Name: Colección de Semen aviar por masaje Cloacal y el aislamiento de ADN de esperma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprende a recolectar semen aviar mediante masaje cloacal y extraer ADN de alta calidad usando un kit comercial modificado. Este método no invasivo permite estudios de ecología evolutiva y epigenética en aves silvestres o cautivas.

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Agradecemos a Jose Noguera de asistencia temprana con masaje cloacal, y Jeffrey Kittilson de laboratorio de apoyo. Este trabajo fue apoyado por un premio ND EPSCoR FAR0022429 BJH. Los costos de publicación generosamente fueron apoyados por el Departamento de ciencias biológicas de ganado.

Este protocolo implica sujetos animales vertebrados y ha sido aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en Universidad de estado de Dakota del norte.
1. colección de semen de passerine pájaro mediante masaje cloacal
Nota: El masaje Cloacal es una técnica de colección de semen eficaz reproductivamente activa aves solamente, pero puede realizarse con éxito fuera de la temporada de cría en situaciones de cautiverio apropiadas. Actividad reproductiva debe determinarse para las especies de destino antes de utilizar el masaje cloacal. Esta técnica puede utilizarse en aves silvestres después de captura o en aves en cautiverio.
<ol><li>A partir de un pájaro masculino, (en condición de cría) agarre de bander en la mano no dominante, transferir el pájaro a la mano dominante con la parte ventral, tocando la palma (figura 1).<ol>
<li>Asegúrese de que la cabeza de pájaro es más cercano el borde lateral de la palma. Fijar ligeramente la cabeza y el cuerpo utilizando el pinky, anillo y los dedos medios. Esto deja el pájaro ventilación y cola expuesta.</li>
		<li>Deja las piernas de pájaro suelto o ligeramente restringida utilizando la palma.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> Figura 1 : Apretón para masaje cloaca. El pájaro se fija ligeramente en la mano dominante con su lado ventral tocar la palma y la cabeza asegurada por el dedo meñique. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2"><li>Coloque el dedo dominante del índice y el pulgar a cada lado del extremo superior de la cloaca y apriete ligeramente los dedos juntos mientras aplica presión ligera hacia la cola ( figura 2). La cloaca se vuelque, exponiendo la mucosa cloacal (rosa interior). Nota: Si el pájaro no está actualmente produciendo semen, protuberancia cloacal puede ser pequeña y la cloaca es difícil de evert. Con experiencia, es fácil distinguir entre las cloacas de los machos reproductivamente activos e inactivos5,11.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> Figura 2 : Posición y protuberancia cloacal del dedo. Vuelque la cloaca aplicando ligera presión en el extremo superior (A). En un paseriformes machos reproductivamente activos, la protuberancia cloacal es evidente y la empresa (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="3"><li>Con la mano no dominante, coloque la almohadilla del dedo índice en el lado dorsal de la base de la cola para estabilizar la mano y luego colocar la punta del pulgar justo por debajo de la cloaca evertido. Nota: La miniatura de un corta y suave es ventajosa para realizar masaje cloacal y protege a las aves de lesiones accidentales.</li>
	<li>Mueva el pulgar no dominante profundamente y cranially en un movimiento repetitivo con presión media, está por debajo de la cloaca. Continúe hasta que el ave eyacule. Dependiendo de la persona, esto normalmente toma entre 1 y varias docena pasadas.</li>
	<li>Tan pronto como el pájaro eyacula, recoger el semen en un tubo de microhematocrito. Repita el masaje cloacal para obtener múltiples eyaculados. Nota: Paseriformes semen es marrón claro y suele tener una consistencia algo espesa. Sustancias oscuras o blanco expulsadas de la cloaca no están semen y pueden contaminar la muestra de semen. La aparición de una pequeña cantidad de sangre en la cloaca o mezclado con el semen generalmente es causado por demasiada presión durante el masaje.</li>
	<li>Para la extracción de ADN, coloque el semen en un tubo de microcentrífuga con 20 μl de 1 x PBS (pH 7.4). Nota: El Semen almacenado en PBS 1 x no es conveniente para la inseminación artificial, pero puede ser utilizado para la extracción de ADN en una fecha posterior cuando se almacena a-80 ° C. El PBS puede ser temperatura ambiente o fría, pero debe estar en estado líquido cuando se deposita la muestra de semen.<ol>
<li>Confirmar la presencia de espermatozoides en la muestra mediante la visualización de una pequeña cantidad de la muestra diluida bajo un microscopio compuesto (figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Almacenar el semen diluido a-80 ° C hasta la extracción.</li>
</ol>2. extracción de ADN de semen de aves
Nota: Este protocolo ha sido probado con múltiples kits comerciales de extracción de ADN, pero sólo ha tenido éxito cuando se utiliza con un ADN kit12. Pasos que se modificarán el protocolo del kit se indican con *.
