Name: Evaluación de ubicación intracelular de especies reactivas de oxígeno en espermatozoides de Solea Senegalensis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a evaluar la localización intracelular de especies reactivas de oxígeno en espermatozoides de Solea senegalensis mediante microscopía confocal con fluorocromos específicos. Este método permite visualizar H2O2, mitocondrias y núcleo para estudiar el estrés oxidativo en biología reproductiva.

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Agradecemos a AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Este trabajo fue apoyado por el proyecto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce fue financiado por la Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) y el Fondo Social Europeo. Los autores reconocen Dr. Ana Riaza y Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero y José Ramón Guiérrez. También agradecemos a Paula Fernández Colado por videografía.

Nota: Incubación de fluorocromo y análisis confocal tendrá al menos 2-3 h para un control y una muestra tratada. Procesamiento de datos no está incluido en este cálculo de tiempo. Materiales pueden encontrarse en la Tabla de materiales. Este protocolo se puede aplicar a los espermatozoides frescos o criopreservados. Solea senegalensis es una especie de pez que desova en aguas frías, trabajo siempre bajo condiciones de frío (4-7 ° C). Vea la figura 1 para una visión general del protocolo.
1. preparativos antes del experimento
<ol><li>Prepare solución de grado analítico DMSO con un 1 mM las mitocondrias de la mancha.</li>
	<li>Preparar un 4′ de 1 μg/mL, solución en agua desionizada diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Preparar una solución de Ringer mOsm/kg 200 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7)</li>
	<li>Preparar un 2 ' 4 mM, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA) solución en metanol grado analítico. Nota: Mantenga las soluciones stock en alícuotas a-20 ° C hasta que se necesite.</li>
	<li>Establecer la microcentrífuga a 4-7 ° C.</li>
</ol>2. preparación antes de la incubación del fluorocromo
Nota: Manejo cuidadoso de los espermatozoides es deseable cuando pipeteo y resuspender.
<ol><li>Si trabaja con células cryopreserved, prepare un baño de agua para descongelar a 40 º C para Solea senegalensis espermatozoides10. Sumergir las muestras de paja en el baño de agua durante 7 s.</li>
	<li>Con unas tijeras para cortar, vaciar la muestra en un tubo de microcentrífuga y centrifugar a 1000 x g, 4-7 ° C por 1 min.</li>
	<li>Eliminar el plasma seminal o plasma seminal con crioprotectores de la muestra criopreservada mediante pipeteo para descartar cualquier componente que pudiera interferir con el protocolo de tinción.</li>
	<li>Resuspender las células en 50-100 μL de 4 º C 200 mOsm/kg solución de Ringer.</li>
	<li>Determinar la concentración de esperma con una Neubauer o una cámara de conteo similar bajo un microscopio estereoscópico.</li>
	<li>Diluir la suspensión de células para arriba con 1-2 x 106 células/mL en un volumen final de 0.5 mL en 4 ° C solución de Ringer.</li>
</ol>3. fluorocromo incubación
Nota: Fluorocromos deben manipularse en condiciones de poca luz, especialmente cuando están en solución.
<ol><li>Añadir 3,125 μL de solución stock DCFH-DA (concentración final en la muestra: 25 μM) para la dilución de la muestra de trabajo. Incubar a 4-7 ° C por 40 min en oscuridad10.</li>
	<li>Después de 30 min, Añadir 0,5 μL de la solución madre de DAPI (concentración final en la muestra: 2 μM) y 0,5 μL de la mitocondria mancha solución (concentración final en la muestra: 100 nM) a la muestra. Incubar ambos fluorocromos para 10 min en la oscuridad.</li>
</ol>4. preparación para Microscopía Confocal
<ol><li>Después del tiempo de incubación, Centrifugue la suspensión de células a 1000 x g, 4-7 ° C durante 1 minuto.</li>
	<li>Descartar el sobrenadante cuidadosamente mediante pipeteo.</li>
	<li>Añadir un 10-20 μL de 200 mOsm/kg de solución Ringer.</li>
	<li>Lugar 5 μL de una suspensión concentrada de células de la gota en un portaobjetos.</li>
	<li>Con cuidado, poner una diapositiva de cubierta sobre la preparación y selle con esmalte. Una vez seco el esmalte, la preparación está lista para la microscopia confocal.</li>
</ol>5. confocal configuración antes del experimento
Nota: Dependiendo del microscopio, DCFH-DA podría ser "quemado". Establecer las mejores condiciones con una muestra no valiosos primero.
<ol><li>Encender el microscopio, láser, cámara y el equipo con el microscopio.</li>
