Name: El uso de cultivos de neuroesferas primarias estudian primaria cilios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a utilizar cultivos de neuroesferas primarias para estudiar la biogénesis y el tráfico de cilios primarios en células madre y progenitoras neuronales. Este método permite analizar vías ciliares en contexto celular.

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El trabajo en el laboratorio de S.M. está financiado por becas de reclutamiento de CPRIT (R1220) y NIH (1R01GM113023-01).

1. Aislamiento de neuroesferas del cerebro de ratón adulto <ol><li> La eutanasia a un ratón adulto (alrededor de 2 meses de edad) por una sobredosis de isoflurano. Vuelva a comprobar que el ratón ha dejado de respirar y diseccionar inmediatamente después de la muerte. </li><li> Con unas tijeras, hacer una incisión en la línea media para abrir el cráneo. Retire el cerebro. </li><li> Coloque el cerebro en PBS frío en un plato de 10 cm en hielo. Siga todo el montaje el método de disección para obtener la SVZ desde el ventrículo lateral 48. </li><li> Coloque el ventrículo lateral en un tubo de 1,5 ml, añadir 500 l de 0,05% de tripsina-EDTA en PBS, y se incuba el tubo durante 15 min a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Después de 15 min, añadir 500 l de medio de frenado y pipetear suavemente 20 - 30 veces con una punta de 1 mL. Evitar la formación de burbujas de aire durante el pipeteado. NOTA: Este paso es fundamental para la supervivencia celular. </li><li> Centrifugar las células a 500 xg durante 8 min. Descartar el sobrenadante, se añade 1 ml de PBS, y resuspender tél células pipeteando con suavidad 5x con una punta de 1 ml. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 8 min. Descartar el sobrenadante usando una punta de 1 ml y añadir 1 ml de medio basal. </li><li> (Opcional) Si se observan restos celulares, pasar las células a través de una célula colador de 70 m. </li><li> Contar el número de células con un hemocitómetro; En general, aproximadamente 30.000 - se obtienen 60.000 células / SVZ. </li><li> Placa de las células de un SVZ en una placa de 10 cm con 10 ml de medio y la cultura NSC a 37 ° C con 5% de CO2. </li><li> (Opcional) Para evitar la fusión entre las esferas 49, poner 1.000 células en un único pocillo de una placa de ultra-bajo de unión de 6 pocillos que se llena previamente con 1,5 ml de medio y la cultura NSC a 37 ° C con 5% de CO2. NOTA: Después de 5-7 días, las neuroesferas se pueden observar (Figura 2A). El período de cultivo puede variar con la edad de ratón o los antecedentes genéticos. </li><li> Añadir 2 ml de medio NSC cada 34 días para mantener la cultura(No retire el medio existente). </li></ol> 2. Análisis de la capacidad de diferenciación de las Pruebas de neuroesferas y ciliogenesis <ol><li> Para analizar la capacidad de diferenciación, analizar las neuroesferas en condiciones adherentes en medio de diferenciación. </li><li> Esterilizar 12 mm cubreobjetos redondos por tratamiento en autoclave o con la exposición UV antes de su uso. Para un cultivo de células adherentes, poner una cubierta de vidrio redonda esterilizado 12 mm en un pocillo de una placa de 24 pocillos bajo condiciones asépticas. </li><li> Escudo de la cubierta de vidrio durante 10 s con 500 l de 0,002% de poli-L-lisina (PLL). Aspirar la solución y se seca durante 10-15 min. </li><li> Añadir 500 l de solución de laminina (5 g /? L). Incubar la cubierta de vidrio durante 1 h a 37 ° C. </li><li> Aspirar el laminina y añadir 500 l de medio de diferenciación o medio NSC (control no diferenciado). </li><li> Para el ensayo de diferenciación, recoger un 100 - esfera m 200 con una punta de 200 l bajo el microscopio. Añadir5-10 neuroesferas a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y la cultura durante 7-10 días en medio de diferenciación. </li><li> Para analizar neuroesferas indiferenciadas, añadir 5-10 neuroesferas a cada pocillo de una placa y cultivo de 24 pocillos durante 1-2 días en medio NSC. Neuroesferas adjuntos propagan y crecen como una monocapa (Figura 2B). </li><li> Después de retirar cuidadosamente el medio, fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS durante 15 min a TA, y luego lavar con PBS dos veces durante 5 min a RT. La placa puede almacenarse a 4 ° C durante 1-2 meses. NOTA: Para visualizar las células madre / progenitoras neurales en medio NSC y células diferenciadas en medio de diferenciación, lleve a cabo la inmunotinción contra Nestin (tallo neural / marcador de células progenitoras), β-tubulina III (monoclonal Tuj1, marcador neuronal), GFAP (proteína glial fibrilar ácida , marcador de astrocitos), y O4 (marcador de oligodendrocitos) (Figura 2B-e). Para el análisis de los cilios, lleve a cabo la inmunotinción contra Arl13b (ci primarialia marker) y Gpr161 (GPCR ciliar) (Figura 3). </li><li> Montar la cubierta de vidrio con una solución de montaje en un portaobjetos de vidrio. Incline el portaobjetos de vidrio para eliminar el exceso de solución. </li></ol> 3. Análisis de ciliogenesis en Neurospheres <ol><li> Para analizar las células en neuroesferas intactas por inmunotinción, la transferencia de 1 ml de medio de cultivo que contiene múltiples neuroesferas a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 500 xg durante 8 min. Fijar las esferas con 4% (PFA) después de retirar el medio durante 15 minutos y lavar con PBS. Centrifugar esferas a 500 xg durante 8 min, eliminar el sobrenadante, y se incuba las esferas O / N con 30% de sacarosa a 4 ° C. </li><li> Descartar el sobrenadante usando una punta de 1 ml y añadir 500 l de solución de octubre usando una punta de corte 1 mL. Corte el borde de la punta para ensanchar la abertura, como OCT es viscoso. </li><li> Transferir la solución octubre que contiene las neuroesferas en un molde de plástico de congelación desechable (10 mm x 10 mm x 5 mm). </li><li> Congelar la mviejo en hielo seco durante al menos 15 min. </li><li> (Opcional) detener el experimento y almacenar el molde en un congelador a -80 ° durante hasta 1 año. </li><li> Cortar las secciones con un criostato; el espesor de las secciones debe ser de 15-30 m. </li><li> Para visualizar los cilios primaria en un neurosphere, lleve a cabo la inmunotinción contra Arl13b (Figura 4). </li></ol> 4. Cultura y aprobación de neuroesferas y NSC adherentes <ol><li> Passage las neuroesferas mientras que el tamaño de la esfera es de entre 100-200 micras; cuando las neuroesferas son demasiado grandes (300 micras o superior), no son ideales para los experimentos. </li><li> Transferencia de las neuroesferas en un tubo de 50 ml con una punta de 1 ml y centrifugar a 500 xg durante 8 min. </li><li> Descartar el sobrenadante utilizando un aspirador, añadir 500 l de 0,05% de tripsina-EDTA en PBS, y se incuba durante 5 min a 37 ° C. La cantidad de tripsina varía en función del número de esferas. </li><li> Añadir 500 l de medio de suero y suavemente tuberíaT 20 veces con una punta de 1 ml. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 8 min. Descartar el sobrenadante usando una punta de 1 ml y añadir 1 ml de medio basal. </li><li> (Opcional) Si se observan residuos celulares o no disociadas neuroesferas, pasar las células a través de una célula colador de 70 m. </li><li> Passage las células en una placa de 10 cm a una densidad de 10.000 células / cm2 en medio NSC; las células estarán listos para el siguiente paso después de una semana. </li><li> (Opcional) Para congelar las células, añadir medio de congelación para generar 500.000 a 1.000.000 células / ml de suspensión. Congelar las células utilizando recipientes crio-congelación; neuroesferas disociadas También se pueden congelar. </li><li> Para el cultivo adherente, dillute las células a 50.000 células / cm 2 en PLL- y cubreobjetos con medio de NSC, y la cultura recubiertas con laminina durante 1-2 días. </li></ol> 5. El hambre y el análisis de los cilios <ol><li> Preparar medio de inanición (Tabla 1). </li><li> 1-2 días después de la pl inicialating de células adherentes después de la disociación, el cambio de medio NSC en un pocillo (control) y medio de inanición en otro pozo (experimento). </li><li> Cultivar las células adherentes durante 24 h. </li><li> Fijar las células con PFA al 4% en PBS durante 15 min a TA y se lava dos veces con PBS durante 5 min cada uno a TA. </li><li> (Opcional) detener el experimento y almacenar las placas de 24 pocillos con cubreobjetos en PBS a 4 ° C durante 1-2 meses. </li><li> Realizar un protocolo de inmunofluorescencia para la tinción de 7, 50. </li><li> Montar el cubreobjetos utilizando solución de montaje. Secar el portaobjetos de vidrio O / N a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Adquirir imágenes en un microscopio compuesto en la ampliación necesaria. Utilizar un microscopio, una cámara y objetivos (40X / 63X 1.3 de petróleo y / 1.4 aceite), controlado mediante el software acompañado. Tome suficientes secciones Z en 0,5-0,8 m intervalos (Figura 5). </li><li> Para el análisis cuantitativo de la localización ciliar enlas células adherentes, adquieren pilas de imágenes de 3-8 campos consecutivos con células confluentes mirando en el canal de DAPI. Cuantificar el número de cilios primarios usando ImageJ / Fiji. Típicamente, utilice la herramienta &quot;contador de células&quot; en el ImageJ Plugins&gt; cuadro de diálogo para contar las células con cilios GPCR-positivo Analizar; proyecciones máximas de pilas de imágenes también se pueden exportar desde ImageJ / Fiji.Use intensidad de la imagen similar y parámetros de contraste para todas las imágenes desde el mismo experimento para contar y propósitos de exportación. </li></ol> 6. La transfección de neuroesferas <ol><li> Adherir disociarse células para cubreobjetos durante 24 h. Utilice una densidad celular típicamente entre 75.000 y 150.000 células en 500 l de medio NSC en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Mezclar 25 l de medio de suero reducido y 1,5 l de reactivo de transfección en un microtubo ml 0,5 por agitación durante 5 s. </li><li> Añadir 2,5 g de ADN plasmídico sin endotoxina a un separado 0,5 ml microtube que contiene 25 l de medio de suero reducido y mezclar mediante agitación durante 5 s. </li><li> Añadir 1 l de reactivo de transfección a la segunda ADN microtubo que contiene y mezclar mediante agitación durante 5 s. </li><li> Añadir la mezcla del tubo que contiene ADN a la primera microtubo y se mezcla mediante pipeteo. </li><li> Incubar la mezcla durante 10-15 min a TA. Después de la incubación, añadir gota a gota suavemente la mezcla de transfección a los pocillos en la parte superior del medio de NSC (500! L / pocillo). </li><li> Cambiar el medio 24 h post-transfección para controlar medio (medio NSC) o medio de inanición (500! L / pocillo). </li><li> Fijar las células cambiando el medio a 4% PFA después de 24 h y llevar a cabo la inmunotinción; típicamente, hasta una eficiencia de transfección del 10% se obtiene usando este protocolo. </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

