Name: Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprende el ensayo HS-MRM para cuantificar proteínas de células huésped en biofarmacéuticos mediante cromatografía líquida QTOF con espectrometría de masas por movilidad iónica.

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Los autores desean agradecer a Lesley Malouin y Tony Catlin de aguas Corporation para la preparación de la figura 6 del manuscrito.

1. preparación de la recopilación de infliximab (procedimiento de ~ 24 h)
<ol><li>Preparar soluciones frescas de 50 mM de bicarbonato de amonio, 1% de surfactante aniónico en 50 mM NH4HCO3, 500 mM Ditiotreitol (DTT) en 50 mM NH4HCO3y 500 mM Yodoacetamida (IAM) en 50 mM NH4HCO3.</li>
	<li>A 750 μl de 50 mM NH4HCO3, añadir 200 μL de mAb de infliximab (10 mg/mL) y 50 μl de solución al 1% surfactante aniónico y desnaturalizar la proteína durante 15 min a 60 ° C en presencia de surfactante aniónico de 0.05%.</li>
	<li>Agregar 40 μl de 500 mM DTT y reducir la muestra por 60 min a 60 ° C en presencia de 20 mM TDT.</li>
	<li>Añadir 20 μl de 500 mM IAM y alkylate la muestra durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad en presencia de ~ 10 m m IAM.</li>
	<li>Añadir el contenido del tubo de microcentrífuga a un frasco de vidrio que contiene 20 μg de MS grado secuencia Lys C/tripsina y digerir la muestra 3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir una segunda enzima alícuota (20 μg) mediante la transferencia de la muestra digerida a otro frasco de cristal que contiene 20 μg de MS grado secuencia Lys C/tripsina y digerir la muestra durante la noche (12-15 h) a 37 ° C.</li>
	<li>Después de la proteólisis durante la noche, añadir 5 μl del 100% ácido fórmico (FA) e incubar la digestión durante 30 min a 37 ° C para descomponer el ácido lábil tensioactivador aniónico.</li>
	<li>Desactivación de la recopilación durante 15 min a 4.000 x g en una centrífuga para precipitar el componente insoluble del Tensioactivo aniónico.</li>
	<li>Recuperar ~ 1.000 μl de la recopilación de infliximab y colocar en un frasco de muestreador automático de LC; la concentración de recopilación debe ser ~ 2 mg/mL. Guardar el resumen en un congelador a-20 ° C hasta que el sistema LC/MS está listo para el análisis.</li>
</ol>2. clavar de normas del péptido (~ 30 min)
<ol><li>Descongelar el Resumen de infliximab colocando la muestra congelada en el frasco de cristal en un banco a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 1 mL de 0.1% FA en frasco de digest de H2O a un conejo fosforilasa b (PHO) para preparar 1 μm soluciones para todos los seis estándares péptido de la PHO contenida en el vial (frasco contiene 1 nmol de cada péptido).</li>
	<li>Preparar diluciones de 4 x 1 mL de la solución madre de PHO para obtener soluciones que contienen 0.1, 1, 10 y 100 péptidos nM, utilizando 0.1% FA como el solvente de dilución. Preparar todas las diluciones en viales de vidrio (frascos del muestreador automático de LC) y añadir 100 μl de infliximab digest como la matriz de fondo a todos los frascos. Carga 2 μg de digest fondo en columna con cada inyección de 10 μl. Preparar una muestra en blanco que contiene el Resumen de infliximab diluido (el mismo 1:10 dilución), con no péptidos con picos.</li>
</ol>3. configuración del método de adquisición de datos LC/HDMS E
Nota: El flujo de trabajo que resume los pasos necesarios para configurar una adquisición de HS-MRM es representado en la figura 1 y se describe en detalle en las secciones 3-6. La adquisición de un conjunto de datos HDMSE independiente de los datos es necesaria para establecer el tiempo de retención de cada péptido monitoreado, el padre m/z del ion del péptido más abundante después de la ionización por electrospray, y el correspondiente CCS (choque Cruz sección) deriva de la separación de movilidad de iones. Además, el conjunto de datos independiente de los datos proporciona información sobre el m/z de los tres iones del fragmento más abundantes de cada precursor del péptido. En el segundo paso del flujo de trabajo (optimización de la CE), se incrementa la sensibilidad del ensayo de sintonización de la energía de la celda de colisión para obtener la intensidad más alta del ion para cada ión fragmento. Finalmente, en el paso final, todos los parámetros descritos anteriormente se introducen en el editor de método de HS-MRM para cada péptido monitoreado.
<ol><li>Realizar experimentos de LC/MS en un cuadrupolo tiempo de vuelo (QTOF) Espectrómetro de masas acoplado a un sistema de cromatografía líquida ultra utilizando un método de adquisición de datos-independiente (HDMSE). Nota: Información más detallada sobre la configuración del equipo está incluido en la sección Material. Este instrumento utiliza un dispositivo de movilidad de iones onda que viaja para la separación de péptidos precursores10.</li>
	<li>Preparar dos fases móviles que contiene 0,1% FA en agua (solvente A) y 0.1% FA en acetonitrilo (solvente B). Nota: Utilizar una columna de C18 híbrido superficie cargada (CSH) (2.1 x 150 mm, lleno de partículas de 1.7 μm) para la separación de los compendios mAb claveteados.</li>
	<li>En el software de adquisición de datos, haga clic en "Crear/análisis de método" y elegir "Generar una adquisición y método de proceso". Escriba el nombre de método, el método carpeta (directorio) y haga clic en "Siguiente".</li>
	<li>Para "Tipo de análisis," elegir "péptido mapa (IMS)" y en la pestaña de "Sistema de instrumento", seleccione el instrumento de "Gestor de solvente cuaternario". Edite la configuración del degradado para lograr la separación del péptido con un caudal de 200 μL/min uso una elución gradiente de 1 a 40% de disolvente B en 30min seguido de un lavado de columna de 2 min y un equilibrado de 9 min, con un tiempo de ejecución total de 50 minutos introducir estos experimental parámetros en el editor de método de LC.</li>
	<li>En la pestaña de "Sistema de instrumento", seleccione el instrumento de "Gestor de muestra". Ajustar la temperatura de la muestra a 10 ° C y la temperatura de la columna a 60 ° C.</li>
	<li>Operar el espectrómetro de masas QTOF en ion positivo modo de sensibilidad de ESI, con un poder de resolución típico de 30.000 FWHM. Nota: LC/HDMSE es un modo de adquisición de datos-independiente (DIA) que funciona recogiendo rápidamente exploraciones con energías de colisión (en la celda de colisión) se alterna entre una energía baja (6 V para los análisis de canal 1 de MS) y una energía elevada (15 - 40 V rampa a producen los espectros de fragmentación sin selección de precursor en el canal 2 de la MS).<ol>
<li>Ingrese los parámetros de MS relacionada con la fuente por defecto en el software de adquisición de datos: "Mi obra/instrumento sistema," seleccione la pestaña "Vion IMS Qtof" y en el menú "Herramientas", introduzca estos parámetros: 3.0 kV tensión capilar, temperatura de 100 ° C fuente, fuente de V 100 offset, 50 L/h cono de flujo de gas y 40 V tensión de cono. Ajustar la temperatura del desolvation a 250 ° C, el caudal de gas desolvation a 500 L/h y la tensión capilar de referencia 3.0 kV.</li>
		<li>En el software de adquisición de datos, haga clic en "Crear/análisis de método" y elegir "Generar una adquisición y método de proceso". Escriba el nombre del método y el método de carpeta (directorio) y haga clic en "Siguiente".</li>
		<li>Para "Tipo de análisis," elegir "péptido mapa (IMS)" y en la pestaña de "Sistema de instrumento", seleccione el instrumento "Vion IMS QTof". Haga clic en "Finalizar". Nota: El método LC/HDMSE recién creado se abre automáticamente en la pantalla "Configuración de método de instrumento".</li>
		<li>En la pestaña "Settings", entrar en estos parámetros: 3,0 kV tensión capilar, temperatura de fuente de 100 ° C, 250 ° C desolvation temperatura, flujo de gas de 50 L/h cono y flujo de gas de 500 L/h desolvation.</li>
