Name: Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Aprende a realizar imágenes de células vivas mediante microscopía multifotónica en explantes de retina de pez cebra Danio rerio. Este método permite observar la migración nuclear intercinética durante la regeneración retiniana en tiempo real.

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Agradecemos el apoyo proporcionado por William Archer y el Servicio Integrado de Notre Dame de imagen. Gracias especiales se dirigen a los técnicos Freimann Ciencias de la Vida por su continua ayuda y su cuidado y la cría del pez cebra. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Ojo de los NIH para DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) y el Centro de Investigación de pez cebra, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN.

<ol><li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+Muller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li>
<li>Kassen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li>
<li>Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-stage+neuronal+progenitors+in+the+retina+are+radial+Muller+glia+that+function+as+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells.</a> J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).</li>
<li>Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+is+produced+by+dying+retinal+neurons+and+is+required+for+Muller+glia+proliferation+during+zebrafish+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration.</a> J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).</li>
<li>Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Cytoskeleton-+and+Rock-Mediated+INM+Are+Required+for+Photoreceptor+Regeneration+in+the+Adult+Zebrafish+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina.</a> J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).</li>
<li>Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-renewing+division+of+zebrafish+Muller+glial+cells+generates+neuronal+progenitors+that+require+N-cadherin+to+regenerate+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons.</a> Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).</li>
<li>Sauer, M. E., Walker, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioautographic+study+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Soc.Exp.Biol.Med%22%5BJournal%5D)">Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube.</a> Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).</li>
<li>Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+modulate+interkinetic+nuclear+movement+in+retinal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells.</a> J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).</li>
<li>Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurogenesis+by+interkinetic+nuclear+migration+through+an+apical-basal+notch+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient.</a> Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).</li>
<li>Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+is+the+main+driver+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina.</a> Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).</li>
<li>Becker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+chick+retinal+development+in+relation+to+gap+junctional+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication.</a> J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).</li>
<li>Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+maintains+the+quiescent+progenitor+cell+state+of+postnatal+retinal+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia.</a> Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).</li>
<li>Nickerson, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+analysis+of+postnatal+mouse+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development.</a> BMC Dev.Biol. 13, 24(2013).</li>
<li>Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li>
<li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li>
<li>Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+adult+rat+retinal+explant+model+for+screening+of+potential+retinal+ganglion+cell+neuroprotective+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).</li>
<li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+excitability%2C+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+retinal+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of retinal whole mounts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Retinal+Ganglion+Cell+Dendritic+Field+Degeneration+Imaged+in+Organotypic+Retinal+Explant+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).</li>
<li>Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+blue+light+on+photoreceptors+in+a+live+retinal+explant+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Vis%22%5BJournal%5D)">Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system.</a> Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).</li>
<li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Sci%22%5BJournal%5D)">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J.Vis.Exp. 80, e51017(2013).</li>
<li>Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressing+notch+signaling+and+expressing+TNFalpha+are+sufficient+to+mimic+retinal+regeneration+by+inducing+Muller+glial+proliferation+to+generate+committed+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells.</a> J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).</li>
<li>Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+defines+three+populations+of+Muller+glia+and+is+required+for+initiating+maximal+muller+glia+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comp.Neurol%22%5BJournal%5D)">Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina.</a> J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).</li>
<li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li>
<li>Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+IL-6+family+cytokines+synergize+to+stimulate+Muller+glia+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration.</a> Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).</li>
<li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Cell%22%5BJournal%5D)">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li>
<li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li>
<li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li>
<li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front.Cell.Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los estudios que investigan los mecanismos que regulan la regeneración de la retina del pez cebra adulto dañado fundamentalmente métodos usados inmuno 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. El establecimiento de las condiciones de cultivo de explantes de retina a y para realizar imágenes de células viv...