A continuación, se describe un método para generar y mantener los cultivos de neuroesferas de SVZ ratón adulto. Unos pocos puntos pertinentes con respecto a los cultivos son las siguientes. En primer lugar, los tamaños de las esferas son típicamente entre 50 - 200 micras. En nuestra experiencia, cuando un neurosphere se hace más grande de 300 m de diámetro, el momento óptimo para los pases se ha perdido. Estas esferas grandes contienen las células muertas en el núcleo. En segundo lugar, como neuroesferas se utilizan com...

El cilio primario es un compartimento subcelular dinámica basada en microtúbulos que funciona como una antena sensorial en la coordinación de vías de señalización celulares, incluyendo la vía de Sonic Hedgehog (Shh) durante el desarrollo neuronal embrionario 1, 2, y la señalización subcelular compartimentada en la función neuronal adulto 3, 4 . Señalización de componentes de estas vías, tales como el receptor de Shh Patched 5; el activador vía de Smoothened (Smo) 6; y Gpr161 7, un receptor acoplado a proteína G huérfano (GPCR) que regula negativamente la vía de Shh, localizar a los cilios de una manera dinámica. Múltiples GPCRs se han reportado para localizar a los cilios en las neuronas en el cerebro 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Los defectos en los cilios y vías de señalización generada cilios-afectan a múltiples tejidos y se conocen colectivamente como ciliopatías 17, 18, 19. El espectro de la enfermedad ciliopathy incluye con frecuencia defectos del neurodesarrollo, tales como anomalías craneofaciales 20, 21, 22. Además, los cilios primarios en las neuronas hipotalámicas regular las vías centrales de saciedad, y los defectos resultan en obesidad central 23, lo que refleja la obesidad en ciliopatías sindrómicas como el síndrome de Bardet Biedel 24. Además, el neuropéptido señalización en cilios receptor regula central saciedad vías de 11, 14. Localización ciliar de adenilil ciclasa III (ACIII) y GPCRs, tales como receptores de somatostatina 3 en las neuronas del hipocampo como resultado nuevas defectos reconocimiento de objetos y los déficits de memoria 25, 26 y es paralelo a una falta de integridad ciliar 27. Los aspectos de desarrollo de la señalización generada cilios-están estrechamente ligados a la homeostasis del tejido; en particular, los cilios son importantes para la progresión de los meduloblastomas Shh subtipo que surgen a partir de progenitores granulares en el cerebelo 28, 29. Por lo tanto, los cilios primarios juegan un papel importante durante embrionario, postnatal y adulto el desarrollo neuronal y función. Las células madre neurales (NSC) residen en la zona subventricular (SVZ) del ventrículo lateral, la zona subgranular del giro dentado del hipocampo, y lazona ventricular del tercer ventrículo en el hipotálamo en mamíferos 30, 31, 32. NSC son multipotentes, poseen la capacidad de auto-renovación, y son importantes para el desarrollo del cerebro y la medicina regenerativa 30. La mayoría de NSC en la SVZ son quiescentes y poseen un cilio primario solitario que, en muchos casos, se extiende hacia fuera al ventrículo lateral 33. Las señales cilio primario a través de la localización de diversos receptores, la inducción de respuestas celulares aguas abajo, particularmente en relación con Shh, TGF, y las vías de tirosina quinasa del receptor 2, 34, 35, 36. Desde cilios primarios se extienden en el ventrículo lateral, se plantea la hipótesis de que los cilios primarios detectar citoquinas en el líquido cefalorraquídeo (CSF) para activar NSCs 37 </sarriba&gt;. Estudios recientes sugieren que la vía de señalización de Shh y cilios primarios son críticos para la activación de las células madre en la reparación y la regeneración de múltiples tejidos, incluyendo el epitelio olfativo, pulmón, y riñón 38, 39, 40, 41. Sin embargo, los mecanismos por los que CSF se comunica con NSCs y si los cilios primarios están implicados no son conocidos. NSCs adherentes en cultivo se ciliadas; localizar componentes de la vía de Shh, tales como Smo y Gpr161 en cilios; y son Shh sensible 42. Por lo tanto, NSCs pueden servir como un importante sistema modelo para estudiar la vía de Shh, el tráfico ciliar y vías de diferenciación neuronales. Además, las neuronas diferenciadas de NSCs también se pueden utilizar para ensayos de tráfico ciliar. Neurospheres están constituidos por agrupaciones de células que flotan