		<li>En la configuración de la pestaña de "Experimento", elige "MSEde alta definición" y escoge "Tiempo del método de análisis." En la ficha "Configuración de exploración", introduzca estos parámetros: baja masa, 100; la Misa, 2.000; tiempo, 400 ms. en la pestaña de "CE" de exploración, tipo "6 V" para la configuración de baja energía y elegir una rampa de gran energía de 15 a 40 V. Asegúrese que "Reducción de datos desactivar" comprobada.</li>
		<li>Infundir una solución de encefalina leucina ng/mL 50 (LE) en 50% acetonitrilo con 0,1% FA a un flujo de 10 μl/min para la calibración de la masa de bloqueo durante la adquisición de datos. Nota: Los datos de bloqueo masa adquiere cada 5 min utilizando la misma tasa de adquisición sobre el mismo rango de masa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizar la muestra de 10 nM, tacon de PHO usando el análisis de LC/HDMSE descrito por inyección 10 μl de muestra (el importe cargado en la columna es 100 fmol para cada péptido estándar).</li>
</ol>4. configuración del método Tof-MRM para optimización de energía (CE) de colisión
<ol><li>Del conjunto de datos LC/HDMSE , obtener el tiempo de retención, el precursor y el fragmento iónico m/z para cada péptido PHO. Conservar la m/z y el estado de carga de los más abundantes iones del fragmento precursor ion y las correspondientes tres más abundantes. Nota: Un ejemplo de los espectros de baja energía y alta energía típicamente grabado por el análisis de LC/HDMSE se presenta en la figura 2.</li>
	<li>Uso de optimización energética (CE) de colisión en un experimento SRM/MRM para obtener la mejor señal para cada péptido23.<ol>
<li>En el software de adquisición de datos, haga clic en "Crear/análisis de método" y elegir "Generar una adquisición y método de proceso". Escriba el nombre de método, el método carpeta (directorio) y haga clic en "Siguiente".</li>
		<li>"Tipo de análisis," seleccione "Cuantificar". Elegir "Cuantificar ensayo cromatográfico de Tof 2D" y haga clic en "Siguiente". En la pestaña de "Sistema de instrumento", seleccione "Vion IMS QTof" y haga clic en "Finalizar". Nota: El método recién creado de Tof-MRM se abre automáticamente en la pantalla "Configuración de método de instrumento".</li>
		<li>En la pestaña "Settings", entrar en estos parámetros: 3,0 kV tensión capilar, temperatura de fuente de 100 ° C, 250 ° C desolvation temperatura, flujo de gas de 50 L/h cono y flujo de gas de 500 L/h desolvation.</li>
		<li>En la configuración de la pestaña de "Experimento", seleccione "Tabla de funciones" y elija "uno o varios MS, MSM o MRM funciones." Usando las flechas hacia abajo, de configurar una función de "Tof-MRM" para cada péptido introduciendo tres "transiciones" (combinaciones del precursor más abundante y tres de sus más abundantes iones fragmento). Nota: En modo Tof-MRM, la mayor sensibilidad se logra utilizando un enfoque MRM programado.</li>
		<li>En el editor de función "Tof-MRM", elegir una ventana de tiempo de retención para cada péptido (al menos 1 minuto de largo), dispuestas según el orden de elución de péptido. En el editor de función "Tof-MRM", inserte el péptido precursor m/z y el producto de m/z; Seleccione la ventana de aislamiento quad como "Low" (ventana 4-Da) para el precursor del péptido; Seleccione un tiempo de exploración fija de 100 ms; y elegir doce valores de la energía de colisión diferentes en el rango de 14-36 V, como sigue: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 y 36, como se muestra en el ejemplo de la figura 3. Nota: Con el método de Tof-MRM descrito anteriormente, por lo menos 10 puntos por pico cromatográfico se recogen para cada transición en cada CE especificado. Para reducir el tamaño del archivo de datos, seleccione la opción "Ancha" (Da 6 ventana) para la señal del ión fragmento. En la tabla 2 se muestran ejemplos de los valores de CE-optimizado.</li>
		<li>Analizar la muestra de 10 nM, tacon de PHO usando el ensayo de Tof-MRM descrito por vía parenteral 10 μl de muestra (el importe cargado en la columna es 100 fmol para cada péptido estándar).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. configuración del método de adquisición de MRM capítulo final para la cuantificación del péptido mediante separación de movilidad de iones precursores de péptidos
<ol><li>En el menú de "Investigar" el software de adquisición de datos, Mostrar todas las trazas cromatográficas 11 generadas para cada CE para cada péptido e integrar los picos utilizando el botón de "Integración" de la barra de herramientas "opciones de procesamiento y operaciones"; el área de pico más alto indicará el mejor CE para cada transición.</li>
	<li>Comparar las mejores zonas de pico para los 3 fragmentos de cada péptido visualmente y conservar sólo los mejores "transición" (el fragmento de iones que produce la señal más intensa); La tabla 2 muestra el mejor "transiciones" de cuatro péptidos PHO.</li>
	<li>Configuración de un método de HS-MRM que contiene sólo un ión fragmento por péptido. Utilice los valores del CCS de cada precursor del péptido del LC/HDMSE conjunto de datos.<ol>
<li>Modificar el método de Tof-MRM creado en la sección anterior (sección 4) seleccionando la función "HS-MRM" en lugar de la función de "Tof-MRM".</li>
		<li>En el editor de función "HS-MRM", especifique los siguientes parámetros relacionados con el precursor: m/z, resolución de cuadrupolo: bajo (Da 4), cargar estado, precursor CCS valor y resolución de CCS precursor: bajo. Para el ion del producto, ingrese su m/z, la energía de colisión óptimo, elegir un tiempo de exploración de 0,4 s y seleccione una configuración de "Amplio" espectro (6 Da) para incluir todos sus isótopos. Un ejemplo del método de adquisición capítulo MRM final para todos cuatro péptidos se presenta en la figura 4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizar todas las muestras utilizando el método de HS-MRM, a partir de la recopilación de mAb en blanco (muestra sin tacon), seguidas de 4 inyecciones replicadas (10 μl) de las siguientes concentraciones: 0.1, 1, 10 y 100 nM PHO péptidos.</li>
</ol>6. creación de un método de procesamiento para el análisis del conjunto de datos capítulo MRM
<ol><li>Crear un método de procesamiento para el análisis del conjunto de datos capítulo-MRM.<ol>
<li>En el método de análisis para el método de adquisición de datos "HS-MRM", haga clic en la pestaña de "Propósito" y elija "Administrar componentes."</li>
		<li>En el menú desplegable debajo de "Tipo de experimento", seleccione la opción "capítulo MS/MS/HS-MRM".</li>
		<li>Haga clic en "Crear nueva entrada" e introducir los siguientes parámetros en el editor de métodos de procesamiento: tiempo de retención del péptido (RT), estado de carga de precursor, precursor m/z y precursor deriva tiempo (DT). Para el ión fragmento, entrar en su estado m/z y carga y especificar el rastro "XIC" como el modo de extracción.</li>
		<li>En la pestaña de "Propósito" del mismo método de adquisición "HS-MRM", haga clic en"predeterminado" y entrar en las siguientes concentraciones: 0.1, 1, 10 y 100 nM PHO péptidos.</li>
		<li>Especifique los siguientes parámetros en los "ajustes de procesamiento y extracción": tolerancia total predeterminado, 10 ppm (para el m/z de todos los iones del fragmento) y por defecto deriva del tiempo, 5%; en la figura 5 se muestra un ejemplo del método de procesamiento del péptido PHO.</li>
		<li>Para el tipo de calibración, seleccione el ajuste de curvas lineales con 1 /2 carga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procesar los datos de HS-MRM para integrar todos los cromatogramas y construir las curvas de calibración de cada péptido PHO.</li>
</ol>

