Proyección ambiental de hydrophila de la Aeromonasy Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa en los sistemas de pez cebra

El objetivo general de esta técnica de muestreo es reducir el número de peces utilizados para la vigilancia sanitaria y optimizar la rotación, el costo y la sensibilidad de la detección de patógenos, incluso cuando se examinan las importaciones en cuarentena. Esta técnica ayuda a definir los estatutos sanitarios de las colonias de refugio. Este método es una herramienta útil a la hora de leer o evaluar la eficacia del tratamiento.

Una de las principales ventajas de esta técnica es el control y la clasificación de las importaciones en cuarentena. Fortalece el plan de bioseguridad de la instalación acuática. Para comenzar el protocolo, coloque un tanque limpio de ocho litros fuera de un sistema de recirculación.

Llene el tanque con unos ocho litros de agua procedente de sumideros. Agregue dos perlas de cerámica o cubos de esponja de biomedia de los sistemas para tamizar. A continuación, agregue uno para hacer Danio rerio por litro, utilizando peces de tipo silvestre del fondo genético dominante en la instalación, por ejemplo A B. Seleccione al menos seis peces.

Alimenta a los peces una vez al día. Varíe las dietas para asegurarse de que los centinelas estén expuestos a todas las dietas utilizadas en las instalaciones de pez cebra. Para llevar a cabo el cambio de agua, transfiera los centinelas en biomedia a un tanque temporal.

Vacíe completamente el tanque centinela y límpielo. Vuelva a llenar el tanque centinela solo con agua del sumidero y vuelva a colocar los centinelas y el biomedia. Después de exponer a los centinelas al agua del sumidero durante cuatro meses, eutanasiar a los peces mediante un método aprobado, como la inmersión en una solución de sobredosis de 2-fenoxietanol.

Para confirmar la muerte, espere diez minutos después del cese del movimiento del opérculo. Agarre el cadáver con pinzas y congélelo completamente a menos 80 grados centígrados en un recipiente identificado. Prepare un hisopo seco estéril con un eje de plástico y póngase guantes.

Localice la superficie para hisopar. Elija una superficie de sumidero con flujo bajo, la pared del sumidero en la superficie del agua, y retire cualquier elemento que impida un fácil acceso a la superficie. A continuación, desenvaine el hisopo retirando el embalaje exterior y exponga la punta de algodón estéril al aire.

Frote la pared del sumidero de cinco a 10 centímetros para absorber el agua y la biopelícula al nivel de la superficie del agua del sumidero. A continuación, envaina el hisopo o rompe la punta en un tubo de centrífuga estéril. Etiquete la muestra y envíela para una prueba de PCR o congele a menos 80 grados centígrados.

Para realizar el análisis de lodos por microscopía, use una jeringa de 60 mililitros para aspirar el lodo en el fondo de un sumidero. Divida la muestra en tubos de 15 mililitros. Enrosque las tapas y etiquete los tubos.

Centrifugar los tubos de 15 mililitros a 175 a 250 veces la gravedad durante diez minutos en una centrífuga con cubos oscilantes. Decanta los tubos. Después de decantar, conserve los sedimentos.

A continuación, prepare la solución saturada de azúcar mezclando 227 gramos de azúcar granulada y 177 mililitros de agua caliente con un agitador magnético. Llene los tubos hasta la mitad con la solución saturada de azúcar. Enrosque las tapas y mezcle bien el sedimento con la solución.

Coloque los tubos en los cubos giratorios de la centrífuga y llénelos hasta el tope con una solución saturada de azúcar. Coloque un cubreobjetos suavemente encima de cada tubo para que entre en contacto con la solución saturada de azúcar. Tenga en cuenta que los cuatro tubos para cada muestra de 60 mililitros están en caso de que algún cubreobjetos se caiga y se rompa durante la centrifugación.

Una vez que se haya completado el giro, levante la cubierta del vidrio y colóquela en un portaobjetos de vidrio, luego etiquete el portaobjetos con un lápiz o rotulador. En caso de que se produzcan demasiadas roturas de cubreobjetos, llene la mayor parte del tubo con la solución saturada de azúcar y centrifugue el tubo. Llene hasta el tope con la solución saturada de azúcar, luego coloque suavemente el cubreobjetos y espere 30 minutos.

Busca los huevos de pseudocapillaria tomentosa con el microscopio. Identifique los tapones bipolares con un aumento de 400X. Para detectar huevos de P. tomentosa en animales importados en cuarentena, coloque Danio rerio macho y hembra en un tanque y agregue la bandeja de desove en el tanque, pero úsela aquí para recolectar heces.

Después de una semana, retire el dispositivo de cría y coseche el lodo recolectado en el dispositivo de cría como se describió anteriormente. Aspire el lodo en el fondo de un tanque o sumidero con una jeringa de 60 mililitros y transfiera la muestra a un tubo de 60 mililitros. Cierre el tubo con la tapa de rosca y etiquete el tubo.

Deseche la jeringa. Agite el tubo de 60 mililitros y transfiera 15 mililitros a un tubo de 15 mililitros. Cierre el tubo con la tapa de rosca y etiquete el tubo.

Centrifugar el tubo de 15 mililitros a 175 a 250 veces la gravedad durante diez minutos en una centrífuga con cubos oscilantes. Decanta los tubos y mantén el sedimento en el tubo. Desenvaine el hisopo retirando el embalaje exterior y exponga la punta de algodón estéril al aire.

Frote el sedimento en el tubo durante 15 segundos. Envaina el hisopo hacia atrás o rompe la punta en un tubo de centrífuga estéril. Etiquete la muestra.

Congele a menos 80 grados centígrados y envíe para la prueba PCR. Utilizando el método de hisopado de sumidero de 115 peces analizados, Mycobaterium chelonae se detectó en el cinco por ciento y Mycobaterium haemophilum en el tres por ciento de las muestras y fueron las únicas especies patógenas identificadas. De los mismos sistemas, 49 hisopos de sumidero revelaron la presencia de cinco especies micobaterias.

Los odds ratios muestran que la técnica de hisopado del sumidero de superficie es una alternativa valiosa al uso exclusivo de centinelas para detectar Mycobacterium en las instalaciones de pez cebra. Las muestras ambientales también se utilizaron para el cribado de Aeromonas hydrophila, que se detectó en peces, lodos y muestras de superficie, lo que respalda la capacidad de las técnicas propuestas para cribar el biotopo de peces. Mycobacterium chelonae y Mycobacterium fortuitum se detectan con mayor frecuencia por PCR en los hisopos del sumidero de superficie que en la muestra de peces.

Una vez dominado, el muestreo toma solo unos minutos y la detección de huevos de pseudocapillaria tomentosa se puede realizar en una hora. Esta técnica hace que el cribado ambiental sea una parte clave del programa de seguimiento rutinario de la salud. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patología de los peces, como la relación entre la biopelícula bacteriana y la infección bacteriana.