libremente que surgen de la proliferación de neuracélulas madre / progenitoras l que crecen en presencia de factores de crecimiento específicos y superficies no adhesivas 43, 44. Neurospheres sirven como importante en los modelos de cultivo in vitro para estudiar las células madre / progenitoras neurales en el desarrollo normal y la enfermedad de 31, 45, 46, 47. A continuación, describimos un ensayo basado en neurosphere para cultivar células neurales madre / progenitoras y para la diferenciación en neuronas / glia. En particular hincapié en el tráfico de señalización componentes a cilios de tallo neural / células progenitoras y las neuronas diferenciadas (Figura 1). A diferencia de cultivo de neuronas primarias, neuroesferas primarias son relativamente fáciles de cultura, son susceptibles de múltiples pases y ciclos hielo-deshielo, y pueden someterse a la diferenciación en neuronas / glia. Es importante destacar que, determinamos que neural neurosphere derivadoscélulas madre / progenitoras y neuronas diferenciadas se ciliadas en la cultura y localizar moléculas relevantes para la función ciliar en estos compartimentos de señalización. métodos de cultivo basados ​​en Neurosphere pueden servir como un sistema de modelo ideal para el estudio ciliogenesis y ciliar trata de NSCs y neuronas diferenciadas.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos redondos de 12 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído (PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 95 mm x 15 mm, tapa deslizante</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>Plato de 10 cm</td></tr><tr><td>70 &micro; colador de células m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure Burro Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Burro anti Conejo, Alexa 488 anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Arl13B, Clon N295B/66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sin suero</td><td></td><td></td><td>Centrífuga</td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific 17504001 B27Thermo scientific</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>Vial criogénico</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Moldes de muestras de vinilo desechables</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 mm x 10 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato Dulbecco 10X, modificada, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, líquida, filtrada estérilmente, apta para cultivo celular</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td> <td>Fluoromount-GSolución de montaje Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti ratón de cabra IgG1, conjugado Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td> anti <td>ratón de cabra IgG1, anticuerpo secundario Alexa 555 Anticuerpo secundario</td></tr> de <tr><td>cabra anti ratón IgG2a Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 555 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>IgG2a anti ratón de cabra, Alexa 555 anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>hecho en casa</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>humano bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>FGF</td></tr><tr><td>hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>0,100 mm de profundidad</td><td>mejorado</td></tr><tr><td>Neubauer Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td>Laminina de isofluorano</td></tr><tr><td>de Engelbreth-Holm-Swarm Membrana basal para sarcoma</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Laminina</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 Reactivo de transfección</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td> compuesto <td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Proteína EGF humana recombinante, sistemas CF</td><td>R y D</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Tijera</td> EGF <td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost plus</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-15</td><td>portaobjetos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA (10X)</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>Tripsina</td></tr><tr><td>COSTAR Placa de 6 pocillos, con tapa Fondo plano Superficie de fijación ultra baja Poliestireno, estéril</td><td>Corning</td><td>3471 Corning 3471</td><td>Placa de 6 pocillos</td></tr><tr><td>&beta;-tubulina III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

