Name: Proyección ambiental de hydrophila de la Aeromonasy Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa en los sistemas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a detectar patógenos en sistemas de pez cebra mediante hisopos de sumidero y análisis de lodo, mejorando la bioseguridad acuática y reduciendo el uso de peces centinela. Este método optimiza la detección de Mycobacterium spp. y Aeromonas hydrophila.

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Los autores desean agradecer al equipo de natación de BRF del Instituto Francis Crick por su ayuda técnica y entrada crítica. Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Crick de Francis que recibe su financiación de investigación de cáncer Reino Unido (FC001999), el Consejo de investigación médica del Reino Unido (FC001999) y el Wellcome Trust (FC001999).

1. exposición de pre-filtración centinelas de un sistema de recirculación
<ol><li>
Ajustar un tanque de 8 L limpia de un sistema de recirculación. Llenarlo con agua proveniente de los colectores de aceite. Añadir los granos de cerámica 2 o esponja cubos de bio-medios de comunicación de los sistemas a la pantalla (figura 1). Añadir 1-2 D.rerio/l (es decir, 12 peces). Utilizar peces de tipo salvaje del fondo genético dominante en las instalaciones, por ejemplo AB.
	<ol>
<li>Seleccione al menos 6 peces como sigue: por lo menos una hembra y un macho por debajo de 6 meses de edad, una hembra y un macho entre 6 y 18 meses y una hembra y un macho por encima de los 18 meses de edad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Alimentación una vez al día. Variar las dietas (p. ej., dieta seca, camarón de salmuera) para asegurarse de que los centinelas están expuestos a todas las dietas utilizadas en la instalación de peces cebra. Cambiar el agua en el lunes, el miércoles y el viernes, es decir, tres veces por semana durante 4 meses.
	<ol>
<li>Para llevar a cabo el cambio de agua, transferencia de Centinelas y medio biológico a un depósito temporal. Vaciar completamente el Centinela y limpiar. Llene el tanque de centinela con sólo el agua del sumidero. Vuelva a colocar los Centinelas y medio biológico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exponga a los centinelas durante 4 meses al agua del colector de aceite. Eutanasia el pescado por un método aprobado como inmersión en una solución de sobredosis de 2-fenoxietanol (3 mL/L).</li>
	<li>
Para confirmar la muerte, espere 10 minutos después de la cesación del movimiento de los opérculos.
	<ol>
<li>Agarra al cadáver con unas pinzas y congelar a-80 ° C en un recipiente identificado. Esto se utilizará para PCR12,15.</li>
		<li>Alternativamente, cortar el tailat el pedúnculo caudal, nick la pared abdominal y en formol al 4%. PRECAUCIÓN: Use guantes y gabinete para la histopatología del humo. Marcar el recipiente de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sumidero hisopos
<ol><li>Utilice una torunda seca estéril con una varilla de plástico. Guantes. Localizar la superficie en hisopo (pared del colector de aceite en la superficie del agua) y quitar cualquier elemento impidiendo el fácil acceso a la superficie. Elija una superficie de colector de aceite con flujo bajo.</li>
	<li>
Es el hisopo quitando el embalaje exterior y exponer la punta de algodón estéril al aire. Para evitar contaminación cruzada de la esponja, teniendo cuidado de no tocar las superficies de probadas.
	<ol>
<li>Limpiar la pared del colector de aceite durante 5-10 cm para absorber el agua y el biofilm en el nivel superficial del agua del colector de aceite.</li>
		<li>El hisopo hacia atrás de la envoltura o romper la punta en un tubo de centrífuga estéril. Etiquetar la muestra y enviar para la prueba de PCR o congelar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. detección de huevos de p. tomentosa en la parte inferior de un tanque
<ol><li>
Análisis de lodos por microscopia
	<ol>
<li>Utilice una jeringa de 60 mL9 para aspirar los lodos en el fondo de un sumidero o tanque con peces como a centinelas. Dividir la muestra en tubos de 15 mL. Cierre los tubos con su tornillo y etiqueta los tubos.</li>
		<li>Preparar la solución saturada de azúcar (gravedad específica = 1.27) de 227 gr. de azúcar granulada en 177 mL de agua caliente de la mezcla con un agitador magnético14.</li>
		<li>Centrifugar los tubos de 15 mL a 175-250 x g durante 10 min en una centrífuga con cubos de swing. Decantar los tubos y mantener el sedimento en su tubo.</li>
		<li>Llenar los tubos hasta la mitad con la solución saturada de azúcar. Cierre los tubos con su tapa de rosca y mezclar bien el sedimento con la solución.</li>
		<li>Colocar los tubos en los centrífuga swing cubos y llenarlos con solución saturada de azúcar en la parte superior. Conjunto un vidrio de cubierta suavemente sobre cada tubo y en contacto con la solución saturada de azúcar.</li>
		<li>Centrifugar a 175-250 x g durante 10 minutos Nota que poco cubierta de vidrio puede caer y romperse durante la centrifugación por lo tanto hay son 4 tubos para cada muestra de 60 mL. Levante el cubierta de vidrio y colóquelo en un portaobjetos de vidrio. Etiqueta de la diapositiva con un lápiz lápiz o marcador.<ol>