<ol><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutic+proteins+by+comprehensive+online+two-dimensional+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry.</a> MAbs. 4, 24-44 (2012).</li>
<li>Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+host-cell+protein+impurities+in+biotherapeutics+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry.</a> Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+tracking+of+host-cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6, 659-670 (2014).</li>
<li>Farrell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+host-cell+protein+analysis+using+two-dimensional+data+independent+LC-MS%28E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E).</a> Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2015-1202.ch013?src=recsys">Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques</a>. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+co-elution+of+host-cell+proteins+with+monoclonal+antibodies+during+protein+A+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification.</a> Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).</li>
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<li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+complete+characterization+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions%2C+LC%2FMS%2FMS+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis.</a> MAbs. 7, 1128-1137 (2015).</li>
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</ol>

Todos los autores son empleados de la Corporación de aguas, que es el productor de varios reactivos y los instrumentos utilizados en este artículo.

Alta resolución (Rs > 20.000) espectrometría de masas se utiliza rutinariamente para la caracterización estructural de proteínas terapéuticas en una variedad de plataformas de instrumento. En cambio, cuantificación de proteínas basada en MS se realiza típicamente por SRM/MRM en baja resolución (Rs ~ 1.000) tándem cuadrupolo espectrómetros de masas utilizando péptidos de firma generados por el clivaje enzimático de proteínas11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. separaciones cromatográficas unidimensional no pueden resolver completamente mezclas de complejos péptido producidos por la digestión enzimática, elución Co péptido es una ocurrencia común, incluso en el caso de un resumen de solo proteína. Por resúmenes muy complejas de proteínas (por ejemplo, para la cuantificación de PMP de 1-100 de EP en presencia de un fondo rico en péptidos producidos por la proteína terapéutica), la sensibilidad, exactitud y linealidad del SRM/MRM ensayo puede ser afectado por interferencia.
Los ensayos SRM/MRM tienen selectividad unidimensional, confiando sólo en una combinación "única" de las masas precursor/fragmento. Por este motivo, estos análisis fallan en situaciones cuando el fondo de péptido cambia inesperadamente (por ejemplo, para las muestras de la biofarmacéutica Obtenido de procesos de purificación diferentes). Para superar estas limitaciones, proponemos aquí un ensayo de alta selectividad (HS) MRM aplicado sobre un ion permitió movilidad alta resolución tiempo de vuelo (QTOF) híbrido espectrómetro de masas tetrapolar (para el esquema del instrumento, ver figura 6).
El instrumento se separa los precursores de los péptidos de interés a partir de otros precursores de péptidos (interferencia) Co liberador en la celda de movilidad de iones, aísla la envolvente completo isotópica del precursor en el cuadrupolo y fragmentos con un CE fija en el celda de colisión. La señal producida por su fragmento péptido más abundante es mejorarse ajustando la frecuencia del empujador (mejora de destino), que empuja selectivamente masivas regiones de interés en el tubo de vuelo, en lugar de todos los iones, como con un análisis completo. Cuantificación del péptido se realiza utilizando las señales de alta resolución MS (Rs ~ 30.000) producidas por este ión fragmento. En comparación con los ensayos SRM/MRM, el análisis de capítulo-MRM ofrece dos niveles adicionales de selectividad: uno proviene de la separación de la movilidad del ion precursor-nivel, mientras que el segundo se ofrece la mayor resolución masiva del analizador TOF. Los resultados de estas mejoras de selectividad son visibles en los cromatogramas de HS-MRM mostrados en la figura 7, que está libres de interferencias a través de tres órdenes de magnitud.
A diferencia de los ensayos SRM/MRM, hay varios parámetros que pueden ajustarse para optimizar el análisis de capítulo-MRM: la ventana de RT en el precursor del péptido (típicamente establecida en 0,2 min), la ventana de aislamiento de cuadrupolo (4 Da), la ventana de tiempo de la deriva que rodea el precursor (± FWHM de la cima del precursor de la mobilogram ion correspondiente) y la resolución MS del ion del fragmento (20.000-40.000). Los ensayos de HS-MRM son muy sensibles: el importe más bajo detectado para cada péptidos PHO es 1 femtomole en la columna (o 0,1 nM en términos de concentración de péptido). Cuando se considera péptido MW (ver tabla 1 para MWs exacta), la cantidad detectada en columna es del orden de 1-2 pg, mientras que la columna está cargada con una cantidad significativamente mayor (2 μg) de péptidos de fondo de la mAb digest.
Teniendo en cuenta el peso molecular de la proteína integral de PHO (97.2 kDa) de la cual se derivaron los péptidos con picos, el ensayo es capaz de detectar 50 ppm de una impureza de la proteína en presencia de iones de alta abundancia de fondo. Límites mínimos de detección (5-10 ppm) son alcanzables para un peso molecular más bajo EP (10-20 kDa). El ensayo abarca tres órdenes de magnitud (como se muestra en las curvas de calibración de la figura 8), lo que significa que puede medir la EP en la gama 1-1.000 ppm. Además, la reproducibilidad de los ensayos de HS-MRM, ilustrado en la tabla 3, coincide muy bien con la reproducibilidad de los ensayos SRM/MRM de moléculas pequeñas, con área de pico RSD mejor del 15%.
Exploraron las posibilidades de un nuevo análisis para la cuantificación de normas péptido con púas en un anticuerpo monoclonal (mAb) Resumen y demostraron su sensibilidad y su utilidad para cubrir el rango dinámico amplio (por lo menos tres órdenes de magnitud) típicamente encontrado en el análisis HCP. Todos los seis estándares de péptido se detectaron en concentraciones tan bajas como 0.1 nM (1 femtomole cargado en una columna cromatográfica de 2,1 mm ID) en presencia de un fondo de alta abundancia péptido (2 μg de una mAb digest cargado en columna). Al incorporar dirigida HRMS y separación de precursor de movilidad de iones, el análisis de capítulo-MRM tiene gran potencial para convertirse en un ensayo de seguimiento rápido y alto rendimiento para varios profesionales a través de múltiples lotes de productos biofarmacéuticos.

Cuantificación de grandes biomoléculas (proteínas) en ajustes industriales se basa actualmente en inmunoensayos (p. ej., ELISA), principalmente debido a varias ventajas: sensibilidad, alto rendimiento, facilidad de uso y bajo costo por muestra. Cuando se aplica para analizar las impurezas de la proteína de baja abundancia (ppm de 1-100 de las proteínas de la célula huésped (EP)) presentes en proteínas terapéuticas, estos ensayos biológicos proporcionan típicamente la concentración total de HCP (generalmente expresada en ppm o ng mAb HCP/mg), pero no se puede identificar y medir los contaminantes HCP. Recientemente se han desarrollado varios ensayos de MS para complementar a ELISAs o proporcionar información que Elisa no ofrecen1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. debido a la complejidad de la muestra y el requisito para detectar péptidos HCP a través de un amplio rango dinámico en la concentración (al menos 3 órdenes de magnitud), tienen métodos cromatográficos multidimensionales licitación fraccionamiento muestra amplia tradicionalmente utilizado para ayudar a identificar la abundancia baja EP1,2,3,4,5,6,7.
Un natural paso siguiente HCP identificación y validación es PCH seguimiento (monitoreo) a través de múltiples lotes de productos biofarmacéuticos. En esta situación, la sola dimensión LC/MS métodos se han propuesto para mejorar muestra rendimiento8,9. Sin embargo, la precisión y las mediciones de rango dinámico de HCP pueden verse afectadas en un análisis de LC/MS 1D por la abrumadora presencia de péptidos de la biofarmacéutica. En comparación con una separación multidimensional, el potencial de señal interferencia19,20,21,22 se incrementa en una sola dimensión separación cromatográfica porque la probabilidad de más precursores de péptidos que co liberador se incrementa. La incorporación de medios orthogonal para separar precursores de péptidos sin extender el tiempo de separación cromatográfica claramente sería ventajosa. Viajes onda ion movilidad (TWIM)10 tiene la capacidad para resolver los espectros de MS congestionados en milisegundos. Aproximadamente 500 separaciones de movilidad pueden realizarse durante la elución de un único péptido, suponiendo una anchura del pico cromatográfico completo de 10 s y teniendo en cuenta que el tiempo de ejecución de una separación de IM en el instrumento de movilidad de iones es ms 20.
Análisis de espectrometría de masa para la cuantificación de proteínas se han desarrollado con éxito en los últimos decenio mediante la bien aceptada seleccionado (múltiples) reacción control de enfoque (método de SRM/MRM) implementado en el tándem espectrómetros de masas11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. Una de las limitaciones de este análisis de espectrometría de masa baja es la interferencia fenómeno19,20,21,22 cuando el péptido de interés tiene el "mismo" precursor y fragmento de masa como otros péptidos Co liberador presentan en la muestra (dentro de una ventana de 1-Da). Hay dos formas para mejorar la precisión de los métodos SRM/MRM: una opción implica un paso adicional de la separación a nivel precursor para eliminar iones interferentes del precursor, mientras que la otra opción es aumentar la resolución de la MS de la detección de precursores/fragmento a evitar la superposición de las señales de MS. El modo de adquisición de alta selectividad (HS) MRM descrito aquí aprovecha de ambos de estos enfoques por la separación de movilidad de iones precursores de péptidos de acoplamiento con las alta resolución (Rs ~ 30.000) MS la detección de fragmentos de péptido. El ensayo descrito aquí cubiertas por lo menos tres órdenes de magnitud, que es el rango dinámico normalmente observadas en SRM/MRM proteómica experimentos17,18,24.
La utilidad de la prueba de HS-MRM para la cuantificación de la HCP se demostró mediante el control de la linealidad de la señal producida por las seis normas de péptido tacon a diferentes concentraciones (rango de 0.1 a 100 nM) en una síntesis de anticuerpo monoclonal.