	<li>Conjunto de láseres de excitación teniendo en cuenta los máximos de excitación y de emisión de cada fluorocromo:<ol>
<li>Para DAPI, utilice un máximo de excitación de 358 nm y un máximo de emisión de 465 nm.</li>
		<li>Para la mancha mitocondrial, use un máximo de excitación de 644 nm y un máximo de emisión de 662 nm.</li>
		<li>Para DCFH-DA, utilice un máximo de excitación de 504 nm y un máximo de emisión de 525 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Empezar a trabajar con el objetivo de 25 X a centrarse en los espermatozoides. Seleccione el canal DAPI para enfocar porque este fluorocromo informa la intensidad más alta. Una vez que las células se concentran, utilizar un 63 X o 100 X objetivo de una evaluación cuidadosa porque Solea senegalensis espermatozoides tamaño es alrededor de 2 μm.</li>
	<li>Para cada canal, optimizar el poro, la ganancia y la tensión. De la misma manera, ajustar el offset digital para reducir a fondo. Una vez que todos los parámetros están optimizados para el fluorocromo usado, guardar la configuración. Para un experimento rutinario de una sola célula de la esperma de Solea senegalensis se utilizaron los siguientes (estos parámetros pueden cambiar en cada experimento): agujero de alfiler de la 1 y la ganancia de tensión de 750 V.</li>
</ol>6. adquisición de imágenes
<ol><li>Seleccione las condiciones de calidad deseada para la adquisición de la imagen. Definir parámetros de adquisición como profundidad de bits, formato de imagen, grueso de la hoja ligera y escoge la iluminación cara sola. Para un experimento rutinario para un solo espermatozoides Solea senegalensis se utilizaron los siguientes (estos parámetros pueden cambiar en cada experimento): tamaños de 1024 px; bits por píxel de 16; velocidad de escaneo de 2-4).</li>
	<li>Abierto y centro de la zona de exploración para iniciar y tomar una imagen del campo.</li>
	<li>Usando la herramienta Recortar, seleccione la región de interés y pulse vivo.</li>
	<li>Con la ayuda de la herramienta del indicador de rango, ajustar el offset digital para reducir el fondo. Hacer esto para cada canal y la imagen.</li>
	<li>Compruebe la calidad de los canales individuales para cada fluorocromo y sus combinaciones.</li>
</ol>7. crear un imagen 3D Video
<ol><li>Configuración de la adquisición de Z-stack.<ol>
<li>Elija la opción Z-stack en el software.</li>
		<li>Seleccione la celda individual, grupo de células o región de interés y enfocar.</li>
		<li>Delimitar la Z-pila con las opciones 'Primera rodaja' y 'Última rodaja' y establecer el paso de z a intervalo de 0.2 μm con la ayuda del foco fino. Elegir el canal DAPI concentrarse porque este fluorocromo puede reportar la intensidad más alta y se puede seleccionar fácilmente la cabeza entera de espermatozoides. Elija los parámetros de adquisición óptimos para cada canal y ejecutar el experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecutar el experimento de Z-stack. Dividir los canales y observar la localización de cada señal dentro de las células.</li>
	<li>Proceso Z-stack.<ol>
<li>Volumen de procesamiento: una vez finalizado el experimento, seleccione las opciones del software de procesamiento de Z-stack y elegir el volumen hacer opción. Seleccione el número de pasos y los grados de rotación (360°). Guarde el archivo con una extensión de vídeo.</li>
		<li>Anaglifo estéreo: seleccione estéreo anaglifo en las opciones de ventana de proceso. Esta herramienta permite para crear una imagen 3D video con canales de split.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li>
<li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li>
<li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation%2C+intracellular+hydrogen+peroxide%2C+and+DNA+integrity+in+canine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li>
<li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li>
<li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li>
<li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li>
<li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li>
<li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044848614002105">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Es bien sabido que las mitocondrias son orgánulos claves para la motilidad del esperma y la función. Estos orgánulos están implicados simultáneamente directamente en la producción de ROS. Curiosamente, controlados los niveles de ROS son necesarios para el esperma adecuado función1. Relaciones positivas entre la fertilidad y el estrés oxidativo se ha demostrado en mamíferos11 pero niveles excesivos afectan esperma calidad12. Un factor crucial que podr...

