El escalado de Engineered injertos vasculares Usando 3D Impreso guías y el método de anillo de apilamiento

El objetivo general de este método es generar de forma robusta y consistente vasos sanguíneos modificados de cualquier tamaño. Esta técnica permite la ingeniería fiable y eficaz de los vasos sanguíneos. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden fabricar recipientes de cualquier tamaño de forma fácil y fiable.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando estábamos discutiendo cómo diseñar un tubo de tejido y comparamos nuestro método con la construcción de túneles de carretera, un segmento a la vez. Para preparar los insertos impresos en 3D, primero agregue una capa delgada de dos, cuatro o seis ml de silicona sin curar en la parte inferior de una placa de Petri de 35, 60 o 100 milímetros, respectivamente. Para crear postes para las placas de 35 mm, vierta el PDMS en una placa diferente de 100 mm a una altura de siete mm y caliente el PDMS en una placa calefactora a 60 grados centígrados durante dos o tres horas.

Cuando el PDMS esté curado, use un punzón de biopsia de cinco mm para crear postes cilíndricos. Usando una pequeña cantidad de PDMS sin curar para asegurar los cilindros al centro de cada placa de 35 mm. Coloque una carcasa exterior impresa en 3D de unos 66,7 mm de diámetro equidistante del poste en las placas de 100 mm.

Antes de curar el PDMS en la parte inferior de las placas de 60 y 100 mm, coloque los postes impresos en 3D de 10 y 20 mm de diámetro en el centro de cada placa de 60 y 100 mm respectivamente. Deje que los platos se curen al aire libre en la placa calefactora a 60 grados centígrados durante dos o tres horas, seguidas de dieciocho horas de desgasificación del polímero. Al final de la desgasificación, esterilice el interior de todas las placas con etanol al 70% y cubra cada placa durante 30 minutos.

A continuación, aspire cuidadosamente el etanol de cada placa para permitir el secado al aire. Cuando las placas estén secas, transfiéralas a una cabina de seguridad biológica junto a sus correspondientes tapas boca arriba. y exponer los materiales a la luz ultravioleta durante 30 minutos para completar la esterilización.

Para preparar el hidrogel de fibrina, primero agregue 0,5, 1,1 y 1,81 mL de medio de crecimiento suplementado con gel de fibrina y TGF Beta 1 a placas de cultivo de 35, 60 y 100 mm respectivamente. A continuación, agregue 40, 88,4 y 145 microlitros de trombina a las placas de 35, 60 y 100 mm respectivamente, y agite suavemente cada placa con la mano. Cuando la trombina esté distribuida uniformemente, agregue 160, 354 y 580 microlitros de fibrinógeno con un movimiento circular gota a gota a la mezcla de medio de trombina en las placas de 35, 60 y 100 mm, respectivamente, y agite suavemente las placas para distribuir uniformemente el hidrogel.

Deje que el hidrogel se cure durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, tripsinar las células musculares lisas de interés, expandidas en placas de cultivo celular de 150 mm, y recoger las células desprendidas por centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en tres ml de medio de diferenciación y utilice una pipeta de dos ml para triturar vigorosamente las células y romper los grumos celulares.

Después del recuento, dividir las células en 2/10 10 a la 6ª, 1/10 10 a la 7ª y 1,4 x 10 a la 7ª células por mL de alícuotas en tubos cónicos de 50 ml, marcados según sus correspondientes placas de cultivo. Agregue medio de diferenciación a cada tubo para obtener volúmenes finales de siembra de dos, cuatro y cinco mL para cada placa de 35, 60 y 100 mm respectivamente. Luego, agregue cuidadosamente las soluciones celulares gota a gota sobre el hidrogel preparado en cada placa correspondiente para su expansión en la incubadora de cultivo celular. Después de dos a cuatro días, los anillos se habrán contraído completamente hacia sus puestos.