<table><tbody><tr><td>Espectrómetro de masas Vion IMS Qtof</td><td>Waters</td><td>186009214</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class Administrador de solventes cuaternarios (QSM)</td><td>Waters</td><td>186015041</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM)</td><td>Waters</td><td>186015040</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class Column Manager (CM)</td><td>Waters</td><td>186015043</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo (ACN)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40867-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>2,1 x 150 mm CSH C18 columna UPLC, 1,8 y micro; m partículas</td><td>Aguas</td><td>186005298</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico, aditivo eluyente para LC/MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56302-10X1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Hi3 conejo fosforilasa (PHO) Estándar MassPREP</td><td>Aguas</td><td>186006011</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida (IAM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Viales LC (viales de vidrio de 12x32 mm, cuello de rosca)</td><td>Waters</td><td>186000327c</td><td></td></tr><tr><td>Leucina Acetato de encefalina sal hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9133-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 2.0 mL tubos (2x50)</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de enzimas Trypsin/Lys-C, grado de especificación de masas (5 x 20 y micro; g)</td> <td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Agua, grado LC/MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo de hs-mrm para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida qtof masa espectrometría por movilidad iónica

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

El análisis de impurezas de proteínas de bajo nivel (1-100 ppm) (e.g., proteínas de la célula huésped (EP)) en proteína biotherapeutics es un desafiante ensayo que requieren alta sensibilidad y un amplio rango dinámico. Ensayos de cuantificación basada en espectrometría de masa de proteínas implican típicamente la digestión de proteínas, seguida por la reacción de reacción selectiva múltiple monitoreo monitoreo de cuantificación (SRM/MRM) de péptidos con un tándem (Rs ~ 1.000) baja resolución Espectrómetro de masas cuadrupolar. Una de las limitaciones de este enfoque es el fenómeno de interferencia observado cuando el péptido de interés tiene el "mismo" precursor y fragmento de masa (en términos de valores de m/z) como otros péptidos Co liberador presentes en la muestra (dentro de una ventana de 1-Da). Para evitar este fenómeno, se propone un enfoque alternativo de la espectrometría de masa, un ensayo MRM de alta selectividad (HS) que combina la separación de movilidad de iones precursores de péptidos con alta resolución (Rs ~ 30.000) MS la detección de fragmentos de péptido. Exploramos las capacidades de este enfoque para cuantificar estándares de baja abundancia péptido tacon en una síntesis de anticuerpo monoclonal (mAb) y demostró que tiene la sensibilidad y rango dinámico (por lo menos 3 órdenes de magnitud) alcanzado típicamente en HCP Análisis. Todos los seis estándares de péptido se detectaron en concentraciones tan bajas como 0.1 nM (1 femtomole cargado en una columna cromatográfica de 2,1 mm ID) en presencia de un fondo de alta abundancia péptido (2 μg de una mAb digest cargado en columna). Al considerar el MW de la fosforilasa de conejo (97.2 kDa), de la cual se derivaron los péptidos con picos, LOQ de este ensayo es inferior a 50 ppm. Desviación estándar relativa (RSD) de zonas de pico (n = 4 repeticiones) eran menos del 15% en toda la gama de concentración todo investigada (0.1-100 nanómetro o 1-1.000 ppm) en este estudio.

