Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

El objetivo general del ensayo HS-MRM es reducir el fenómeno de interferencia MRM que afecta a la cuantificación de péptidos o proteínas mediante la combinación de la movilidad iónica, la separación de los precursores de péptidos con la detección por espectrometría de masas de alta resolución de iones fragmentados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el área de la caracterización bioterapéutica, así como en la cuantificación de biomarcadores de proteínas o péptidos y la proteómica cuantitativa. La principal ventaja de esta técnica es que permite la detección de proteínas de células huésped poco abundantes que podrían estar presentes en proteínas biofarmacéuticas.

Primero, haga clic en crear método de análisis en el software de adquisición de datos y elija generar y adquirir y procesar método. Escriba el nombre y la descripción del método, vaya a la carpeta del método y haga clic en Siguiente. En Tipo de análisis, elija mapa de péptidos IMS y haga clic en Siguiente.

A continuación, seleccione la configuración actual del sistema y haga clic en Siguiente y finalizar. En el método recién creado, haga clic en la pestaña de instrumentos, seleccione el administrador de solvente binario y edite la configuración del gradiente para lograr la separación de péptidos a un caudal de 0,2 mililitros por minuto. Utilice una dilución en gradiente de uno a 40% de solvente B en 30 minutos, seguida de un lavado en columna de dos minutos y un equilibrio de 10 minutos con un tiempo de ejecución total de 45 minutos.

A continuación, seleccione el administrador de muestras y establezca la temperatura de la muestra en 10 grados centígrados y la temperatura de la columna en 60 grados centígrados. En la pestaña de instrumentos, seleccione el instrumento Vion IMS QTof. En la sección de configuración, seleccione la sensibilidad para el modo de analizador e ingrese tres kilovoltios para el voltaje capilar, 100 grados Celsius para la temperatura de la fuente, 250 grados Celsius para la temperatura de desolvatación, 50 litros por hora para el flujo de gas cónico y 500 litros por hora para el flujo de gas de desolvatación.

Haga clic en la pestaña del experimento y seleccione MSE de alta definición para el modo. A continuación, introduzca 100 para masa baja, 2000 para masa alta y 0,4 segundos para el tiempo de exploración. En la sección de energía de colisión, escriba seis electronvoltios para la configuración de baja energía y elija una rampa de alta energía de 15 a 40 electronvoltios.

Para el tiempo de adquisición, use un tiempo de ejecución personalizado entre cinco y 30 minutos. A continuación, haga clic en la pestaña de opciones y seleccione el modo de corrección de bloqueo automático con un intervalo de corrección de bloqueo automático de cinco minutos. A continuación, seleccione la opción Continuar con la corrección de bloqueo y asegúrese de que la comprobación automática del detector esté desactivada.

En el menú de configuración actual del sistema, seleccione el instrumento Vion IMS QTof y haga clic en herramientas. Ingrese tres kilovoltios para el voltaje capilar, 40 voltios para el cono de muestreo, 100 voltios para la compensación de la fuente, 100 grados Celsius para la temperatura de la fuente, 250 grados Celsius para la temperatura de desolvatación, 50 litros por hora para el flujo de gas de cono, 500 litros por hora para el flujo de gas de desolvatación y tres kilovoltios para el voltaje capilar de referencia. Analice una muestra falsa con picos de 10 nanomolares previamente preparada utilizando el ensayo LC-HDMSE que se acaba de describir inyectando 10 microlitros de muestra en el instrumento.

Aquí se muestran las secuencias individuales de los seis patrones de péptido B de fosforilasa contenidos en la mezcla de péptidos falsos, junto con sus tiempos de retención y sus precursores más abundantes observados en el experimento HDMSE. Aquí se muestran los espectros HDMSE adquiridos para uno de los péptidos falsos con picos en el resumen de Infliximab. En el software de adquisición de datos, haga clic en crear método de análisis y elija generar y adquirir y método de proceso.

Escriba el nombre y la descripción del método, vaya a la carpeta del método y haga clic en Siguiente. En Tipo de análisis, elija cuantificar, seleccione Cuantificar ensayo Tof 2D Cromatográfico y haga clic en Siguiente. A continuación, seleccione la configuración actual del sistema y haga clic en Siguiente y finalizar.

Haga clic en la pestaña de instrumentos en el método recién creado. Seleccione el administrador de solventes binarios y edite la configuración del gradiente para lograr la separación de péptidos a un caudal de 0,2 mililitros por minuto. Utilice la dilución en gradiente de uno a 40% de solvente B en 30 minutos, seguido de un lavado en columna de dos minutos y un equilibrio de 10 minutos con un tiempo de ejecución total de 45 minutos.

En la pestaña de instrumentos, seleccione el administrador de muestras y establezca la temperatura de la muestra en 10 grados Celsius y la temperatura de la columna en 60 grados Celsius. Ahora seleccione el instrumento Vion IMS QTof y, en la sección de configuración, seleccione la sensibilidad para el modo de analizador. Luego ingrese tres kilovoltios para el voltaje capilar, 100 grados Celsius para la temperatura de la fuente, 250 grados Celsius para la temperatura de desolvatación, 50 litros por hora para el flujo de gas cónico y 500 litros por hora para el flujo de gas de desolvatación.