<ol><li>Preparar una solución de 1 M de Ditiotreitol (DTT) en agua y mezclar con un vortex.*<ol>
<li>Alícuota de la solución DTT y almacenar a-20 ° C hasta inmediatamente antes del uso. Cada muestra se extrae requiere 10 μl de 1 M TDT solution.*</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una memoria intermedia que contiene 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM de NaCL; y 4% SDS. Cada muestra se extrae requiere 90 μl de este buffer.*<ol>
<li>Almacenar el buffer a temperatura ambiente. Si ha precipitado, caliéntelo a 56 ° C para dissolve.*</li>
	</ol>
</li>
	<li>Precalentar una incubadora que contiene un eje de balancín o coctelera a 65 ° C.*</li>
	<li>Inmediatamente antes de comenzar la extracción, mezclar 10 μl TDT solución con 90 μl del buffer preparado en el paso 2.2 para cada muestra se extrae, por ejemplo, 900 μl de tampón más solución DTT 100 μl si extraer 10 muestras. Esta mezcla se llama TDT-buffer.*</li>
	<li>Añadir 70 μl 1 x PBS a la muestra de semen diluido todo y mezclar bien con un vortex.*</li>
	<li>Añada 100 μl tampón de TDT y 10 μl proteinasa K solución de la muestra. Vórtex por 20 segundos, luego incubar en la incubadora precalentada durante 1 hora en un eje de balancín o shaker.*</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón AL y 200 μL EtOH fresco (100%) y agitar por 20 segundos.*</li>
	<li>Transferencia de toda la muestra a una columna de spin y centrifugar 1 minuto a x 6.000 g. Deseche el tubo de la colección.</li>
	<li>Coloque la columna en un nuevo tubo y agregar 500 μl preparado de tampón de AW1. Centrifugar 1 minuto a x 6.000 g. Deseche el tubo de la colección.</li>
	<li>Coloque la columna en un nuevo tubo y agregar 500 μl preparado de tampón de AW2. Centrifugue durante 1 minuto a 6.000 x g. Deseche el flujo y el lugar la columna de nuevo en el tubo.</li>
	<li>Centrifugar 3 minutos a 20.000 x g. Deseche el tubo de la colección y coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Pipeta 35 μl de AE directamente sobre la membrana de la columna de búfer e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.*</li>
	<li>Centrifugar 1 minuto a 14.000 x g. descarte la columna spin y almacene extraídas muestras a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1349186">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li>
<li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+life+histories%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li>
<li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+male+gamete%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li>
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<li>Wolfson, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4510381?seq=1#page_scan_tab_contents">The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds.</a> Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).</li>
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<li>Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00265-009-0871-x">Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).</li>
<li>Purchase, C. F., Earle, P. T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jai.12070/abstract">Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data.</a> J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).</li>
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<li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-048X.2008.04623.x/abstract">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li>
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<li><a target="_blank" href="https://www.scribd.com/document/54238221/QIAamp-DNA-Micro-Handbook">QIAamp DNA Micro Handbook</a>. , Third edition (2014).</li>
<li>Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+DNA+extraction+method+for+sperm+on+the+perivitelline+membrane+of+avian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs.</a> Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).</li>
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<li>Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li>
<li>Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semen+collection+and+spermatozoa+characteristics+in+budgerigars+%28Melopsittacus+undulates%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Rec%22%5BJournal%5D)">Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates).</a> Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).</li>
<li>Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/232663050_Attempted_Semen_Collection_Using_the_Massage_Technique_and_Semen_Analysis_in_Various_Psittacine_Species">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Describimos un método simple y confiable para la recogida de semen de aves pequeñas y medianas en condición activa reproductivamente y extracción de ADN de esperma aviar.
El protocolo de extracción de ADN de semen descrita es modificado a partir de un kit para la simplicidad, pero fue refinado para el uso en semen aviar. Espermatozoides son resistentes a la lisis por productos químicos de extracción estándar9,13, y las muestras de seme...