Las secuencias individuales de seis fosforilasa b péptido las normas contenidas en la mezcla de péptidos PHO se muestran en la tabla 1, junto con sus tiempos de retención y sus precursores más abundantes en el HDMSE experimentan. El primer paso en el desarrollo de un ensayo MRM (HS) de alta selectividad es la adquisición de un conjunto de datos HDMSE establecer los tiempos de elución de cada péptido PHO, junto con su correspondiente mayoría precursor abundante y los tres fragmentos más abundantes. La figura 2 muestra los espectros HDMSE adquiridos para uno de los péptidos PHO (Pep 6) dispararon en la recopilación de infliximab. Después de establecer el 3 mejor "transiciones" (combinaciones de masas precursor y fragmento) para cada péptido, se realiza un experimento de Tof-MRM para encontrar la energía de colisión óptima para aprovechar al máximo las señales generadas para cada péptido. Los resultados del experimento de optimización de CE se resumen en la tabla 2. El ensayo final de capítulo-MRM (ver figura 4) conserva sólo los mejores «transición» para cada péptido y se utiliza para el análisis de las muestras inoculadas. Ejemplos de cromatogramas de HS-MRM generados para péptidos PHO 4 a través de todas las concentraciones investigadas se presentan en la figura 7. Cuatro curvas de calibración obtengan para cada siguiente péptido la integración de los picos de HS-MRM resaltado en la figura 7 se muestran en la figura 8. Además, la desviación de estándar relativa de pico zona, calculada en base a 4 replicar las inyecciones, se resume en 4 mesas que se muestra en la tabla 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Péptido</td>
			<td colspan="2">Péptido</td>
			<td>Retención de</td>
			<td colspan="4">Estados de carga</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Secuencia de</td>
			<td>tiempo (min)</td>
			<td>+ 1</td>
			<td>+ 2</td>
			<td>+ 3</td>
			<td>+ 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 1</td>
			<td colspan="2">VLYPNDNFFEGK</td>
			<td>19.4</td>
			<td>1442.6951</td>
			<td>721.8512</td>
			<td>481.5699</td>
			<td>361.4292</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>1874.9065</td>
			<td>937.9569</td>
			<td>625.6404</td>
			<td>469.4821</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 3</td>
			<td colspan="2">IGEEYISDLDQLRK</td>
			<td>18.9</td>
			<td>1678.8646</td>
			<td>839.9360</td>
			<td>560.2931</td>
			<td>420.4716</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>1440.7369</td>
			<td>720.8721</td>
			<td>480.9172</td>
			<td>360.9397</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>1890.0080</td>
			<td>945.5076</td>
			<td>630.6742</td>
			<td>473.2574</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17.7</td>
			<td>1262.5939</td>
			<td>631.8006</td>
			<td>421.5362</td>
			<td>316.4039</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Normas PHO péptido contenidas en la mezcla de masa PREP tacon en la recopilación de infliximab. Tiempos de retención de péptido y sus precursores más abundantes (resaltados en negrita) se muestran en formato tabular.
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Péptido</td>
			<td colspan="2">Péptido</td>
			<td>Retención de</td>
			<td colspan="2">Precursor de péptidos</td>
			<td colspan="3">Fragmento más abundantes iones/carga</td>
			<td>Óptimo</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Secuencia de</td>
			<td>tiempo (min)</td>
			<td>carga y m/z</td>
			<td>Tiempo de deriva (ms)</td>
			<td>Me</td>
			<td>II</td>
			<td>III</td>
			<td>CE (V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>625.6404 (+ 3)</td>
			<td>6.2</td>
			<td>714.3781 (+ 1)</td>
			<td>807.4177 (+ 2)</td>
			<td>827.4621 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>720.8721 (+ 2)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>865.4050 (+ 1)</td>
			<td>964.4734 (+ 1)</td>
			<td>1214.5688 (+ 1)</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>630.6742 (+ 3)</td>
			<td>6.3</td>
			<td>642.3570 (+ 1)</td>
			<td>689.8391 (+ 2)</td>
			<td>832.4236 (+ 2)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17.7</td>
			<td>631.8006 (+ 2)</td>
			<td>7.0</td>
			<td>830.3931 (+ 1)</td>
			<td>945.4200 (+ 2)</td>
			<td>1016.4571 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2. Resultados del experimento de optimización de Tof-MRM: se indican los tres más abundantes fragmentos de cada péptido PHO cuantificada en este estudio, junto con la correspondiente energía de colisión optimizado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Cantidad</td>
			<td colspan="6">Pep 2 zonas de pico (tabla 3A)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>en la columna (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Significa</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>439</td>
			<td>462</td>
			<td>431</td>
			<td>456</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>5121</td>
			<td>4842</td>
			<td>5198</td>
			<td>4842</td>
			<td>5001</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>63853</td>
			<td>64279</td>
			<td>66111</td>
			<td>62509</td>
			<td>64188</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>612392</td>
			<td>605553</td>
			<td>613229</td>
			<td>611004</td>
			<td>610545</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Cantidad</td>
			<td colspan="6">Pep 4 áreas de pico (tabla 3B)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>en la columna (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Significa</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>275</td>
			<td>359</td>
			<td>325</td>
			<td>288</td>
			<td>312</td>
			<td>12.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>3559</td>