<li>En caso de muchas roturas de vidrio de cubierta, llenan la mayor parte del tubo con la solución del azúcar saturada, centrifugar a 175-250 x g por 10 min, llene hasta la parte superior con la solución saturada de azúcar, luego ajustar suavemente el vidrio de la cubierta. Espere 30 minutos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Buscar los huevos de p. tomentosa con el microscopio13 (figura 2 y 1 de Video). Identificar los enchufes bipolares en magnificación 400 X6. Nota: El tamaño de los huevos es 78 57 μm de largo y 27-39 μm de diámetro16,17. Tenga en cuenta que una diapositiva positiva es suficiente para la muestra de 60 mL ser declarado positivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proyección importados animales en cuarentena para los huevos de p. tomentosa
	<ol>
<li>Conjunto macho y hembra D. rerio en un tanque. Añadir al tanque un dispositivo normalmente utilizado para cosechar y conservar óvulos enraícen pero aquí para recoger las heces (figura 3). Nota: por ejemplo, un tanque de cría 1 L completo (tanque externo e interno del tanque con fondo rallado) esté totalmente sumergido en un depósito de 13 L, permitiendo el libre acceso de los peces para moverse dentro y fuera del dispositivo de reproducción.</li>
		<li>Retire el dispositivo de reproducción después de una semana y cosechar el lodo recogido en el dispositivo de reproducción como se describe en el paso 3.1 "lodo análisis por microscopia".</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. PCR en sedimentos de lodos
<ol><li>Aspirar el lodo en el fondo de un tanque o sumidero con una jeringa de 60 mL9 y transferir la muestra a un tubo de 60 mL. Cierre el tubo con su tapa de rosca y etiqueta el tubo. Deseche la jeringa.</li>
	<li>Agitar el tubo de 60 mL y transferir 15 mL a un tubo de 15 mL. Cierre el tubo con su tapa de rosca y etiqueta el tubo.</li>
	<li>Centrifugar el tubo de 15 mL a 175-250 x g durante 10 min en una centrífuga con cubos de swing. Decantar los tubos y mantener el sedimento en el tubo.</li>
	<li>
Es una esponja quitando el embalaje exterior y exponer la punta de algodón estéril al aire. Para evitar contaminación cruzada de la esponja, teniendo cuidado de no tocar las superficies de probadas.
	<ol>
<li>Limpiar el sedimento en el tubo por 15 s.</li>
		<li>El hisopo hacia atrás de la envoltura o romper la punta en un tubo de centrífuga estéril. La muestra de la etiqueta, congelar a-80 ° C y enviar para la prueba de PCR. Nota: 45 mL permanecen en el tubo de 60 mL. Ésta se puede guardar para la detección de huevos de p. tomentosa por análisis de lodos por microscopia como se describe en el paso 3.1, por ejemplo, para confirmar el resultado de la polimerización en cadena. La PCR en los lodos puede ser intentada para la detección de animales importados, siguiente paso 3.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramecium+caudatum+enhances+transmission+and+infectivity+of+Mycobacterium+marinum+and+M.+chelonae+in+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Aquat+Organ%22%5BJournal%5D)">Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio.</a> Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).</li>
<li>Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vital+Relationship+Between+Nutrition+and+Health+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Limitaciones de las técnicas, pasos críticos y solución de problemas:
La edad, género, variedad y duración de la exposición de los centinelas no se estandardizan. Esto se muestra en la tabla 1. Hay muy poca investigación de peces por debajo de 6 meses de edad, o de peces. Puede haber algunos patógenos que afectan a los peces pequeños ya que hay algunos patógenos que son más frecuentes en la población mayores10,18,19,20. Del mismo modo, el género no se considera en la selección de algunos grupos de centinelas a pesar de un informe que existe un sesgo de género para algunos patógenos21. La técnica propuesta intenta abordar estas cuestiones, aunque la elección de la cepa podría realizarse según un patógeno específico para monitorear. Por ejemplo, TU podría ayudar a la detección de Mycobacterium spp.12,22, pero hay un riesgo de que los centinelas entonces actuaría como un reservorio o mostrar signos clínicos. En cuanto a la duración de la exposición, el enfoque del centro de recursos internacional pez cebra10 aumenta las posibilidades de detectar patógenos que podrían perderse con un período de contaminación inadecuadas. La necesidad de una exposición prolongada implica que los centinelas no son fácilmente disponibles. La adición de muestras ambientales permite cierta flexibilidad y la multiplicación de los eventos. Por ejemplo, muestreo puede ocurrir cada dos meses con un intervalo de 4 meses entre cada método de detección. Esto puede reducir el lapso de tiempo antes de que se detecta un patógeno recientemente introducido.