La producción de especies reactivas de oxígeno se ha relacionado con la calidad del esperma recientemente1. Aunque la producción de ROS en la mitocondria puede ser considerada un proceso fisiológico normal, estrés oxidativo por exceso de producción de ROS es una causa clara de daño en los espermatozoides en los diferentes niveles. En los seres humanos, el estrés oxidativo se asocia a infertilidad, alteración de la motilidad y la capacidad de someterse a capacitación2; en los mamíferos, el cambio de la integridad del ADN en las muestras de esperma congelado se ha relacionado también a la síntesis de H2O23.
La criopreservación es una técnica común para la banca en acuicultura, gen. Esta tecnología es particularmente importante en las especies con problemas reproductivos como Solea senegalensis. Esta especie valiosa en el mercado muestra disfunción reproductiva en individuos nacidos en cautividad debido a la falta de cortejo. Este hecho hace que la criopreservación de espermatozoides necesario contar con la disponibilidad de espermatozoides para la fertilización artificial. Sin embargo, la criopreservación podría ser una fuente de estrés oxidativo que podría ser perjudicial para los espermatozoides4 como estudios han reportado un efecto beneficioso de la suplementación con antioxidantes. Inhibición de ROS a través de antioxidantes mitocondriales dirigido fue supuestamente beneficiosa para la criopreservación de espermatozoides en el bagre amarillo5.
Por lo tanto, los niveles de ROS en las muestras de semen son importantes conocer, particularmente después de la criopreservación6,7 ya que estas moléculas han sido reconocidas como una desventaja para la supervivencia de la esperma y fertilidad8. Por otra parte, estudiar la distribución de ROS dentro de la célula podría ser crucial para inferir el nivel de daño potencial. Por ejemplo, bajos niveles de ROS en la mitocondria podrían suponerse normal y compatible con la función del esperma, pero altos niveles de ROS en el núcleo podrían ser indicadores de daño del ADN de espermatozoides. H2O2 es uno de los ROS más relevantes que podrían ser liberados de la mitocondria y penetrar en el núcleo porque es una molécula pequeña y sin carga9. Diacetato de Diclorofluoresceína (DCFH-DA) puede revelar específicamente peróxido intracelular emite fluorescencia verde. En este artículo, se presenta un protocolo detallado para detectar la localización intracelular de H2O2 en Solea senegalensis esperma usando microscopia confocal.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Grado Analítico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, Grado Analítico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTrackerRojo Profundo&nbsp;</td><td>Microcentrífuga Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>(refrigerada)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerchamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>correderas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de ubicación intracelular de especies reactivas de oxígeno en espermatozoides de solea senegalensis