el uso de cultivos de neuroesferas primarias estudian primaria cilios

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

El cilio primario es fundamentalmente importante para la proliferación de células madre/progenitoras neurales y para la diferenciación neuronal durante la vida embrionaria, postnatal y adulta. Además, la mayoría de las neuronas diferenciadas poseen cilios primarios que albergan receptores de señalización, como los receptores acoplados a proteínas G, y moléculas de señalización, como las adenilil ciclasas. El cilio primario determina la actividad de múltiples vías de desarrollo, incluida la vía sónica del erizo durante el desarrollo neuronal embrionario, y también funciona en la promoción de la señalización subcelular compartimentada durante la función neuronal adulta. Como era de esperar, los defectos en la biogénesis y la función del cilio primario se han relacionado con anomalías del desarrollo del cerebro, obesidad central y déficits de aprendizaje y memoria. Por lo tanto, es imperativo estudiar la biogénesis primaria del cilio y el tráfico ciliar en el contexto de las células madre/progenitoras neurales y las neuronas diferenciadas. Sin embargo, los métodos de cultivo de neuronas primarias requieren una experiencia considerable y no son susceptibles de ciclos de congelación y descongelación. En este protocolo, discutimos los métodos de cultivo para poblaciones mixtas de células madre/progenitoras neurales utilizando neuroesferas primarias. Los métodos de cultivo basados en la neurosfera proporcionan los beneficios combinados del estudio de las células madre/progenitoras neurales primarias: capacidad para múltiples pasajes y ciclos de congelación-descongelación, potencial de diferenciación en neuronas/glía y transfectabilidad. Es importante destacar que determinamos que las células madre/progenitoras neurales derivadas de la neurosfera y las neuronas diferenciadas se cilian en cultivo y localizan moléculas de señalización relevantes para la función ciliar en estos compartimentos. Utilizando estos cultivos, describimos más a fondo los métodos para estudiar la ciliogénesis y el tráfico ciliar en células madre/progenitoras neurales y neuronas diferenciadas. Estos métodos basados en la neurosfera nos permiten estudiar las vías celulares reguladas por los cilios, incluido el receptor acoplado a la proteína G y la señalización sónica del erizo, en el contexto de las células madre/progenitoras neurales y las neuronas diferenciadas.

Después de sembrar las células de la SVZ en medio NSC durante una semana, neuroesferas flotantes se observaron (Figura 2A). Los tamaños de las esferas variaron entre 50 y 200! M. Para examinar si las esferas se derivan de las células madre / progenitoras neurales, las neuroesferas se sembraron en PLL- y cubreobjetos en medio NSC recubiertas con laminina durante 2 días. Luego fueron inmunoti~neron contra el marcador / célula progenitora madre neurales, nestina. Se necesit...

El cilio primario es fundamentalmente importante en la proliferación neuronal de células progenitoras, la diferenciación neuronal, y la función neuronal adulto. A continuación, describimos un método para estudiar ciliogenesis y el tráfico de proteínas de señalización a los cilios en las células madre / progenitoras neuronales y neuronas diferenciadas utilizando cultivos de neuroesferas primarias.