Las técnicas de proyección ambiental dependen de la detección de patógenos en el ambiente. Los patógenos se derramó por los peces y por lo tanto diluidos en el agua del sistema. No se exploró la posibilidad de capturar los patógenos por filtración de agua23 . Los métodos que describimos son eficaces sólo si patógenos se dan tiempo suficiente para multiplicar en el pescado y biofilm para llegar a un umbral de contaminación que permiten la detección. Esta limitación de las técnicas se reduce al mínimo por una selección crítica de los sitios de muestreo: los lodos en el tanque es muestreado en lugar de los lodos del colector de aceite y el agua y el biofilm se muestrean en la superficie del colector de aceite en lugar de en un tanque o filtración posterior. Sin embargo, todas las muestras desde el mismo sistema no da los mismos resultados. Resultados positivos para p. tomentosa pueden confirmarse mediante el uso de un ensayo (histopatología, PCR o análisis de lodos). Resultados positivos de PCR micobacterias pueden confirmarse por cultivo o por otro laboratorio. Sin embargo, cuando se establece un estado de salud, las muestras se recomiendan para confirmar resultados negativos de cualquier técnica de evaluación ambiental.
Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes y alternativas:
Mycobacterium spp son comunes en el medio ambiente y su presencia en el sumidero no predice su patogenicidad12. Mocho9 demostró que el control de las tasas de mortalidad es clave para el desarrollo de problemas de salud. El uso de muestras de animales sigue siendo esencial para cualquier investigación veterinaria. Vigilancia de la salud implica la detección de todos los patógenos prevalentes en una institución y esto no puede lograrse con el uso exclusivo de técnicas de proyección ambiental. Sin embargo, una falta de sensibilidad de las herramientas de diagnóstico puede retrasar o impedir el una descripción exacta de la situación de salud. Mientras que el uso de Centinelas reduce la cantidad de pescado necesaria para detectar un microbio prevalente en la población, la falta de sensibilidad agrega el peso a utilizar una combinación de métodos, incluyendo la proyección ambiental5,23. De hecho el estatus libre de patógenos específicos generalmente se define como la ausencia de una especie de la planta que muestras ambientales y animales deben probar negativos24,25.
El sumidero hisopo para identificar Mycobacterium spp. indican depender de muestras pueden conducir a un estado de falso negativos en la salud de peces. Las 6 especies de micobacterias probadas son descritas como patógenos o potencial patógeno en pez cebra15 y algunos no se eliminaría por desinfección superficial de huevo con cloro26 realizada como rutinario en cuarentena. Por lo tanto, los falsos negativos pueden tener algunas consecuencias para colaboradores que importación líneas. Por ejemplo, M. fortuitum se perdió por la PCR en muestras de pescado pero más de la mitad de la esponja de sumidero PCR había detectado. Considerando que estas micobacterias son más resistentes al cloro que otros y su capacidad de crecer en los sistemas de agua27, es un riesgo para las instalaciones de IMPORTADORA no contaminado. Para permitir la importación de líneas, los gerentes necesitan confianza y comparar los informes de salud de la planta exportadora con ellos. El programa de evaluación de desempeño de ICLAS28 es clave para ese proceso en roedores. La red RESAMA informa la detección de M. gordonae y M. mucogenicum en Francés D. rerio11. En los paneles de los laboratorios comerciales que utilizamos no se proponen estas micobacterias. Sería útil para ampliar el programa ICLAS y armonizar los análisis de diagnóstico así como la lista de especies patógenas29.
A. hydrophila es también un patógeno que tiene el potencial para ser introducido al importar animales, aunque su susceptibilidad al cloro30 hace su eliminación más probable durante la desinfección superficial de huevo rutina. El sumidero, hisopo y lodo resultados muestran que la proyección ambiental puede utilizarse para la detección de este patógeno. Otras bacterias como Mycobacterium spp han sido detectados en el lodo por PCR23. Este tipo de muestra es particularmente relevante ya que permite la detección de patógenos de la vertiente. Por ejemplo, otra aplicación es el análisis de lodo para p. tomentosapeces importados en cuarentena. El parásito es una amenaza para salud13 y neoplasia modelos16 animales. Por otra parte, las concentraciones de cloro utilizadas en desinfección de superficies de huevo de pez cebra de rutina no son eficiente31. Por lo tanto, la capacidad de los animales importados con un volumen de negocios de una semana y sin ninguna eutanasia de peces de la pantalla parece muy atractiva. Esta técnica puede influir en las reglas de cuarentena y bioseguridad que permite una clasificación de las importaciones. Un proceso de toma de decisiones entonces se diseña según los patógenos prevalentes en el centro de exportación, los patógenos detectados en las muestras de los pescados importados y el riesgo de comprometer el estado de salud del establecimiento importador10.