Por lo tanto, agregue 10, 20 o 35 mL de TGF Beta 1 a cada anillo de 35, 60 y 100 mm, respectivamente. Para ensamblar la construcción vascular para el vaso de 35 mm, corte una sección de dos pulgadas desde la parte superior de un tubo cónico de policarbonato de 50 mL y PDMS, pegue el borde superior en una placa de 35 mm para crear una placa alta para el apilamiento de anillos. Para las placas de apilamiento de anillos altos de recipientes de 60 y 100 mm, corte un tubo de policarbonato de 1,75 pulgadas de diámetro en secciones de 2,5 pulgadas a lo largo para que sirvan como paredes de placas altas.

Para los fondos de las placas altas, corte una lámina de policarbonato de 0,125 pulgadas de grosor en trozos circulares de dos pulgadas de diámetro. Usando cemento solvente acrílico, una las secciones del tubo de policarbonato a las piezas cortadas circularmente. Imprime en 3D postes de cinco, diez y 20 mm de diámetro con una longitud de 50 mm.

A continuación, añada 10 ml de silicona sin curar a cada recipiente, colocando en el centro cada poste impreso en 3D en cada contenedor de 35, 60 y 100 mm antes de que el PDMS esté completamente curado. Y coloque los platos en una placa calefactora a 60 grados centígrados durante dos o tres horas. Cuando el PDMS esté curado, esterilice las placas con etanol al 70% como se acaba de demostrar, seguido de la exposición de los recipientes esterilizados con etanol seco a la luz ultravioleta durante 30 minutos.

Ahora, use dos pares de pinzas muy finas para levantar con cuidado primero un lado, y luego el otro, de un anillo de hidrogel de músculo liso enrollado firmemente desde su poste. A continuación, deslice con cuidado un lado del anillo y luego el otro sobre el poste alto del contenedor más grande del tamaño correspondiente. Trabajando de forma circunferencial, con suaves movimientos graduales, empuje lentamente el anillo por el poste, apilando posteriormente anillos de tejido adicionales hasta obtener la longitud de vaso deseada.

Cuando todos los anillos se hayan apilado, gire las placas de modo que los postes queden paralelos a la superficie de trabajo y agregue suavemente 40, 80 y 160 microlitros de trombina a la superficie exterior de cada recipiente de 35, 60 y 100 mm respectivamente mientras gira lentamente las placas. A continuación, agregue 40, 80 y 160 microlitros de fibrinógeno a cada construcción de 35, 60 y 100 mm respectivamente, lo más rápida y uniformemente posible mientras rota enérgicamente la construcción. La trombina y el fibrinógeno se convertirán rápidamente en un gel firme al mezclarse.

A continuación, añada 20 ml de medio de diferenciación a cada recipiente de construcción y coloque los recipientes en una incubadora a 37 grados centígrados hasta que los necesite. El análisis histológico revela una alta celularidad en todos los tamaños anillados, observándose una pequeña cantidad de gel de fibrina residual en los bordes exteriores de los anillos pequeños. En los anillos más grandes, algo de gel de fibrina se intercala con el contenido celular, con indicaciones de producción de colágeno evidentes tanto en los anillos intermedios como en los grandes.

El análisis de los anillos tisulares para la expresión de actina y tropomiosina del músculo liso alfa revela que todos los tamaños de los anillos son positivos para ambos anticuerpos, lo que verifica que el fenotipo del músculo liso se mantuvo. Las pruebas de tracción indican una tendencia constante de aumento de la resistencia que se correlaciona con un aumento del tamaño del anillo y del recipiente en los tres tamaños de anillos. Los números de siembra de celdas para crear los distintos tamaños de anillo también se correlacionan con el área de superficie de siembra.

Estas construcciones de recipientes también pueden soportar el flujo hasta por cinco minutos a caudales de 100 a 417 ml por minuto, con solo fugas menores observadas donde los recipientes se conectan al sistema de profusión. Una vez dominados, los anillos se pueden diseñar en una hora si la técnica se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mezclar bien los componentes del hidrogel para garantizar la fijación del gel y la formación adecuada del anillo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la creación de anillos de otros tipos de células, para diseñar otros tipos de tejidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el método de apilamiento de anillos para diseñar tejidos vasculares de varios tamaños.