El uso de cultivos de neuroesferas primarias estudian primaria cilios

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar métodos de cultivo basados en neuroesferas para células primarias de células madre neurales y progenitoras, con el fin de estudiar la biogénesis y el tráfico del cilios primarios. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los cilios primarios, como la biogénesis de cilios y el tráfico de moléculas hacia los cilios primarios en células madre neurales primarias, progenitores neurales y neuronas.La principal ventaja de esta técnica es que podemos utilizar los criterios celulares primarios de las células madre neurales, progenitores neurales y neuronas para analizar la biogénesis y las vías ciliares en el contexto del cilío primario. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el cultivo de células madre neurales es técnicamente desafiante para principiantes. Mostraremos que una demostración de este método es fundamental, ya que la disección del ventrículo lateral y pasos como el cultivo de neuroesferas y la cuantificación de cilios primarios se aprenden fácilmente al observar los pasos críticos.Comience este procedimiento con una zona subventricular del ventrículo lateral

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se describe un protocolo detallado para la generación simultánea de cultivos de células precursoras neurales, ya sea como monocapas o neuroesferas adherentes, de la zona subventricular y giro dentado de ratones adultos individuales.

Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

Aquí se presenta un protocolo para la generación espontánea de neuroesferas enriquecidas en células progenitoras neuronales a partir de neuronas chapadas de alta densidad. Durante el mismo experimento, cuando las neuronas se platean a una densidad más baja, el protocolo también resulta en cultivos prolongados de neuronas de rata primaria.

Generación de neuroesferas a partir de neuronas de hipocampo primario mixto y cortical esinas aisladas del e14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Realizar experimentos in vitro para reflejar las condiciones in vivo lo más adecuadamente posible no es una tarea fácil. El uso de cultivos celulares primarios es un paso importante hacia la comprensión de la biología celular en todo un organismo. El protocolo proporcionado describe cómo crecer y cultivar con éxito las neuronas cerebelosas de ratón embrionarios.

Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

Los cilios primarios son estructuras extracelulares asociadas con el centriolo. La detección de cilios primarios por tinción inmunofluorescente es un procedimiento relativamente simple que da como resultado imágenes de muy alta calidad. En este protocolo, los fibroblastos que expresaban cilios primarios fueron fijos, inmunosutenidos e imágenes en un microscopio fluorescente o confocal.

Detección simple de cilios primarios por inmunofluorescencia

El uso de la inteligencia artificial (IA) para analizar imágenes está emergiendo como un enfoque poderoso, menos sesgado y rápido en comparación con los métodos comúnmente utilizados. Aquí entrenamos a Ai para reconocer un orgánulo celular, cilios primarios y analizar propiedades como la longitud y la intensidad de la tinción de una manera rigurosa y reproducible.

Enfoques de inteligencia artificial para evaluar los cilios primarios

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Aquí, presentamos un protocolo de electroporación in vitro reproducible para la manipulación genética de precursores primarios de células granulares cerebelosas (GCP) que es rentable, eficiente y viable. Además, este protocolo también demuestra un método sencillo para el estudio molecular de las vías de señalización de Hedgehog dependientes del cilio primario en células GCP primarias.

Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares

Aquí, describimos un sistema de nucleofección diseñado para mejorar la eficiencia de la entrega de genes en células madre neurales expandidas (NSC) aisladas de la zona subventricular murina adulta. Los hallazgos demuestran que este método mejora significativamente la perturbación génica en las NSC, superando la efectividad de los protocolos tradicionales de transfección y mejorando la tasa de supervivencia celular.

Aislamiento, expansión y nucleofección de células madre neurales de la zona subventricular murina adulta

Este método describe la explotación de la señal endógena en un modelo de ratón transgénico ARL13B-CENTRIN-2 para obtener imágenes de cilios primarios in situ, en tres dimensiones a través de grandes áreas de tejido mineralizado, desde la recolección de tejido hasta el análisis de la organización de los cilios. Este protocolo también se puede aplicar a otros tipos de tejidos.

Imágenes volumétricas y análisis de cilios primarios en tejido musculoesquelético utilizando el modelo de ratón ARL13B-CENTRIN-2

El cultivo de gotas verticales ex vivo es una alternativa a las técnicas experimentales actuales in vitro e in vivo. Este protocolo es fácil de realizar y requiere cantidades más pequeñas de reactivo, a la vez que permite la capacidad de manipular y estudiar la vascularización, morfogénesis y organogénesis fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Aprende a utilizar cultivos de neuroesferas primarias para estudiar la biogénesis y el tráfico de cilios primarios en células madre y progenitoras neuronales. Este método permite analizar vías ciliares en contexto celular.

El uso de cultivos de neuroesferas primarias estudian primaria cilios

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