Futuras aplicaciones o indicaciones después de dominar estas técnicas:
Aunque el tratamiento de rutina de la cuarentena es la opción elegida, la eficacia de dicha medicación32,33,34,35,36 puede evaluarse con el análisis de lodos de dispositivo de reproducción. Más en general, la proyección ambiental podría ser utilizada para probar compuestos contra bacterias y parásitos erradicación, incluyendo en el biotopo de pescado. Otra aplicación de nicho de la evaluación ambiental es controlar la población del patógeno en el vivo37,38. Aunque la principal aplicación de estas técnicas es como un valioso aporte a la caja de herramientas de diagnóstico para la salud, vigilancia en las instalaciones de pez cebra. Gracias a una más exacta, costo y tiempo eficiente definición del estado de salud, hisopos de colector de aceite y análisis de lodo son complementarios a la vigilancia centinela y la práctica rutinaria de la cuarentena. De hecho, el futuro de estas técnicas debe ser una parte rutinaria de cualquier informe sobre la salud laboratorio acuático.

Con el fin de proteger la investigación y el bienestar de los animales1,2, se monitorea la presencia de patógenos dentro de las instalaciones animales. En el caso del pez cebra,3,4,5,6,7,8,9,10,11 de supervisión de estado a menudo se basa en animales analizados post mortem por la histopatología, bacteriología cultura o métodos moleculares. Pruebas solamente animales de Colonia no es el método recomendado por la cantidad de peces y gastos que serían necesarios para detectar patógenos de baja prevalencia. Por lo tanto, el método preferido es exponer un pequeño grupo de animales a una mayor carga de contaminantes. Estos peces se llaman centinelas de pre-filtración. Esta exposición dura meses e implica un aumento en la carga de trabajo de cuidador de animales o una solución de ingeniería específica. Otro desafío es la proyección de líneas importadas en cuarentena donde los animales fértiles son para mantenerse vivo y esto no es compatible con los ensayos de rutina en las canales.
Aquí describimos algunos métodos para detectar algunos patógenos de peces cebra (a. hydrophila, Mycobacterium spp. y p. tomentosa) por detección de medio ambiente del sistema acuático. El objetivo es reducir el número de peces utilizados para la vigilancia de la salud y para optimizar el volumen de ventas, el costo y la sensibilidad de la detección. Tales métodos son una alternativa al uso de animales y algunas técnicas pueden ser aplicadas a las importaciones de detección en cuarentena. Por ejemplo, Mocho9 fue capaz de identificar más especies de micobacterias patógenas mediante la realización de PCR en hisopos de colector de aceite en lugar de pez cebra (incluidos los centinelas) y esto se obtuvo con menos muestras. En ese mismo estudio, p. tomentosa huevos fueron detectados con más sensibilidad por el lodo del tanque mediante flotación y microscopia electrónica de detección en el lugar de prueba peces por PCR y la histopatología.
La tabla 1 resume las diversas características de sentinel programas3,4,5,6,7,8,9,10 utilizado por un número de instalaciones de pez cebra. Posterior filtración centinelas reciben agua de la misma manera que cualquier pez de la Colonia mientras que centinelas de pre-filtración reciben agua una vez que ha circulado a través de los tanques de pescados Colonia primero. Por ejemplo, centinelas de la prefiltración pueden configurarse en el sistema de recirculación continua recibiendo agua del colector de aceite. Esto no puede ser una opción cuando hay muchos sistemas independientes en una habitación. En este caso, puede utilizarse un tanque de centinelas de pre-filtración para toda la habitación. Los centinelas están en un depósito estático, el sistema de recirculación, y el agua se cambia regularmente, usando sólo agua pre-filtración es decir, agua de sumidero de todos los sistemas en la sala. Esta técnica se describe a continuación como base para la comparación con la eficacia de la investigación ambiental. El montaje propuesto está diseñado para controlar problemas de calidad de agua como una disminución del pH o una contaminación de nitrógeno.
El concepto de la proyección ambiental bacteriana se basa en la hipótesis de que las bacterias son detectables en biofilm tales como los encontrados en la pared del colector de aceite en la superficie del agua o en el lodo en el fondo de un tanque. El colector de aceite parece un punto de muestreo ideal en un sistema de recirculación acuícola ya que recoge residuos (agua, heces, alimentos y otro material orgánico) de todos los tanques pre filtración. La superficie del colector de aceite es a menudo fácilmente accesible, el aplicador es rápido y puede realizarse de forma aséptica para evitar la contaminación cruzada de la muestra (de guantes por ejemplo). El concepto se utiliza para identificar frecuentes patógenas Mycobacterium spp en el pez cebra sistemas9,12. A continuación se describe la técnica y también estamos divulgando la detección de : a. hydrophila en pez cebra sumidero superficial torundas y lodos.
La investigación ambiental para huevos del parásito se basa en la detección por Murray et al. 13 y la técnica de flotación se utiliza rutinariamente para Parasitología y examen microscópico de huevos del parásito en las heces de14. Mocho9 propuso una alternativa al proceso de toma de muestras y demostró que la técnica podría utilizarse para detectar otras especies del biotopo de pescado. Infectados D. rerio pasar p. tomentosa huevos con sus heces y los huevos del parásito quedan en la parte inferior del tanque, en el lodo. Pueden recoger allí debido a su densidad mayor que el agua. La densidad de los huevos se utiliza para procesar la muestra ambiental también. Una primera flotación con centrifugación separa agua y la luz de la ruina de la materia más pesada. Una segunda centrifugación se basa en la solución saturada de azúcar (con una densidad mayor que la densidad de huevos de p. tomentosa ) para permitir que los huevos del parásito a emerger en la superficie del tubo.
