El uso de cultivos de neuroesferas primarias estudian primaria cilios
14 de abril de 2017
El cilio primario es fundamentalmente importante en la proliferación neuronal de células progenitoras, la diferenciación neuronal, y la función neuronal adulto. A continuación, describimos un método para estudiar ciliogenesis y el tráfico de proteínas de señalización a los cilios en las células madre / progenitoras neuronales y neuronas diferenciadas utilizando cultivos de neuroesferas primarias.
El objetivo general de este procedimiento es utilizar métodos de cultivo basados en la neurosfera para células madre y progenitoras neurales primarias para estudiar la biogénesis y el tráfico de cilio primario. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los cilios primarios, como la biogénesis de los cilios y el tráfico de moléculas de cilios a los cilios primarios. En células madre neurales primarias, progenitores neurales y neuronas.
La principal ventaja de esta técnica es que podemos utilizar los criterios celulares primarios de las células madre neurales, los progenitores neurales y las neuronas para analizar la biogénesis y las vías ciliares en el contexto del cilio primario. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el cultivo de células madre neurales es técnicamente un desafío para los principiantes. Mostraremos una demostración de que este método es crítico, ya que la disección del ventrículo lateral y pasos como el cultivo de neuroesferas y la cuantificación de cilios primarios se aprenden fácilmente observando los pasos críticos.
Comience este procedimiento con una zona subventricular del ventrículo lateral diseccionada de un ratón adulto utilizando el método de disección de montaje completo. Coloque el pañuelo que contiene el SVZ en un tubo de 1,5 mililitros. Añadir 500 microlitros de tripsina-EDTA al 0,05% en PBS e incubar 15 minutos a 37 grados centígrados al baño maría.
Después de la incubación, agregue 500 microlitros de medio de parada y pipetee suavemente de 20 a 30 veces con una punta de 1 mililitro. Evite formar burbujas de aire durante el pipeteo. Después de esto, gire las celdas a 500 veces G durante ocho minutos.
Deseche el sobrenadante, luego agregue 1 mililitro de PBS y vuelva a suspender las células pipeteando suavemente cinco veces con una punta de 1 mililitro. Centrifugar a 500 veces G durante ocho minutos. A continuación, aspire el medio con una punta de 1 mililitro y añada 1 mililitro de medio basal.
Después de contar las células, coloque las células de una SVZ en un plato de 10 centímetros con 10 mililitros de medio NSC y cultive a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Después de cinco a siete días, se pueden observar las neurosferas. Para analizar las células de las neuroesferas unidas mediante inmunotinción, transfiera 1 mililitro de medio que contenga varias neuroesferas a un tubo de 1,5 mililitros y centrifuga a 500 veces G durante ocho minutos.
Después de retirar el medio, fije las esferas con 4% de paraformaldehído durante 15 minutos. Después de eliminar el paraformaldehído, incube las esferas con un 30% de sacarosa, durante la noche. Y luego centrífuga de nuevo.
Lavar con PBS. Luego, después de centrifugar como antes, retire y deseche el sobrenadante. A continuación, coloque una pipeta con una punta cortada de 1 mililitro y pipetee 500 microlitros de solución OCT en las neuroesferas.
Transfiera la solución OCT que contiene las neuroesferas a un molde de congelación de plástico desechable. Luego, congela el molde en hielo seco durante al menos 15 minutos. Corta secciones con un criostato.
Para visualizar las células madre en la neurosfera, realice la inmunotinción contra el marcador de células madre Nestin. Para visualizar los cilios primarios en una neurosfera, realice la inmunotinción contra ARL13B. Comience este experimento uno o dos días después de sembrar células madre neurales disociadas adheridas en cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina y laminina.
Cambie el medio en los pozos experimentales a medio de inanición, y a medio NSC fresco en los pozos de control. Incubar durante 24 horas más. Al día siguiente, fije las celdas con 4% de paraformaldehído en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Después de la fijación, lavar con PBS dos veces durante cinco minutos cada una, a temperatura ambiente. Y luego realizar la inmunofluorescencia utilizando protocolos estándar. Monte los cubreobjetos con solución de montaje.