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

El estrés oxidativo es uno de los factores importantes en la disminución de la calidad del esperma. El desarrollo de protocolos eficientes para la detección de especies de oxígeno reactivo (ROS) en espermatozoides es de gran importancia en cualquier especie, pero estos métodos son raramente usados y aún menos en teleósteos. La criopreservación es una técnica útil en acuicultura para diversos propósitos, incluyendo banca de gene y garantizada la disponibilidad de espermatozoides durante todo el año. Procedimientos de congelación/descongelación puede causar producción de ROS y dañar las células de esperma. Teniendo en cuenta los posibles dañan podría causar un exceso de producción de ROS en espermatozoides dependiendo de su localización, aquí una metodología detallada para detectar H2O2 y evaluar su localización intracelular mediante microscopía confocal se proporciona. Para ello, se utiliza una combinación de 3 fluorocromos (2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA), una mancha en mitocondrias y 4′, diclorhidrato 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) para evaluar la co-localización de H2O2 con núcleos de espermatozoides o mitocondrias en Solea senegalesis muestras de esperma.

La microscopia confocal es un método ideal para evaluación de ROS intracelular en teleósteos de la esperma. La combinación de tres fluorocromos (DAPI, una mancha de mitocondrias y DCFH-DA) presentada en este estudio (figura 1) proporcionan mucha información útil que puede ser aplicado en la investigación básica y puede tener aplicaciones en la mejora de procedimientos utilizados en plantas de acuicultura industrial, tales como protocolos de criopreservación. ...

Este protocolo describe una metodología detallada para detectar la localización de2 H2O en Solea senegalensis espermatozoides con un fluorocromo sensible DCFH-DA para ROS, una mancha de mitocondrias vivo para las mitocondrias y DAPI para núcleos visualización, respectivamente. El protocolo está diseñado para ser realizado dentro de 2 h con espermatozoides frescos o descongelados.

Evaluación de ubicación intracelular de especies reactivas de oxígeno en espermatozoides de Solea Senegalensis