La proyección para las bacterias de la biopelícula y p. tomentosa de la parte inferior del tanque se puede combinar mediante la realización de PCR para todos estos patógenos en el sedimento de la muestra de lodo obtenido después de la primera centrifugación. Esto optimiza el tiempo de muestreo. El método se describe a continuación. También proponemos a usar estas técnicas en un contexto de cuarentena. Para pantalla de pez cebra adulto importada que necesita para mantenerse vivo, se inserta un dispositivo de reproducción para el tanque de cuarentena. Después de una semana, heces y otros materiales de desecho en el dispositivo de reproducción son recogidos y examinados por microscopia o PCR. A continuación se describe la técnica y algunos huevos de p. tomentosa fueron detectados por microscopía en este contexto.

<table><tbody><tr><td>Aqua-Sed 250 mL</td><td>Vetark</td><td></td><td>2-fenoxietanol</td></tr><tr><td>Tubo Estéril Dryswab Punta</td><td>mwe</td><td>MW100</td><td>Superficie de sumidero</td></tr><tr><td>BD Plastipak Jeringa Desechable 50mL Excéntrico</td><td>Becton Dickinson</td><td>300866</td><td>Son en realidad graduados a 60 ml Tubo de</td></tr><tr><td>centrífuga 15 mL Corning Corning</td><td>430766</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa Centaur 2 con 4 x 200 mL Swing&ndash; Rotor de salida (sin sellar)</td><td>Sanyo</td><td>MSB020. CX1.5</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio 22 mm x22 mm</td><td>Menzel-Glaser</td><td>MNJ-350-020H</td><td></td></tr><tr><td>Hisopo liso Aplicador de plástico estéril Tapón blanco con punta de rayón</td><td>Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific</td><td>F155CA</td><td>Hisopo sedimento de lodo</td></tr><tr><td>50 mL Tubo de centrífuga autónomo CentriStar Cap</td><td>Corning</td><td>430921</td><td></td></tr><tr><td>Juego de bandejas de desove en el tanque</td><td>MBK Installations Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

proyección ambiental de hydrophila de la aeromonasy mycobacterium spp. pseudocapillaria tomentosa en los sistemas de pez cebra

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

Sistemas de monitoreo de salud desarrollados y utilizados en instalaciones de investigación de pez cebra porque patógenos de Danio rerio como Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. y Pseudocapillaria tomentosa tienen el potencial de perjudicar la investigación y el bienestar de los animales. Los peces son típicamente análisis post mortem para la detección de microbios. El uso de Centinelas es una forma sugerida para mejorar la sensibilidad de la vigilancia y reducir el número de animales a la muestra. Se describe la configuración de un tanque de centinela de la prefiltración de un sistema de recirculación. La técnica se desarrolla para evitar la contaminación del agua y para representar a la población de peces por una cuidadosa selección de cepas, edad y género. Para poder utilizar el mínimo número de animales, también se detallan técnicas para el medio ambiente. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en frotis de la superficie del colector de aceite se utiliza para mejorar significativamente la detección de algunas especies de micobacterias frecuentes y patógenas como Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumy Mycobacterium chelonae. Otro método ambiental consiste en el procesamiento de los lodos en el fondo de un tanque o sumidero para buscar huevos de p. tomentosa . Se trata de una técnica barata y rápida que puede ser aplicada en cuarentena si un dispositivo de reproducción está sumergido en el depósito de animales importados. Finalmente, PCR se aplica a la muestra de lodo y a. hydrophila se detecta del sumidero fondo y superficie. Por lo general, estas técnicas de proyección ambiental aplicadas a estos patógenos específicos han conducido a un aumento de la sensibilidad en comparación con la prueba de centinelas de la prefiltración.

Los beneficios de los hisopos de sumidero para identificar frecuentes spp. de Mycobacterium en comparación con las muestras de peces son compatibles con los resultados en la figura 4. De 115 peces probados, M. chelonae y M. haemophilum se detectaron en el 5% y 3% de las muestras, respectivamente. No hay otras especies de micobacterias patógenas fue identificado. De los mismos sistemas, 49 hisopos de sumidero revelaron la presencia de 5 especies micobacterianas. Cociente de las probabilidades se calculan con la hipótesis de que M. chelonae y M. fortuitum se detectan con más frecuencia por PCR en las muestras de superficie del colector de aceite que en la muestra de pescado. Esto es estadísticamente significativo con momios respectivos de 11 (IC del 95%: 4 a 29; p < 0.0001) y 306 (IC del 95%: 18 a 5208; p = 0.0001). Los resultados muestran que la técnica de hisopo de superficie del colector de aceite es una alternativa valiosa para el uso exclusivo de centinelas a pantalla de la instalación de peces cebra para Mycobacterium spp. Las muestras ambientales fueron también utilizadas para detectar : a. hydrophila. Estas bacterias fueron detectadas en peces, lodo y muestras de superficie (figura 4). Esto también apoya la capacidad de las técnicas propuestas para el biotopo de peces de la pantalla.