Las aves son sujetos ideales para estudios relacionados con la calidad del esperma y competencia1esperma telomere dinámica2, epigenética3y temas similares, como son ampliamente utilizados en la investigación biológica y esperma puede probarse fácilmente usando cloacal masaje. Masaje cloacal es una técnica manual suave, no invasiva para la recogida de semen de aves4,5,6. Muestras repetidas pueden obtenerse fácilmente y herramientas especiales no se necesitan, lo que facilita llevar a cabo en el campo o en laboratorio. Aunque masaje cloacal ha estado en uso durante décadas, es difícil aprender de las descripciones por escrito disponible. Esta publicación se pretende reducir el tiempo y la incertidumbre implicados en el aprendizaje de masaje cloacal.
Semen de aves con masaje cloacal puede ser utilizada inmediatamente para movilidad evaluación4,7 o8de la inseminación artificial, o congelado para otros usos como proyección de imagen avanzada y extracción de ADN. Muestras de semen de las aves paseriformes son pequeñas pero contienen esperma densamente. Se extrajo ADN utilizando un kit comercial de extracción para la simplicidad, con modificaciones para superar las características de protección especializadas de esperma9. Después de la extracción, se pueden medir los telómeros de esperma utilizando qPCR10.

<table><tbody><tr><td>Tubos capilares de microhematocrito</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>Se puede utilizar cualquier proveedor. Los tubos más pequeños pueden ser más efectivos para la recolección de muestras de semen pequeñas, como las de aves paseriformes muy pequeñas como el gorrión astillador.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se utiliza para almacenar muestras de semen antes de la extracción de ADN.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>Se puede utilizar cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>Se puede utilizar cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>Se puede utilizar cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>Se puede utilizar cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA micro kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Qiagen QIAamp DNA micro kit se recomienda específicamente. Este protocolo de extracción de ADN se ha intentado con otros kits comerciales, pero con poco éxito. Las razones de esto son desconocidas para nosotros.</td></tr></tbody></table>

colección de semen aviar por masaje cloacal y el aislamiento de adn de esperma

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Colección de semen puede ser útil para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo estudios que involucran la calidad del esperma, esperma telomere dinámica y epigenética. Las aves son temas ampliamente utilizados en la investigación biológica y son ideales para estudios con muestras de esperma repetidas. Sin embargo, pocos recursos están disponibles para aquellos que deseen aprender a recoger y extraer ADN de esperma aviar. Aquí describimos cloacal masaje, una técnica manual suave, no invasiva para la recogida de esperma aviar. Aunque esta técnica se establece en la literatura, puede ser difícil de aprender de las descripciones disponibles. También ofrecemos información para la extracción de ADN de semen aviar utilizando un kit de extracción comercial con modificaciones. Masaje cloacal puede utilizarse fácilmente en cualquier pájaro macho tamaño pequeño a mediano en condición reproductiva. Después de colección, el semen puede ser utilizado inmediatamente para los ensayos de motilidad, o congelado para la extracción de ADN siguiendo el protocolo descrito en este documento. Este protocolo de extracción fue refinado aviar de los espermatozoides y se ha utilizado con éxito en muestras recogidas de varias especies de paseriformes (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusy migratorius de Turdus ) y un columbid (Columba livia).

Cloacal de masaje y extracción de DNA usando que el protocolo descrito ha llevado a cabo en varias especies de passeriformes y uno columbid (tabla 1). La presencia de espermatozoides en las muestras de semen recogidas por masaje cloacal fue confirmada mediante la visualización de una pequeña cantidad de las muestras bajo un microscopio compuesto con 400 aumentos (figura 3). Después de extraer ADN de muestras de semen recogidas de gorriones, u...

Este protocolo describe cloacal masaje, una técnica manual no invasivo para la recogida de semen de aves y la extracción de ADN de esperma aviar utilizando un kit de extracción comercial con modificaciones.