			<td>3694</td>
			<td>3287</td>
			<td>3754</td>
			<td>3574</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>45259</td>
			<td>45775</td>
			<td>42976</td>
			<td>45548</td>
			<td>44890</td>
			<td>2.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>459374</td>
			<td>467927</td>
			<td>436272</td>
			<td>458994</td>
			<td>455642</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Cantidad</td>
			<td colspan="6">Pep a 5 áreas de pico (tabla 3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>en la columna (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Significa</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>3194</td>
			<td>3243</td>
			<td>3202</td>
			<td>3257</td>
			<td>3224</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>31464</td>
			<td>31150</td>
			<td>31464</td>
			<td>31433</td>
			<td>31378</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>313638</td>
			<td>320712</td>
			<td>311943</td>
			<td>311943</td>
			<td>314559</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>2845736</td>
			<td>2840031</td>
			<td>2882006</td>
			<td>2864052</td>
			<td>2857956</td>
			<td>0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Cantidad</td>
			<td colspan="6">Pep 6 áreas de pico (cuadro 3D)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>en la columna (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Significa</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>583</td>
			<td>440</td>
			<td>440</td>
			<td>488</td>
			<td>13.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>6429</td>
			<td>6429</td>
			<td>6848</td>
			<td>6623</td>
			<td>6582</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>71295</td>
			<td>70400</td>
			<td>71563</td>
			<td>70400</td>
			<td>70915</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>707640</td>
			<td>707640</td>
			<td>694461</td>
			<td>729490</td>
			<td>709808</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3. Tabla que contiene las áreas pico de cromatogramas de MRM capítulo grabado para 4 péptidos PHO (Pep 2, 4, 5 y 6) para cada inyección de LC/MS (16 carreras de LC/MS y 4 concentraciones probadas). La desviación estándar relativa era mejor que 15% de los péptidos en el rango de concentración todo investigado.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig1.jpg"> Figura 1. Diagrama de flujo de trabajo que resume los tres pasos necesarios para configurar un método de adquisición capítulo MRM. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig2.jpg"> Figura 2. Ejemplo de datos HDMSE: (A) de baja energía espectro mostrando el ion del precursor Pep 6. (B) espectro de fragmentación energía del mismo péptido, mostrando los 3 primeros más abundante fragmento iones (en círculo) seleccionados para la optimización de energía de colisión de Tof-MRM. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig3.jpg"> Figura 3. Experimentan de parámetros que se utilizan para configurar una optimización de Tof-MRM. Para cada transición se probaron once energías de colisión (en el rango de 16 a 36 V). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig4.jpg"> Figura 4. Ejemplo del método final de capítulo-MRM. Varios parámetros son necesarios para cada «transición», incluyendo el péptido precursor m/z, su estado de carga y tiempo de deriva de movilidad de iones, la m/z del ion más abundante del fragmento, la energía de colisión óptima y el tiempo de la adquisición de MS. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig5.jpg"> Figura 5. Configuración utilizada por el método de procesamiento para el análisis del conjunto de datos de HS-MRM. Cada péptido es controlada por un solo «transición» descrito por el péptido precursor m/z, cargar estado y esperar el tiempo de retención, junto con la m/z del fragmento más abundante y su estado de carga. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig6.jpg"> Figura 6. Diagrama del espectrómetro de masas de movilidad de iones. En el modo de adquisición capítulo-MRM, los precursores del péptido que está siendo cuantificado se separan de otros precursores de péptidos (interferencia) Co liberador en la célula de movilidad de iones, aislados por el cuadrupolo y fragmentado con una energía de colisión fija en el celda de colisión. La señal producida por los iones fragmento del péptido se realza mediante el ajuste de la frecuencia del empujador, y cuantificación del péptido se realiza mediante la resolución de alta MS (> 30.000) señales producidas por el ion del fragmento más intenso de cada péptido. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2.jpg"> Figura 7. Cromatogramas de MRM capítulo grabado para 4 péptidos PHO en 4 diferentes concentraciones que abarca 3 órdenes de magnitud (0.1, 1, 10 y 100 nM). (A) pep 2 cromatogramas, cromatogramas (B) Pep 4, cromatogramas de Pep (C) 5 y 6 (D) Pep cromatogramas. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2.jpg"> Figura 8. Curvas de calibración para 4 péptidos PHO en 4 diferentes concentraciones (0.1, 1, 10 y 100 nM). Las tablas debajo de cada curva muestran las áreas de cada pico (valores) registradas para cada inyección, mientras que la segunda columna de cada tabla muestra la desviación porcentual de la respuesta lineal esperada. (A) pep 2 calibración, calibración de 4 (B) Pep, Pep (C) 5 calibración y calibración (D) Pep 6. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, describimos un análisis cromatográfico juntado con la separación de movilidad de iones precursores de péptidos seguida por la alta resolución (~ 30.000) MS-detección de fragmentos de péptidos para la cuantificación de normas péptido con púas en un anticuerpo monoclonal Digest.