En relación con el análisis de lodo para detectar huevos de p. tomentosa , Mocho9 detectó el parásito en el 27% de las muestras de pescado mediante PCR y la histopatología mientras que los huevos fueron detectados en el 93% de los lodos analizados desde el mismo sistema. Aquí, la técnica fue desafiada para reproducir la proyección de la cuarentena. En este contexto, no pueden ser muestreados animales importados, y evaluar su estado de salud de manera oportuna ayuda a la gestión de la bioseguridad. Pescado desconocido del estado de salud de un centro positivo de la p. tomentosa fijaron en 8 depósitos con Aparatos encubadoras: máximo del tanque de pescados/13 L 16, 7 transgénicos y línea 1 tipo salvaje, mezcla de género, de 4-24 meses de edad. El lodo fue cosechado de los dispositivos después de una semana y analizaron por microscopia. Huevos de p. tomentosa fueron vistos en 7 muestras (88%). Por último, la detección de la polimerización en cadena del parásito fue ensayada en hisopos de colector de aceite y sedimentos de lodos. muestras de lodo de 4 clientes de los 6 fueron PCR positivo y todos los resultados eran negativos para los hisopos superficiales. Esto no es sorprendente puesto que la proyección del lodo depende de la capacidad de los huevos caen al fondo del tanque. Esto demuestra que las técnicas de análisis de lodos pueden utilizarse para acuarios de D. rerio para infestación por p. tomentosa y que los métodos pueden ser adaptados para la proyección de animales importados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig1.jpg"> Figura 1: tanque de pre-filtración Centinela del sistema de recirculación. Un tanque de 8 L se llena de agua y bio-medios de comunicación de los colectores de aceite de los sistemas de pantalla. Los dos granos blanco cerámica bio-los medios de comunicación se sientan en la parte inferior del tanque (en el centro de la imagen). 12 peces son seleccionados según su género, edad y tensión, y se agregan al tanque de centinela. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig2.jpg"> Figura 2: huevo de p. tomentosa detectado durante el análisis de lodo por microscopia. Aumento utilizado fue de 400 X. Las flechas indican los enchufes bipolares. Barra de escala = 50 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig3.jpg"> Figura 3: dispositivo de cría sumergida en un tanque de retención de peces para recolectar lodo para análisis. Este tanque se encuentra en un banco con el fin de la imagen; de lo contrario, se encuentra en el sistema de recirculación. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig4.jpg"> Figura 4: Porcentaje de identificación de Mycobacterium spp., a. hydrophilay p. tomentosa por PCR en peces, superficie hisopos del colector de aceite y del colector de aceite lodos. Porcentaje se obtiene dividiendo el número de resultados positivos para cada especie de patógeno por el número de las muestras. El porcentaje de resultados positivos es dado por el tipo de muestra como pescado, superficie o lodo e indicado después del nombre de las bacterias. 115 peces y 49 de superficie del colector de aceite se analizaron por PCR para la identificación de Mycobacterium spp. Los datos se compilan con resultados de Mocho9 ya que es una extensión de este estudio. Los pescados son principalmente la prefiltración centinelas según protocolo sección 1. En raras ocasiones, cuando los centinelas no estaban disponibles, fugitivos y antigua colonia de pescado (> 18 meses) fueron muestreados. Todos los sistemas probados para Mycobacterium spp fueron probados en palitos de pescado y del colector de aceite. Cociente de las probabilidades se calculan con la hipótesis de que M. chelonae y M. fortuitum se detectan con más frecuencia por PCR en las muestras de superficie del colector de aceite que en la muestra de pescado. Esto es estadísticamente significativo con momios respectivos de 11 (IC del 95%: 4 a 29; p < 0.0001) y 306 (IC del 95%: 18 a 5208; p = 0.0001). Marinum de la micobacteria PCR fue negativa para todas las muestras y es considerado por lo tanto ausente de estas instalaciones y no incluido en el análisis. 12 peces, 14 frotis de superficie del colector de aceite y colector de aceite 6 lodo se analizaron por PCR la presencia de : a. hydrophila. 6 colectores fueron probados para la presencia de p. tomentosa en la superficie y en el lodo. PCR = reacción en cadena de polimerasa. IC = intervalo de confianza. * y ** indican significación estadística; otras comparaciones no fueron estadísticamente significativas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55306/55306vid1.jpg"> Video 1: exploración de un huevo de P. tomentosa con el microscopio. La diapositiva se obtiene del análisis de lodos como se describe en el paso 3.1. El campo es escaneado para detectar un huevo de p. tomentosa. Una vez que se reconoce una estructura, es ampliada para confirmar la identificación en una resolución más alta. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/video_scan_for_egg.avi" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Autores</td>