Luego, seque el vidrio deslizante durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Al día siguiente, adquiera imágenes en un microscopio compuesto con el aumento necesario. La cámara del microscopio y los objetivos deben controlarse con el software adjunto.
Tome suficientes secciones en Z a intervalos de 0,5 a 0,8 micras. Para el análisis cuantitativo de la localización ciliar en células adherentes, seleccione de tres a ocho campos consecutivos con células confluentes mediante la visualización del canal DAPI. Adquiera pilas de imágenes de cada campo.
Cuantifique el número de cilios primarios utilizando ImageJ. Abra el cuadro de diálogo Analizar complementos y seleccione la herramienta Contador de celdas para contar las celdas con cilios GPCR positivos. Utilice parámetros de intensidad y contraste de imagen similares para todas las imágenes del mismo experimento con fines de recuento y exportación.
24 horas después del cultivo, las células disociadas en medio NSC o medio de inanición, las células se fijaron e inmunoteñieron contra GPR161 que se muestra en verde, ARL13B que aparece en rojo y el ADN que se muestra en azul. Los cilios GPR161 positivos se observan en las células de control de la izquierda y en las células hambrientas de la derecha. Como se ve en estas vistas ampliadas.
Las flechas blancas y las puntas de flecha indican cilios positivos y negativos de GPR161, respectivamente. Esta imagen muestra la cuantificación de células ciliadas ARL13B positivas. La cuantificación se realiza desde dos campos de visión, cada uno de dos réplicas técnicas de un solo experimento.
El porcentaje de células ciliadas positivas para ARL13B aumenta tras la inanición. Esta imagen muestra la cuantificación de la localización de GPR161 en cilios positivos para ARL13B en células de control y hambrientas. El porcentaje de GPR161 que se localiza en los cilios positivos para ARL13B también aumenta tras la inanición.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de dos horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar otro método de cultivo de células derivadas de tumores primarios con el fin de responder preguntas adicionales como el papel de los cilios en la génesis del tumor. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los cilios primarios exploraran la biogénesis ciliar y el tráfico en sistemas basados en la neurosfera primaria.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar los cilios primarios en células madre neurales, progenitores neuronales y neuronas que se derivan de cultivos basados en la neurosfera.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para estudiar la ciliogénesis y el tráfico de proteínas de señalización hacia cilios primarios en células madre y progenitoras neurales. Mediante el uso de cultivos de neuroesferas, la técnica aborda preguntas clave sobre la biogénesis de cilios y el transporte de moléculas hacia los cilios en células neurales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- El cilío primario es esencial para diversas funciones neuronales.
- Comprender la biogénesis de los cilios es fundamental para obtener conocimientos sobre el desarrollo neural.
- Los cultivos de neuroesferas proporcionan un modelo relevante para estudiar las células madre neurales.
- Existen desafíos técnicos en el cultivo de células madre neurales para principiantes.
Objetivo del estudio
- Investigar la biogénesis de cilios primarios en células progenitoras neurales.
- Analizar el tráfico de proteínas de señalización hacia los cilios primarios.
- Proporcionar una demostración práctica de las técnicas de cultivo de neuroesferas.
Métodos Utilizados
- Métodos de cultivo de neuroesferas para células madre y progenitoras neurales.
- Diseción del ventrículo lateral.
- Cuantificación de cilios primarios.
- Observación de los pasos críticos para un aprendizaje efectivo.
Resultados principales
- Establecimiento exitoso de cultivos de neuroesferas para su análisis.
- Demuestra los métodos de biogénesis y tráfico de cilios.
- Identificación de los desafíos clave para principiantes en el cultivo.
- Conocimientos sobre el papel de los cilios primarios en la función neural.
Conclusiones
- Este método mejora la comprensión de los cilios primarios en células neurales.
- Proporciona una base para investigaciones futuras en estudios relacionados con los cilios.