Colección de Semen aviar por masaje Cloacal y el aislamiento de ADN de esperma

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

El objetivo general de este procedimiento es recolectar semen de aves macho y aislar ADN a partir de las muestras de semen. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en ecología conductual y evolutiva relacionadas con la competencia espermática y la herencia epigenética. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de usar.El masaje cloacal se puede realizar rápidamente en el campo o en el laboratorio, y el método de extracción de ADN utiliza un kit disponible comercialmente con modificaciones. Esta técnica se puede usar en aves silvestres o en cautiverio durante la temporada de reproducción, y en ciertas situaciones de cautiverio puede ser efectiva durante todo el año. Tome al macho reproductivamente activo con un agarre de anillador en la mano no dominante.Luego, traspáselo a la mano dominante con su cara ventral tocando la palma y con la cabeza en el borde lateral de la palma. Ahora sujete ligeramente la cabeza y el cuerpo utilizando el meñique, el anular y el medio. El ano y la cola del ave quedan ahora expuestos.Las patas pueden dejarse sueltas o ligeramente sujetas con la palma de la mano. A continuación, evertir la cloaca colocando el dedo índice y el pulgar de la mano dominante a ambos lados de su extremo superior y presionando suavemente mientras se aplica una ligera presión hacia la cola. La mucosa cloacal de color rosa debe aparecer claramente, a menos que el ave no esté produciendo semen.Con experiencia, es fácil diferenciar entre las cloacas de machos reproductivamente activos e inactivos. Para recolectar semen, coloque la yema del dedo índice de la mano no dominante sobre la parte dorsal de la base de la cola para mantenerla estable, y luego coloque la punta del pulgar justo debajo de la cloaca evaginada. Se recomienda encarecidamente tener una uña corta y lisa.Ahora mueva el pulgar profundamente y cranealmente con un movimiento repetitivo y presión media, manteniéndose por debajo de la cloaca hasta que el ave eyacule. Esto puede llevar desde una sola pasada hasta varias docenas de pasadas. Tan pronto como el ave eyacule, recoja el semen viscoso de color marrón claro en un tubo de microhematocrito.Las sustancias blancas o oscuras son contaminantes, mientras que cualquier cantidad de sangre indica que se aplicó demasiada presión. Repita el masaje según sea necesario para obtener múltiples eyaculados. Para la extracción de ADN, transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga con 20 microlitros de PBS.Para confirmar la presencia de espermatozoides en la muestra, observe una pequeña cantidad de la muestra diluida bajo un microscopio compuesto a un aumento de 400X. Luego, almacene las muestras de espermatozoides a −80 grados Celsius hasta que sean necesarias. Este protocolo es una modificación de un kit comercial.Prepare alícuotas de 10 microlitros de DTT unimolar en agua, almacenadas a menos 20 grados Celsius. Justo antes de comenzar la extracción de ADN, mezcle una alícuota de DTT con una alícuota de cloruro de tris para cada muestra. A continuación, agregue 70 microlitros de PBS a cada muestra y vortexee las mezclas.Luego, agregue una mezcla de tampón DTT y 10 microlitros de solución de proteinasa K a cada muestra. Para mezclar las muestras, agítelas en vórtex durante 20 segundos. A continuación, coloque las muestras en un incubador a 65 grados celsius con agitación suave y márquelas durante una hora con agitación constante.Después de la incubación, agregue 200 microlitros de tampón AL y 200 microlitros de etanol fresco al 100%, y vortexee las muestras durante 20 segundos. Luego, transfiera cada muestra a una columna de centrifugación y centrifugue las muestras durante un minuto a 6,000G. Deseche el tubo recolector y coloque las columnas en nuevos tubos.Añada 500 microlitros del tampón AW1 a la columna y centrifugue las columnas nuevamente. Descarte nuevamente el tubo recolector y coloque las columnas en tubos nuevos. Ahora añada 500 microlitros del tampón AW2 y repita el ciclo de centrifugación.A continuación, deseche el flujo pasante y regrese la columna de centrifugación al centrífugo durante tres minutos de centrifugación, ahora a 20.000G. Luego deseche el tubo recolector y coloque la columna sobre un tubo de microcentrifugado. Ahora, directamente sobre la membrana de la columna, agregue 35 microlitros del tampón AE y deje que la solución eluya el ADN durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, transfiera el tampón de elución con el ADN al tubo de microcentrífuga mediante una centrifugación de 60 segundos. Ahora deseche las columnas y almacene el ADN a menos 80 grados centígrados. Los métodos descritos de masaje cloacal y extracción de ADN se han utilizado con éxito en varias especies de paseriformes y en una especie de columbiforme.Cuando una electroforesis en gel del ADN extraído presenta bandas definidas sin difuminación, esto indica un aislamiento exitoso de ADN de alta calidad. Este ejemplo corresponde a ADN de semen de gorri&oacute;n com&uacute;n. Despu&eacute;s de ver este video, deber&iacute;a tener una buena comprensi&oacute;n de c&oacute;mo recolectar suavemente muestras de semen de aves macho reproductivas mediante masaje cloacal, y c&oacute;mo extraer ADN de esas muestras de semen utilizando un kit de extracci&oacute;n.Una vez dominado, el masaje cloacal puede realizarse en solo segundos si se realiza correctamente.

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Investigación

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Este protocolo presenta una técnica sencilla de microaspiración para aislar células somáticas (SC) viables a partir del semen equino criopreservado. A diferencia de los enfoques tradicionales, esta técnica evita cultivos in vitro prolongados y supera la contaminación de espermatozoides, permitiendo su uso inmediato en la clonación de células somáticas.

Una técnica sencilla de microaspiración para aislar células somáticas de semen equino criopreservado como donantes nucleares para clonación

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