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

El objetivo general del ensayo HS-MRM consiste en reducir el fenómeno de interferencia en MRM que afecta la cuantificación de péptidos o proteínas, combinando la separación por movilidad iónica de los precursores peptídicos con la detección espectrométrica de masas de alta resolución de los iones fragmento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el área de la caracterización de biofármacos, así como en la cuantificación de biomarcadores proteicos o peptídicos y en la proteómica cuantitativa. La principal ventaja de esta técnica es que permite la detección de proteínas de células huésped de baja abundancia que podrían estar presentes en proteínas biofarmacéuticas.Primero, haga clic en crear método de análisis en el software de adquisición de datos y seleccione generar y adquirir y procesar método. Escriba el nombre del método y la descripción, busque la carpeta del método y haga clic en siguiente. Para el tipo de análisis, elija mapa de péptidos IMS y haga clic en siguiente.Luego seleccione la configuración actual del sistema y haga clic en siguiente y finalizar. En el método recién creado, haga clic en la pestaña de instrumentos, seleccione el administrador de solventes binario y edite los parámetros del gradiente para lograr la separación de péptidos a un flujo de 0.2 mililitros por minuto. Utilice una dilución en gradiente del uno al 40% de solvente B en 30 minutos, seguida de un lavado de columna de dos minutos y una equilibración de 10 minutos, con un tiempo total de análisis de 45 minutos.A continuación, seleccione el administrador de muestras y ajuste la temperatura de la muestra a 10 grados Celsius y la temperatura de la columna a 60 grados Celsius. En la pestaña de instrumentos, seleccione el instrumento Vion IMS QTof. En la sección de configuración, seleccione sensibilidad para el modo del analizador e introduzca tres kilovoltios para el voltaje del capilar, 100 grados Celsius para la temperatura de la fuente, 250 grados Celsius para la temperatura de desolvatación, 50 litros por hora para el flujo de gas en cono y 500 litros por hora para el flujo de gas de desolvatación.Haga clic en la pestaña del experimento y seleccione MSE de alta definición como modo. Luego ingrese 100 para la masa baja, 2000 para la masa alta y 0,4 segundos para el tiempo de escaneo. En la sección de energía de colisión, escriba seis electronvoltios para el ajuste de baja energía y elija una rampa de alta energía desde 15 hasta 40 electronvoltios.Para el tiempo de adquisición, utilice un tiempo personalizado entre cinco y 30 minutos. A continuación, haga clic en la pestaña de opciones y seleccione el modo de corrección de bloqueo automático con un intervalo de corrección de bloqueo automático de cinco minutos. Luego, seleccione la opción de continuar con la corrección de bloqueo y asegúrese de que la verificación automática del detector esté desactivada.En el menú de configuración del sistema actual, seleccione el instrumento Vion IMS QTof y haga clic en herramientas. Ingrese tres kilovoltios para el voltaje del capilar, 40 voltios para el cono de muestreo, 100 voltios para el desfase de la fuente, 100 grados Celsius para la temperatura de la fuente, 250 grados Celsius para la temperatura de desolvatación, 50 litros por hora para el flujo de gas del cono, 500 litros por hora para el flujo de gas de desolvatación y tres kilovoltios para el voltaje del capilar de referencia. Analice una muestra falsa previamente preparada de 10 nanomolares utilizando el ensayo LC-HDMSE descrito anteriormente, inyectando 10 microlitros de muestra en el instrumento.Las secuencias individuales de seis estándares de péptidos de fosforilasa B contenidos en la mezcla falsa de péptidos se muestran aquí junto con sus tiempos de retención y sus precursores más abundantes observados en el experimento HDMSE. Se muestran aquí los espectros HDMSE adquiridos para uno de los péptidos falsos añadidos al digesto de Infliximab. En el software de adquisición de datos, haga clic en crear método de análisis y seleccione generar y adquirir y procesar método.Escriba el nombre del método y su descripción, busque la carpeta del método y haga clic en siguiente. Para el tipo de análisis, elija cuantificar, seleccione el ensayo de cuantificación Tof cromatográfico 2D y haga clic en siguiente. Luego, seleccione la configuración actual del sistema y haga clic en siguiente y finalizar.Haga clic en la pestaña de instrumentos en el método recién creado. Seleccione el gestor de solventes binario y edite la configuración del gradiente para lograr la separación de péptidos a un caudal de 0,2 mililitros por minuto. Utilice una dilución en gradiente del 1 al 40% de solvente B en 30 minutos, seguida de un lavado de columna de dos minutos y una equilibración de 10 minutos, con un tiempo total de análisis de 45 minutos.En la pestaña de instrumentos, seleccione el administrador de muestras y ajuste la temperatura de la muestra a 10 grados Celsius y la temperatura de la columna a 60 grados Celsius. Ahora seleccione el instrumento Vion IMS QTof y en la sección de configuraciones, elija sensibilidad para el modo del analizador. Luego ingrese tres kilovoltios para el voltaje del capilar, 100 grados Celsius para la temperatura de la fuente, 250 grados Celsius para la temperatura de desolvatación, 50 litros por hora para el flujo de gas de cono y 500 litros por hora para el flujo de gas de desolvatación.Haga clic en la pestaña de experimento y, para el tipo de experimento, seleccione una tabla de funciones o más de una función MS, MSMS o MRM. Elimine la función de adquisición predeterminada, haga clic en agregar más MRM y edite los parámetros de la ventana de retención en la sección de tiempo de ejecución. En el editor de función Tof MRM, ingrese la relación masa/carga del péptido precursor principal, seleccione baja resolución para el precursor e ingrese el estado de carga del precursor.Luego, introduzca la relación de carga principal del producto de 16 electronvoltios para la energía de colisión inicial, 0,1 segundos para el tiempo de escaneo fijo y amplio para la columna de espectro. Utilizando el botón de duplicado, agregue 10 transiciones MRM más y use diferentes valores de energía de colisión en el rango de 18 a 36 electronvoltios. Después de establecer las tres mejores transiciones para cada péptido, se realizó un experimento Tof MRM para hallar la energía de colisión óptima