Haga clic en la pestaña experimento y, en Tipo de experimento, elija tabla de funciones una o más funciones MS, MSMS o MRM. Elimine la función de adquisición predeterminada, haga clic en agregar más MRM y edite los parámetros de la ventana de retención en la sección de tiempo de ejecución. En el editor de funciones Tof MRM, introduzca la relación de carga maestra del precursor peptídico, seleccione baja para la resolución del precursor e introduzca el estado de carga del precursor.

Luego ingrese la relación de carga maestra del producto 16 electronvoltios para la energía de colisión inicial, 0.1 segundos para el tiempo de escaneo fijo y ancho para la columna de espectro. Con el botón de duplicación, agregue 10 transiciones MRM más y use diferentes valores de energía de colisión en el rango de 18 a 36 electronvoltios. Después de establecer las tres mejores transiciones para cada péptido, se realizó un experimento Tof MRM para encontrar la energía de colisión óptima para maximizar las señales generadas para cada péptido.

A continuación, configure un método HS-MRM que contenga solo un ion fragmento por péptido. Modifique el método Tof MRM creado anteriormente seleccionando la función HS-MRM en lugar de la función Tof MRM. En el editor de funciones HS-MRM, introduzca la relación de carga maestra, seleccione baja para la resolución del precursor e introduzca el estado de carga del precursor.

A continuación, introduzca el valor CCS del precursor y seleccione bajo para la resolución del CCS del precursor. Para el ion producto, ingrese su relación de carga maestra, seleccione la energía de colisión óptima, elija un tiempo de escaneo de 0,4 segundos y seleccione una configuración de espectro amplio para incluir todos sus isótopos. El ensayo final HS-MRM conserva solo la mejor transición para cada péptido y se utiliza para analizar todas las muestras enriquecidas.

En el método de análisis creado para el método de adquisición de datos HS-MRM, haga clic en la pestaña propósito y elija administrar componentes. En el menú desplegable de Tipo de experimento, seleccione la opción HS MSMS/HS MRM. Haga clic en crear e introduzca el nombre del componente, el tiempo de retención previsto, la ventana de tiempo de extracción y la relación de carga maestra del precursor.

Seleccione el modo de extracción XIC y escriba el valor CCS esperado. Para el ion fragmento, introduzca su estado de carga y la relación de carga maestra. A continuación, introduzca todos los componentes peptídicos supervisados por el ensayo HS-MRM.

En la pestaña de propósito del mismo método de adquisición HS-MRM, haga clic en cantidades predeterminadas e ingrese 0.1, uno, 10 y 100 nanomolares para todos los componentes de péptidos falsos. Después de ingresar el primer valor, haga clic con el botón derecho y seleccione la opción de llenado para ingresar la misma concentración para todos los componentes. Repita el mismo procedimiento para las cuatro concentraciones de la curva de calibración.

Ahora vaya a la pestaña de procesamiento y haga clic en configuración de extracción. Entrada 10 PPM para tolerancia de masa. A continuación, haga clic en Tolerancia de tiempo de deriva CCS e introduzca 5% para la tolerancia CCS.

En la pestaña de procesamiento, seleccione la configuración de procesamiento máximo. En la sección de suavizado, seleccione la media como algoritmo de suavizado, una como la mitad del ancho y otra como las iteraciones. En la sección de integración, asegúrese de que las opciones de ancho de pico automático y detección automática estén marcadas.

A continuación, seleccione la configuración de la pantalla de destino en la pestaña de procesamiento y seleccione la opción más cercana a RT en la ventana RT. A continuación, introduzca 0,2 minutos para la tolerancia de tiempo de retención. Seleccione la configuración de cuantificación y, en el menú de calibración, elija lineal para el tipo de ajuste de la curva de calibración, uno sobre x cuadrado para el tipo de peso, concentración para el tipo de valor del componente, milimoles por litro para las unidades de valor del componente y ninguno para calcular los puntos de calibración mediante promedio.

En el menú cuantificar, seleccione el área como valor de respuesta. Aquí se presentan ejemplos de cromatogramas HS-MRM generados para los péptidos falsos en todas las concentraciones. Aquí se muestran las curvas de calibración obtenidas para cada péptido tras la integración de los picos HS-MRM.

A continuación se resume la desviación estándar relativa del área máxima calculada sobre la base de cuatro inyecciones repetidas. Debido a que el ensayo MRM de alta selectividad incorpora tanto la separación de precursores de movilidad iónica como la detección por espectrometría de masas de alta resolución dirigida, tiene un gran potencial para convertirse en un ensayo de monitoreo rápido y de alto rendimiento para múltiples proteínas de células huésped en lotes de productos biofarmacéuticos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar un ensayo MRM de alta selectividad en un instrumento Vion IMS QTof.