			<td>Edad al inicio de la exposición</td>
			<td>Duración de la exposición</td>
			<td>Edad de muestreo</td>
			<td>Pre o Post filtración</td>
			<td>Género</td>
			<td>Cepas de positivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Barton et al. 3
</td>
			<td>4 meses</td>
			<td>6 meses</td>
			<td>10 meses</td>
			<td>Filtración previa</td>
			<td>N / A</td>
			<td>N / A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Borges et al. 4
</td>
			<td>6 meses</td>
			<td>6 meses</td>
			<td>12 meses</td>
			<td>Filtración previa</td>
			<td>N / A</td>
			<td>Tipo AB</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collymore et al. 5
</td>
			<td>Tan joven como sea posible</td>
			<td>3 meses</td>
			<td>< 6 meses</td>
			<td>Filtración previa</td>
			<td>N / A</td>
			<td>N / A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geisler et al. 6
</td>
			<td>4 meses</td>
			<td>4 meses</td>
			<td>8 meses</td>
			<td>Pre y post filtración</td>
			<td>N / A</td>
			<td>Tipo AB</td>
		</tr>
<tr>
<td>Liu et al. 7
</td>
			<td>3 meses</td>
			<td>1-6 meses</td>
			<td>4-9 meses</td>
			<td>Pre y post filtración</td>
			<td>N / A</td>
			<td>Tipo salvaje</td>
		</tr>
<tr>
<td>Martins et al. 8
</td>
			<td>3 meses</td>
			<td>3 meses</td>
			<td>6 meses</td>
			<td>Filtración previa</td>
			<td>N / A</td>
			<td>Tipo salvaje</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mocho9
</td>
			<td>< 6 meses, 6 - 12 meses, > 18 meses</td>
			<td>4 meses</td>
			<td>7 - 24 meses</td>
			<td>Filtración previa</td>
			<td>1 hembra y 1 macho de cada grupo de edad</td>
			<td>Tipo AB</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murray et al. 10
</td>
			<td>3-4 meses</td>
			<td>3 meses, 6 meses, 1 año</td>
			<td>7, 10 y 16 meses</td>
			<td>Pre y post filtración</td>
			<td>N / A</td>
			<td>Tipo AB</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: comparación de ajustes de centinela en pez cebra instalaciones. Los peces centinela pueden ser seleccionados según su edad, género o tensión. Se exponen por un período definido y reciben agua del sistema antes o después de la filtración. Los datos se compilan de la edición especial de 2016 en la salud de los peces cebra diario3,4,5,6,7,8,9, 10.

Este protocolo describe el uso de hisopos de colector de aceite y análisis de lodos de sistemas de pez cebra, que conduce a aumento de detección en comparación con el uso de centinelas para detectar patógenos como Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., Pseudocapillaria tomentosa. También se propone un sistema para controlar la p. tomentosa huevos en cuarentena.

Proyección ambiental de hydrophila de la Aeromonasy Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa en los sistemas de pez cebra

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, ...

El objetivo general de esta técnica de muestreo es reducir el número de peces utilizados para la vigilancia sanitaria y optimizar el tiempo de rotación, el costo y la sensibilidad en la detección de patógenos, incluso durante el tamizaje de importaciones en cuarentena. Esta técnica ayuda a definir el estado sanitario de las colonias de refugio. Este método constituye una herramienta útil al leer o evaluar la eficacia del tratamiento. Una ventaja principal de esta técnica es el cribado y triage de importaciones en cuarentena. Fortalece el plan de bioseguridad de la instalación acuática. Para comenzar el protocolo, coloque un tanque limpio de ocho litros fuera de un sistema de recirculación.Llene el tanque con aproximadamente ocho litros de agua procedente de sumideros. Añada dos cuentas cerámicas o cubos de esponja de biomedia provenientes de los sistemas para tamizado. A continuación, añada uno o dos Danio rerio por litro, utilizando peces de tipo silvestre con el fondo genético dominante en la instalación, por ejemplo AB. Seleccione al menos seis peces.Alimente a los peces una vez al día. Varíe las dietas para asegurarse de que los peces centinela estén expuestos a todas las dietas utilizadas en la instalación de pez cebra. Para realizar el cambio de agua, transfiera los peces centinela en el biomaterial a un tanque temporal.Vacíe completamente el tanque de vigilancia y límpielo. Vuelva a llenar el tanque de vigilancia solo con agua de sump y coloque nuevamente los peces de vigilancia y el biomaterial. Después de exponer los peces de vigilancia al agua de sump durante cuatro meses, sacrifique los peces mediante un método aprobado, como la inmersión en una solución sobredosificada de 2-fenoxyetanol.Para confirmar la muerte, espere diez minutos después de la cesación del movimiento del opérculo. Tome el cadáver con pinzas y congélelo completamente a menos 80 grados Celsius en un recipiente identificado. Prepare una torunda estéril seca con vástago de plástico y póngase guantes.Localice la superficie que se va a frotar. Elija una superficie del sumidero con flujo bajo, la pared del sumidero a nivel de la superficie del agua, y retire cualquier objeto que