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

El objetivo general de este experimento es evaluar la localización intracelular de las especies reactivas de oxígeno dentro de los espermatozoides de Solea senegalensis mediante microscopía confocal. Las especies reactivas de oxígeno tienen implicaciones en la seguridad de la función espermática efectiva, provocando daño celular a diferentes niveles. Los espermatozoides podrían ser particularmente sensibles al estrés oxidativo, ya que la peroxidación lipídica puede producir un efecto negativo sobre la motilidad y la fertilización.Las especies reactivas de oxígeno incluso pueden desencadenar una vía apoptótica intrínseca. El peróxido se libera de las mitocondrias y puede penetrar en el núcleo, afectando el ADN, ya que es una molécula pequeña y sin carga. En este protocolo utilizamos un fluoróforo que, tras ser incorporado en la célula, puede modificarse mediante una reacción oxidativa, emitiendo fluorescencia verde.Por lo tanto, puede conocer exactamente la localización de las especies reactivas de oxígeno. En este video trabajamos con espermatozoides de Solea senegalensis, pero puede utilizar este protocolo con especies relacionadas de interés comercial, o con madres como Sibrifis o Mirica. Algunos ejemplos del uso de esta técnica en los campos de la biología reactiva física o la apicultura son.La evaluación de la crioprecipitación siguiendo protocolos. La comparación de las etiquetas de especies reactivas de oxígeno antes y después de esta activación espermática. O bien, puede correlacionar las etiquetas de especies reactivas de oxígeno con respiradores buenos y malos.En primer lugar, prepare los stocks de sus fluorocromos. Tenga en cuenta que debe manipular los fluorocromos según las recomendaciones de la hoja de datos de seguridad. Se debe tener especial cuidado al pesar y preparar los stocks.Mantenga las soluciones stock en alícuotas a menos 20 grados centígrados hasta que sean necesarias. En este protocolo utilizamos tres fluorocromos. El colorante fluorescente de color rojo lejano tiñe las mitocondrias en células vivas y puede utilizarse para la localización mitocondrial.DAPI, que es una sonda ampliamente utilizada en microscopía de fluorescencia para la tinción de ADN. Se une fuertemente a regiones ricas en adenina y timina en el ADN. Y, el 27-diclorofluoresceína diacetato es una sonda permeable a la célula y no fluorescente.Se desesterifica intracelularmente y se convierte en 2',7'-diclorofluoresceína altamente fluorescente tras la oxidación. Este protocolo puede iniciarse con espermatozoides frescos o criopreservados. En este caso, utilizamos una muestra criopreservada.Prepare un baño para descongelar a 40 grados centígrados. Limpie el material. Con la protección corporal adecuada, seleccione su pajilla criopreservada.Sumerja la pajilla en el baño durante siete segundos. Con tijeras, vierta la muestra descongelada en un tubo de microcentrifugado. Trabaje siempre a cuatro grados centígrados.Centrifugar la muestra durante un minuto. Eliminar cuidadosamente los crioprotectores sin afectar los sowels sedimentados. Suspender en un pequeño volumen de 50 o 100 microlitros de solución RINGA.Coloque en una nueva cámara de conteo tipo cámara de Neubauer o similar una dilución de su suspensión celular y cuente las células. Calcule la concentración de esta muestra. Diluya la suspensión celular hasta uno o dos millones de células por milímetro, en un volumen final de 0,5 mililitros en solución RINGA previamente enfriada.Los espermatozoides deben manipularse suavemente durante la pipetación y la resuspensión. Añada 3,125 microlitros de la solución stock de diacetato de diclorofluoresceína a la solución de muestra de trabajo. La concentración final en la muestra es de 25 micromolar.Incubar de cuatro a siete grados centígrados durante 40 minutos. Después de 30 minutos, añadir a la muestra 0,5 µL de la solución stock de DAPI y 0,5 µL de la solución stock de colorante mitocondrial. Ambos fluorocromos tienen un tiempo de incubación de 10 minutos.Coloque una gota de suspensión celular concentrada de cinco microlitros sobre un portaobjetos. Coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la preparación y séllela. Encienda el equipo y seleccione el objetivo de 100 aumentos en el panel de control.Ubique la muestra en el microscopio y encienda la lámpara. El software del sistema permite seleccionar directamente los fluorocromos que necesite a partir de una lista. Elija el conjunto.DAPI, con un máximo de excitación de 465 nanómetros, MitoTracker Deep Red con un máximo de excitación de 662 nanómetros, y DCF con un máximo de emisión de 525 nanómetros. Redirija el haz hacia los oculares. Enfoque un campo de interés.Vuelva al software y seleccione el tamaño del cuadro. Establezca el modo de escaneo bidireccional para obtener una mejor resolución. Elija la velocidad de escaneo deseada.Abra y centre el área de escaneo para comenzar. Tome una imagen del campo. Utilizando la herramienta de recorte, seleccione la región de interés y presione Directo.Luego habrá seleccionado su área de trabajo. Con la ayuda de la herramienta indicadora de rango, ajuste el desplazamiento digital para reducir el fondo. Haga esto para cada canal y tome su imagen.Este es un ejemplo de los resultados. Para una imagen fusionada, los canales individuales de cada fluorocromo y sus combinaciones. Este es un esquema de etiquetado de una célula espermática de Solea senegalensis.Después de observar las imágenes adquiridas, puede notarse que DAPI y MitoTracker se localizan, como era de esperar, dentro del núcleo y del anillo mitocondrial, respectivamente. El primer paso consiste en realizar un experimento de zed-stack. Vaya a la ventana de zed-stack y, con la ayuda del enfoque fino, seleccione la primera y la última posición de adquisición.Elige los parámetros óptimos de adquisición y realiza el experimento. Obtendrás imágenes para cada portaobjetos. Este es un ejemplo de un resultado de zed-stack.Puede separar los canales y observar la ubicación de cada señal dentro de las células. Al pasar a la ventana 3D, puede seleccionar diferentes opciones de gráficos. Puede personalizar muchos parámetros y separar o combinar canales.Este es un ejemplo de vistas en 3D que muestran diferentes patrones de localización de especies reactivas de oxígeno dentro del esperma de Solea senegalensis. En el campo superior, el DCF se colocaliza principalmente con las mitocondrias; mientras que, en el campo inferior, la señal se extiende hacia el núcleo. Tras ver este video, ya sabe cómo evaluar la localización intracelular de peróxidos en estos espermatozoides utilizando microscopía confocal.Puede encontrar consejos de solución de problemas y otra información en el texto.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se adaptó un conjunto de protocolos para la medición de especies reactivas de oxígeno (ROS) que se pueden aplicar en varios modelos celulares de ameba y de mamíferos para estudios cualitativos y cuantitativos.

