Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

El objetivo general de este sistema de imágenes es utilizar la microscopía de fluorescencia confocal para observar el desarrollo de los órganos de las plantas durante varios días con una resolución subcelular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la morfogénesis de las plantas, como ¿cómo coordinan las células de los organismos multicelulares sus patrones de crecimiento y proliferación durante la organogénesis? La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de configurar y no depende de los equipos especializados que se utilizan a menudo en las imágenes de lapso de tiempo, como los sistemas de profusión.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando leímos la publicación de Littlejohn and Love, en New Phytologist, que describe las ventajas de la perfluorodecalina para obtener imágenes dentro de los tejidos de las hojas. Para comenzar, use un cortador de vidrio para hacer tiras de vidrio de tres milímetros de ancho a partir de un portaobjetos de un milímetro de grosor. Luego, con pegamento de cianoacrilato o cinta adhesiva de doble cara, asegure las tiras separadas aproximadamente 45 milímetros a lo ancho de una nueva guía.

Haz un portaobjetos extra con las mismas dimensiones para que sirva de molde. Ahora, haga una junta de la misma altura con goma PDMS permeable al gas. Humedece un segundo portaobjetos con un poco de etanol absoluto y aplana el PDMS sobre el portaobjetos hasta la altura de las tiras de vidrio.

A continuación, humedece una cuchilla con etanol absoluto y recorta el exceso de PDMS. Esto es crítico ya que las herramientas mojadas con etanol no se adherirán al PDMS. A continuación, vuelva a aplanar el PDMS hasta la altura de la tira.

Luego, corte una cavidad en el PDMS que sostendrá la plántula y la losa de agar. Para producir un tamaño de cavidad consistente, utilizamos un cortador casero hecho a medida construido con especificaciones permanentes, pero en su lugar se podría usar una hoja de afeitar. A continuación, recorte alrededor del borde exterior para que la junta tenga un grosor de unos dos milímetros.

Ahora, en una corredera sin la junta PDMS, coloque un cubreobjetos en ambas tiras de vidrio. Luego, en el espacio debajo del cubreobjetos, pipetee aproximadamente un mililitro de agar licuado tibio lo suficiente como para llenar el espacio. El agar puede contener compuestos experimentales de interés.

A continuación, el aire equilibra algunos PFD agitando un pequeño volumen de PFD en un tubo. Una vez que el agar se haya endurecido, cargue aproximadamente 200 microlitros del PFD en la junta del PDMS, pero no la llene por completo. Retire el cubreobjetos de la losa de agar y córtelo en una forma que se ajuste al pozo de la junta de gel PDMS.

Deje un espacio de dos a cuatro milímetros entre el agar y la pared de la junta. Luego, llene completamente la cámara con PFD equilibrado por aire. Para obtener imágenes de raíces primarias gravitrópicas, se utiliza una membrana celulósica como barrera física en la superficie de la losa de agar.

La losa de agar también debe ser más blanda con 0,8% de agar en lugar de 1,5% de agar. Corta un trozo de la membrana que tenga aproximadamente las mismas dimensiones que el bloque de agar. Luego, esterilícelo con etanol al 80% y déjelo secar al aire.

Una vez seca, remoje la membrana en medio de crecimiento líquido y luego transfiérala a la superficie del agar. Para comenzar, coloque con cuidado hasta tres plántulas en el agar. Su posicionamiento es fundamental.

Los cotiledones y el hipocótilo deben colgar sobre el borde del agar, flotando en PFD. Se debe proporcionar espacio entre las plántulas para permitir el crecimiento. Las plántulas se pueden enroscar si son demasiado grandes para caber en la cámara.

A continuación, cierre la cámara con un cubreobjetos de un grosor que coincida con el objetivo elegido. Presione suavemente a lo largo del borde para que se haga contacto con las tiras de vidrio. Use otro portaobjetos de vidrio para presionar suavemente el cubreobjetos para que descanse uniformemente sobre las dos tiras de vidrio.

A continuación, asegure el cubreobjetos con cinta quirúrgica de microporos cortada por la mitad a lo largo. Ahora, deje que la muestra se asiente durante aproximadamente media hora antes de tomar imágenes. Para preparar las plántulas de arabidopsis thaliana para las cámaras, primero esterilice las semillas con etanol al 70%.

Y luego plántelos en un medio suplementado. Estratificar las semillas plantadas durante dos o cuatro días a cuatro grados centígrados. Luego, transfiera las semillas plantadas a 22 grados centígrados y cultívelas orientadas verticalmente bajo un ciclo de luz diario de 16 horas.

Para obtener imágenes de las raíces laterales, cultive las plantas durante siete a 10 días y luego transfiéralas a cámaras de imágenes. Las raíces laterales que crecían a tasas fisiológicas en cámaras de imagen se documentaron cada media hora. Las raíces laterales también se cultivaron en placas de Petri estándar en el mismo medio para comparar.

La tasa de crecimiento de las raíces individuales varió mucho en ambas configuraciones, pero el rango fue similar en ambas condiciones. En general, la tasa de crecimiento aumentó con la longitud. La tasa de crecimiento de las plantas en cámaras de imagen o en placas fue indistinguible durante las primeras 27 horas de crecimiento.

Ambos grupos comenzaron con la misma longitud promedio de raíz lateral. Las raíces laterales que coexpresan un marcador de membrana plasmática y un marcador de microtúbulos se obtuvieron en intervalos de una hora en las cámaras de imagen. Las raíces estaban muy estables en sus posiciones, lo que permitió varias horas de imágenes confocales.

Se observaron indicadores visuales de proliferación durante todo el experimento. En las células meristemáticas, se pudieron identificar bandas preprofásicas, husos mitóticos y fragmoplastos. Durante tres días, el crecimiento lateral de la raíz no fue significativamente diferente en las cámaras de imagen en comparación con las placas de Petri durante las primeras 48 horas, pero a las 72 horas la tasa media de crecimiento disminuyó.

Sin embargo, una proporción significativa de raíces en las cámaras aún crecieron a tasas comparables a las raíces en placas durante 72 horas. Una vez dominado, se pueden hacer dos diapositivas en 15 minutos si todo va bien. Es posible utilizar este sistema de imagen para estudiar el efecto de los tratamientos farmacológicos, aunque se requieren otros métodos más complejos como los sistemas de perfusión para los experimentos de lavado.

Después de su desarrollo, esta técnica proporcionó un medio barato y simple para seguir los eventos celulares que sustentan la morfogénesis de las plantas, en particular para explorar el papel de los bordes celulares, de las demandas espaciales que comparten la organogénesis en las raíces laterales de arabidopsis thaliana.