- Las demostraciones técnicas pueden ayudar a superar los desafíos iniciales del cultivo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El estudio de los cilios primarios en células madre y progenitoras neurales proporciona información mecanicista sobre las vías de señalización del desarrollo relevantes para los modelos de enfermedades neurodegenerativas. Los cultivos basados en neuroesferas permiten sistemas escalables y reproducibles para la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos para el SNC. Este enfoque respalda la confianza predictiva en estudios de modulación de vías al mantener la señalización fisiológica dependiente de cilios.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la ciliogénesis y el tráfico ciliar en células madre/progenitoras neurales para validar dianas en las vías de señalización Hedgehog y GPCR.
- Valor operativo: Permite múltiples pasajes y ciclos de congelación-descongelación, reduciendo la variabilidad en estudios longitudinales de interacción con dianas.
- Valor predictivo: Relaciona la localización de moléculas de señalización en los cilios, como GPR161, con la actividad de la vía, ayudando a reducir los riesgos mecanicistas en terapéuticos del sistema nervioso central.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Las células adherentes derivadas de neuroesferas permiten la inmunotinción estandarizada y la cuantificación de células positivas para cilios mediante los marcadores ARL13B y GPR161.
- Resultado cuantitativo: Permite la medición del porcentaje de ciliación y del tráfico de proteínas hacia los cilios en condiciones basales y de privación, lo que favorece la elaboración de modelos de respuesta a la dosis.
- Escalabilidad: Compatible con placas de múltiples pocillos e imagen automatizada para el cribado de medio rendimiento de compuestos ciliogénicos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela vías dependientes de los cilios implicadas en trastornos del neurodesarrollo, obesidad y disfunción cognitiva.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos sobre ciliogénesis in vitro con fenotipos in vivo mediante mecanismos conservados de señalización ciliar.
- Alineación de biomarcadores: Facilita la identificación de defectos en el tráfico ciliar como posibles biomarcadores traslacionales para la modulación de vías.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar un sistema fisiológicamente relevante para evaluar la interacción con el blanco en cascadas de señalización dependientes de cilios antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los roles de los cilios en la proliferación y diferenciación de progenitores neurales mediante condiciones controladas de cultivo.
- Selección: Permite el desarrollo de ensayos para compuestos que afectan la ciliogénesis o la localización de proteínas ciliares utilizando lecturas cuantificables de inmunofluorescencia.
- Análisis: Genera datos cuantitativos sobre la frecuencia de ciliación y la localización subcelular de proteínas de señalización, facilitando el análisis comparativo entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos celulares de los cilios con la actividad de las vías de señalización Hedgehog y GPCR, relevantes para modelos preclínicos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar la regulación de los cilios en múltiples tipos de células neurales y perturbaciones relacionadas con enfermedades.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona información mecanicista sobre la señalización dependiente de cilios, reduciendo la ambigüedad en la validación de dianas para vías del sistema nervioso central.
- Valor operativo: La estandarización del cultivo de neuroesferas mejora la reproducibilidad y permite la criopreservación para lograr consistencia entre lotes.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción del proyecto al aclarar la fidelidad de la vía diana en modelos neuronales fisiológicamente relevantes.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al validar la modulación de la diana en sistemas competentes para cilios antes de la inversión preclínica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de tejido neural y en técnicas de cultivo celular primario.
- Depende del acceso a un criostato, microscopía de fluorescencia y herramientas de análisis de imágenes como ImageJ para la cuantificación de cilios.
- Necesita la estandarización de los protocolos de ayuno y fijación para garantizar lecturas consistentes de cilios entre experimentos.
- La adaptación a otras regiones neuronales o modelos de enfermedad puede requerir la optimización de las condiciones de disociación y cultivo.
- Se limita a ensayos de diferenciación adherentes para la cuantificación de cilios; los neuroesferoides en suspensión requieren procesamiento para su análisis por imagen.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Isolation of Neurospheres from the Adult Mouse Brain
2:43
Embedding and Sectioning of Neurospheres for immunostaining
4:10
Starvation and Analysis of Cilia
6:01
Results: Starvation Induces Ciliogenesis in Dissociated, Adherent Neutral Stem/Progenitor Cells
7:19
Conclusion