La detección, la visualización y cuantificación de la generación de especies reactivas de oxígeno en un sistema modelo de la ameba

Aquí presentamos un protocolo para medir el estrés oxidativo en embriones vivos de pez cebra. Este procedimiento permite la detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) tanto en tejidos embrionarios completos como en poblaciones unicelulares. Este protocolo llevará a cabo análisis cualitativos y cuantitativos.

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

Espectroscopia de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es un método inequívoco para medir a los radicales libres. El uso de puntas de prueba de giro selectivo permite la detección de radicales libres en diferentes compartimentos celulares. Se presenta un método práctico y eficiente para recolectar muestras biológicas que facilitan el tratamiento, almacenamiento y transferencia de muestras para mediciones de EPR.

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

Aquí, presentamos a metodologías para evaluar la integridad de la membrana de spermatozoan, una característica celular asociada con la capacidad de fertilización del esperma. Se describen tres técnicas para la evaluación de fluorimétrico de las membranas del esperma: coloración simultánea con sondas fluorescentes específicas, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo avanzada dedicado de esperma. También se presentan ejemplos de la combinación de las metodologías.

Fluorimétrica de técnicas para la evaluación de las membranas del esperma

Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.

Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular

La escherichia coli es la principal causa de meningitis bacteriana gram-negativa neonatal. Durante la infección bacteriana, las especies reactivas de oxígeno producidas por neutrófilos desempeñan un papel bactericida importante. Aquí introducimos un método para detectar las especies reactivas de oxígeno en neutrófilos en respuesta a la meningitis E. coli.

Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

Aquí, proponemos un protocolo sistematizado, accesible y reproducible para detectar especies reactivas celulares de oxígeno (ROS) utilizando una sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). Este método cuantifica los niveles totales de ROS celulares con un citómetro de flujo. Este protocolo es muy fácil de usar, adecuado y reproducible.

Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller

El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos

En este trabajo se presenta un protocolo económico y eficaz para examinar los leucocitos positivos para peroxidasa en el semen. Con la ayuda de un sistema de análisis de semen asistido por computadora (CASA), la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa en el semen se puede obtener en un total de 60 minutos, mejorando efectivamente la eficiencia del laboratorio de andrología y los andrólogos.

Examen de leucocitos positivos para peroxidasa en el semen

Este protocolo describe un método novedoso para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares utilizando dihidroetidio (DHE) como sonda de colorante de fluorescencia utilizando un enfoque de cribado de alto rendimiento. El protocolo describe los métodos para la evaluación cuantitativa de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en las tres líneas celulares diferentes de carcinoma hepatocelular.

Evaluación de cribado de alto rendimiento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE)

Aprende a evaluar la localización intracelular de especies reactivas de oxígeno en espermatozoides de Solea senegalensis mediante microscopía confocal con fluorocromos específicos. Este método permite visualizar H2O2, mitocondrias y núcleo para estudiar el estrés oxidativo en biología reproductiva.

Evaluación de ubicación intracelular de especies reactivas de oxígeno en espermatozoides de Solea Senegalensis

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