 1 ML (1 MG/ML EN AGUA)Fischer</td> <td>Scientific</td><td>10116287</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 citómetro de flujo</td><td>Beckman Coulter</td><td>B75408</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Daily QC Fluorosferas</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>B53230</td><td></td></tr><tr><td>Kit de perlas de captura de anticuerpos VersaComp (2x5 mL)</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>B22804</td><td></td></tr><tr><td>FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J</td><td>El laboratorio</td> Jackson <td>19098</td><td></td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>El laboratorio Jackson</td><td>6148</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Los macrófagos son fagocitos profesionales del brazo innato del sistema inmunológico. En el estado estacionario, los macrófagos sésiles se encuentran en tejidos adultos donde actúan como centinelas de primera línea de infección y daño tisular. Mientras que otras células inmunitarias se renuevan continuamente a partir de células progenitoras y hematopoyéticas (HSPC) localizadas en la médula ósea, se ha demostrado que un linaje de macrófagos, conocido como macrófagos residentes, se mantiene a sí mismo en tejidos sin entrada de HSPCs de médula ósea. Este linaje se ejemplifica por microglia en el cerebro, células de Kupffer en el hígado y células de Langerhans en la epidermis entre otras. La lámina intestinal y la lámina intestinal son los únicos tejidos adultos desprovistos de macrófagos residentes independientes del HSPC. Investigaciones recientes han identificado que los macrófagos residentes se originan de la hematopoyesis extra-embrionaria del saco vitelino de progenitor (es) distinto de las células madre hematopoyéticas fetales (HSC). Entre la hematopoyesis definitiva del saco vitelino, eLos progenitores ritiomielóides (EMP) dan lugar tanto a las células eritroides y mieloides, en particular a los macrófagos residentes. EMP sólo se generan dentro del saco vitelino entre E8.5 y E10.5 días de desarrollo y migran al hígado fetal tan pronto como la circulación se conecta, donde se expanden y se diferencian hasta por lo menos E16.5. Su progenie incluye eritrocitos, macrófagos, neutrófilos y mastocitos, pero sólo los macrófagos derivados de EMP persisten hasta la edad adulta en los tejidos. La naturaleza transitoria de la emergencia EMP y la superposición temporal con la generación de HSC hace difícil el análisis de estos progenitores. Hemos establecido un protocolo de cartografía de destino inducible por tamoxifeno basado en la expresión del promotor Csf1r del receptor de citocinas de macrófagos para caracterizar células EMP y EMP derivadas in vivo mediante citometría de flujo.

El mapeo genético del destino se logró mediante la administración a E8.5 de OH-TAM en hembras Csf1r-Mer-iCre-Mer apareadas con machos portadores de un reportero Rosa26-LSL-eYFP. En presencia de OH-TAM, la escisión del casete de parada conduce a la expresión permanente de YFP en las células que expresan Csf1r . Se recogieron dos tejidos hematopoyéticos: el saco vitelino y el hígado fetal y un tejido no hematopoyético, el neuroectodermo, de los embriones en E10.5. Las suspensiones...

Mientras que los macrófagos infiltrados son continuamente reclutados en tejidos adultos a partir de precursores circulantes, los macrófagos residentes sembran su tejido durante el desarrollo, donde se mantienen sin más aportación de los progenitores. Recientemente se identificaron los progenitores de macrófagos residentes. Aquí, presentamos métodos para el mapeo de destino genético de los progenitores de macrófagos residentes.

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

El objetivo general de este experimento es caracterizar in vivo a los progenitores hematopoyéticos del saco vitelino y su descendencia mediante un sistema de mapeo de linaje inducido por tamoxifeno en ratón y citometría de flujo. Esto puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre el desarrollo y la diferenciación de progenitores hematopoyéticos que son distintos de las células madre hematopoyéticas. La principal ventaja de esta técnica es que los progenitores hematopoyéticos marcados dentro de una ventana de tiempo limitada, así como su descendencia, como los macrófagos residentes, pueden monitorizarse durante el desarrollo y la vida adulta.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la cantidad de células del tejido embrionario y al gran volumen de las muestras tratadas simultáneamente. Para comenzar el experimento, primero transfiera los cuernos uterinos de ratón diseccionados a una placa de Petri de 10 milímetros llena con aproximadamente 30 mililitros de PBS frío con hielo. Inmediatamente después, sujete las capas musculares del útero en el extremo cervical del cuerno y deslice unas tijeras finas entre la capa

identification-erythromyeloid-progenitors-their-progeny-mouse-embryo

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un método de citometría de flujo para la identificación y el análisis molecular de la diferenciación de etapas específicas de murino progenitores eritroides y precursores, directamente en la médula ósea recién cosechadas del ratón, el bazo o el hígado fetal. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119 y tamaño de la celda.

Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos.

Identificación de un murino eritroblasto subpoblación Enriquecido en enucleación Eventos Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.

Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal

Aquí, describimos un nuevo método citométrico de flujo para el aislamiento prospectivo de progenitores eritroides unitarios formadores de ráfagas tempranas (BFU-e) y eritroides unitarios formadores de colonias (UFC-e) directamente de médula ósea y bazo de ratón frescos. Este protocolo, desarrollado en base a datos transcriptómicos unicelulares, es el primero en aislar todos los progenitores eritroides del tejido con alta pureza.

Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

Este artículo describe la metodología in vivo e in vitro para caracterizar los progenitores de sedimentación tímica mediante el análisis de la cinética de generación, fenotipo y número de su progenie de células T.

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Aquí, presentamos un protocolo para cultivar arcos faríngeos para estudiar la biología de las células progenitoras del corazón y los músculos y su microambiente.

Ex Vivo Cultura de faríngea Arcos para el Estudio de corazón y músculo Progenitores y su nicho

Describimos una estrategia de clasificación para espermátidas de ratón utilizando citometría de flujo. Las espermátidas se clasifican en cuatro poblaciones de alta pureza, que incluyen espermatidas redondas (pasos 1-9 de espermiogénesis), de elongación temprana (pasos 10-12 de espermiogénesis), de elongación tardía (pasos 13-14 de espermiogénesis) y elongadas (pasos 15-16 de espermiogénesis). La tinción, el tamaño y la granulosidad del ADN se utilizan como parámetros de selección.

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

Aprende a identificar progenitores eritromioideos y su descendencia en embriones de ratón mediante citometría de flujo. Este método permite rastrear macrófagos residentes durante el desarrollo y la adultez.

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

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