impida el acceso fácil a la superficie. A continuación, retire el hisopo de su funda quitando el envoltorio externo y exponga la punta de algodón estéril al aire.Frote la pared del sumidero durante cinco a 10 centímetros para absorber el agua y la biopelícula a nivel de la superficie del agua en el sumidero. Luego, introduzca nuevamente la punta del hisopo en su funda o rompa la punta dentro de un tubo estéril para centrífuga. Etiquete la muestra y envíela para pruebas de PCR o congélela a menos 80 grados Celsius.Para realizar el análisis de lodos mediante microscopía, utilice una jeringa de 60 mililitros para aspirar el lodo del fondo de un sumidero. Divida la muestra en tubos de 15 mililitros. Coloque las tapas enrosca y rotule los tubos.Centrifugar los tubos de 15 mililitros a 175-250 veces la gravedad durante diez minutos en una centrífuga con cubetas oscilantes. Verter el contenido de los tubos. Después de verter, conservar los sedimentos.A continuación, prepare la solución saturada de azúcar mezclando 227 gramos de azúcar granulada y 177 mililitros de agua caliente con un agitador magnético. Llene los tubos hasta la mitad con la solución saturada de azúcar. Coloque las tapas y mezcle bien el sedimento con la solución.Coloque los tubos en las cubetas giratorias del centrífugo y llénelos hasta arriba con la solución saturada de azúcar. Coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior de cada tubo de modo que haga contacto con la solución saturada de azúcar. Tenga en cuenta que los cuatro tubos para cada muestra de 60 mililitros están previstos en caso de que algún cubreobjetos caiga y se rompa durante la centrifugación.Una vez finalizada la centrifugación, levante el cubreobjetos y colóquelo sobre un portaobjetos, luego etiquete el portaobjetos con un lápiz o un marcador. En caso de que ocurran demasiadas roturas de cubreobjetos, llene la mayor parte del tubo con la solución saturada de azúcar y centrifugue el tubo. Llene hasta el borde con la solución saturada de azúcar, coloque suavemente el cubreobjetos y espere 30 minutos.Busque los huevos de Pseudocapillaria tomentosa con el microscopio. Identifique los tapones bipolares a un aumento de 400X. Para detectar animales importados en cuarentena en busca de huevos de P. tomentosa, coloque machos y hembras de Danio rerio en un tanque y agregue la bandeja de desove en el tanque, pero utilícela aquí para recolectar heces.Después de una semana, retire el dispositivo de cría y recolecte el lodo acumulado en el dispositivo de cría según se describió anteriormente. Aspire el lodo del fondo de un tanque o sumidero con una jeringa de 60 mililitros y transfiera la muestra a un tubo de 60 mililitros. Cierre el tubo con su tapa roscada y etiquete el tubo.Deseche la jeringa. Agite el tubo de 60 mililitros y transfiera 15 mililitros a un tubo de 15 mililitros. Cierre el tubo con su tapa roscada y etiquete el tubo.Centrifugar el tubo de 15 mililitros a 175-250 ×g durante diez minutos en una centrífuga con canastas oscilantes. Verter el sobrenadante y conservar el sedimento en el tubo. Retirar la funda del hisopo eliminando el envoltorio externo y exponer la punta de algodón estéril al aire.Hisar el sedimento en el tubo durante 15 segundos. Volver a colocar la punta en su funda o romperla dentro de un tubo estéril para centrífuga. Etiquetar la muestra.Congelar a menos 80 grados Celsius y enviar para pruebas de PCR. Mediante el método de hisopo de sump, de 115 peces analizados, Mycobacterium chelonae fue detectado en el cinco por ciento y Mycobacterium haemophilum en el tres por ciento de las muestras, siendo las únicas especies patógenas identificadas. De los mismos sistemas, 49 hisopos de sump revelaron la presencia de cinco especies de Micobacterias.Las razones de odds muestran que la técnica de hisopado del sumidero superficial es una alternativa valiosa al uso exclusivo de peces centinela para el tamizaje de Mycobacterium en las instalaciones de pez cebra. Las muestras ambientales también se utilizaron para el tamizaje de Aeromonas hydrophila, que se detectó en peces, lodo y muestras superficiales, lo que respalda la capacidad de las técnicas propuestas para evaluar el biotopo de los peces. Mycobacterium chelonae y Mycobacterium fortuitum se detectan con mayor frecuencia mediante PCR en los hisopados del sumidero superficial que en las muestras de peces.Una vez dominada, la toma de muestras lleva solo unos minutos y la detección de huevos de Pseudocapillaria tomentosa puede realizarse en una hora. Esta técnica convierte el tamizaje ambiental en una parte fundamental del programa rutinario de monitoreo de salud. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patología de peces, como la relación entre el biofilm bacteriano y la infección bacteriana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Biología

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Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; En embriones de pez cebra

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