que maximice las señales generadas para cada péptido.A continuación, configure un método HS-MRM que contenga solo un ion fragmento por péptido. Modifique el método Tof MRM creado previamente seleccionando la función HS-MRM en lugar de la función Tof MRM. En el editor de la función HS-MRM, ingrese la relación de carga maestra, seleccione baja para la resolución del precursor e ingrese el estado de carga del precursor.Luego ingrese el valor de CCS precursor y seleccione baja resolución de CCS del precursor. Para el ion producto, introduzca su relación carga/masa principal, seleccione la energía de colisión óptima, elija un tiempo de escaneo de 0,4 segundos y seleccione una configuración de espectro amplio para incluir todos sus isótopos. El ensayo HS-MRM final conserva únicamente la mejor transición para cada péptido y se utiliza para analizar todas las muestras agregadas.En el método de análisis creado para el método de adquisición de datos HS-MRM, haga clic en la pestaña de propósito y elija administrar componentes. En el menú desplegable bajo el tipo de experimento, seleccione la opción HS MSMS/HS MRM. Haga clic en crear e ingrese el nombre del componente, el tiempo de retención esperado, la ventana de tiempo de extracción y la relación de carga principal del precursor.Seleccione el modo de extracción XIC y escriba el valor esperado de CCS. Para el ion fragmento, introduzca su estado de carga y la relación de carga principal. A continuación, introduzca todos los componentes peptídicos monitoreados por el ensayo HS-MRM.En la pestaña de propósito del mismo método de adquisición HS-MRM, haga clic en cantidades predeterminadas e ingrese 0,1, uno, 10 y 100 nanomolares para todos los componentes de péptidos falsos. Después de ingresar el primer valor, haga clic con el botón derecho y seleccione la opción rellenar hacia abajo para ingresar la misma concentración para todos los componentes. Repita el mismo procedimiento para las cuatro concentraciones de la curva de calibración.Ahora vaya a la pestaña de procesamiento y haga clic en configuración de extracción. Ingrese 10 PPM para la tolerancia de masa. Luego haga clic en tolerancia del tiempo de deriva CCS e ingrese 5 % para la tolerancia de CCS.En la pestaña de procesamiento, seleccione la configuración de procesamiento de picos. En la sección de suavizado, seleccione "media" como algoritmo de suavizado, "uno" como el ancho a la mitad y "uno" como las iteraciones. En la sección de integración, asegúrese de que las opciones de ancho de pico automático y detección automática estén ambas marcadas.A continuación, seleccione en la pestaña de procesamiento la configuración de pantalla dirigida y elija en la ventana de RT la opción más cercana a RT. Luego, ingrese 0,2 minutos para la tolerancia del tiempo de retención. Seleccione los parámetros de cuantificación y en el menú de calibración, elija lineal como tipo de ajuste de la curva de calibración, uno sobre x al cuadrado como tipo de ponderación, concentración como tipo de valor del componente, milimoles por litro como unidades de valor del componente, y ninguno para el cálculo de puntos de calibración mediante promediado.En el menú de cuantificación, seleccione área como valor de respuesta. Aquí se presentan ejemplos de cromatogramas HS-MRM generados para los péptidos falsos en todas las concentraciones. Aquí se muestran las curvas de calibración obtenidas para cada péptido tras la integración de los picos HS-MRM.Se resume aquí la desviación estándar relativa del área del pico calculada a partir de cuatro inyecciones replicadas. Debido a que el ensayo MRM de alta selectividad incorpora tanto la separación del precursor por movilidad iónica como la detección espectrométrica de masas con resolución elevada y dirigida, tiene un gran potencial para convertirse en un ensayo de monitoreo rápido y de alto rendimiento para múltiples proteínas de células huésped en lotes de productos bioterapéuticos. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar un ensayo MRM de alta selectividad en un instrumento Vion IMS QTof.

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Química

Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación o diseño. Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala para placas de 384 pocillos. Este formato rentable puede ser muy útil en los campos de desinmunización proteínas y diseño y desarrollo de vacunas.

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Este protocolo describe cómo realizar ensayos de cuantificación absoluta de proteínas objetivo dentro de muestras biológicas complejas utilizando la monitorización de reacciones seleccionadas. Se utilizó para cuantificar con precisión las proteínas de la vía de señalización de la quimiotaxis de los macrófagos de ratón. Se describe en detalle la selección de péptidos objetivo, el desarrollo de ensayos y los ensayos cualitativos y cuantitativos.

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Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

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Cromatografía de intercambio iónico (IEX) acoplada a la dispersión de la luz de múltiples ángulo (MALS) para caracterización y separación de proteínas

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Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.

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Un flujo de trabajo analítico basado en cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para un análisis "ascendente" de alta confianza y altamente reproducible de las modificaciones e identificación de histonas en función de los parámetros principales (tiempo de retención [RT], sección transversal de colisión [CCS] y relación masa-carga [m/z] precisa).

Cribado de modificación de histonas mediante cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo

El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo.  Este artículo describe un flujo de trabajo típico utilizado para la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos en suero, incluida la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el análisis de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos.

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

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Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica (Video) | JoVE Journal

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

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