A diferencia de los seres humanos, el pez cebra (Danio rerio) exhiben una robusta respuesta de regeneración después de la muerte celular de neuronas de la retina 1, 2, 3, 4. Factor de necrosis tumoral α, una molécula de señalización que se libera de la muerte las neuronas de la retina induce las células de Müller residente en el basal capa interior Nuclear (INL) de la retina, a proliferar 5 y producir células progenitoras neuronales que siguen proliferando antes de la diferenciación en la célula neuronal tipos que murieron 2, 3, 4. Durante la fase proliferativa de la respuesta de la regeneración, los núcleos de las células de Müller y sus células progenitoras neuronales derivadas se someten a un patrón migratorio repetitivo en fase con el ciclo celular (interkinetic migración Nuclear, INM) 6 </sup<html> &gt; 7. Los núcleos posicionado en la INL basal replicar su ADN antes de migrar a la capa exterior Nuclear (ONL) donde se dividen antes de que surjan los núcleos vuelven basalmente a la INL. Este proceso fue descrito por primera vez durante el desarrollo neuroepitelial utilizando métodos histológicos, mientras que los enfoques de formación de imágenes de células vivas después confirmaron la interpretación por Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Ambos enfoques de imagen histoquímicos y de células vivas se han utilizado para determinar los mecanismos INM y su función en el desarrollo de la retina incluyendo neuroepithelia 9, 11, 12, 13 subyacentes. Sin embargo, los mecanismos que regulan INM en el adulto regeneración de retina no han sido estudiados en mayor detallexref &quot;&gt; 6, 7. Células vivas imágenes será una forma muy valiosa para avanzar en el conocimiento de las vías de señalización que controlan el INM en la retina adulta regeneración. Hasta hace poco tiempo, imágenes de células vivas del INM en la retina se limita a cualquiera de embriones de pez cebra en vivo o embriones de pollo o postnatal ratón explantes de retina 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mientras que los explantes de retina de animales adultos de una variedad de especies, incluyendo ratones, ratas y pez cebra han sido utilizados para diferentes enfoques biológicos celular 17, 18, 19, 20, experimentos de imágenes de células vivas utilizando explantes de retina jahan estado restringidos a breves períodos de tiempo y no han sido ejecutados de forma continua durante varias horas 21, 22. A continuación, describimos un protocolo detallado para la cultura retinas de pez cebra adultos de luz dañadas para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas monitoreo INM usando microscopía multifotónica 6. Enfoques imágenes de células vivas son ventajosas respecto a los métodos inmunohistoquímicos en la investigación de los mecanismos que controlan el INM, como la dinámica del INM, por ejemplo, las velocidades pueden verse afectados en lugar de la ubicación de la mitosis, lo que potencialmente no ser detectado mediante inmunocitoquímica. En el futuro, este método tiene también el potencial de ser modificado para estudiar otros procesos dinámicos durante la regeneración de la retina, tales como fagocitosis de morir fotorreceptores por las células de Müller o el comportamiento de microglia.

<table><tbody><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>Instrumentos de precisión mundiales</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5, ángulo de 45 grados</td><td>Instrumentos de precisión mundiales</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras McPherson-Vannas Instrumentos de</td><td>precisión mundiales</td><td>501233</td><td></td></tr><tr><td>Fluordish Instrumentos</td> de <td>precisión mundiales</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ-1B:</td><td>tipo similar de microscopio estereoscópico de disección funcionará</td></tr><tr><td>Seguridad Biológica Clase de gabinete tipo A2</td> El <td>tipo equivalente</td>de <td>Labconco</td><td></td> funcionará</tr><tr><td>incubadora de cultivo de tejidos</td> El <td>tipo equivalente</td>a <td>HEPA-class 100</td><td>termocientífico</td> funcionará</tr><tr><td>Lámparas fluorescentes Sylvania OSFP5835HOECO</td><td>Bulbtronics</td><td>31850</td><td></td></tr><tr><td>0.2 y micro; m Filtro de jeringa Acrodisc</td><td>VWR</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Luer-lok de 10 ml</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Jeringa Luer-lok</td><td>VWR</td><td>BD309653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>FischerScientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sin Ca2+/Mg2+, sin rojo fenol, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM sin rojo fenol, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-038</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo, inactivado por calor</td><td>ThermoScientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa ultrapura de bajo punto de fusión</td><td>ThermoScientific</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>etanol, absoluto</td><td>ThermoScientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>2-fenoxietanol</td><td>Sigma</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell-Tak celda y adhesivo tisular&nbsp;</td><td>VWR</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>líquido de índice de refracción&nbsp;</td>El microscopio multifotónico <td>Cargille Lab</td><td>1803Y</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 equipado con un láser infrarrojo MaiTai</td><td>El sistema equivalente</td><td>a Nikon</td> funcionará con un objetivo de inmersión en <td></td></tr><tr><td>agua de larga distancia 40X Apo (N.A. 1.15)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>La cámara ambiental equipada con un inserto para placas de Petri de 35 mm</td>, <td>el sistema equivalente</td><td>Okolab</td><td></td> funcionará</tr><tr><td>con el software</td> <td>de análisis NISNikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de células vivas imágenes de microscopía multifotónica

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Un programa de regeneración endógena es iniciada por las células de Müller en el pez cebra adulto (Danio rerio) retina después del daño neuronal y la muerte. Las células de Müller volver a entrar en el ciclo celular y producen células progenitoras neuronales que se someten a las siguientes rondas de división celular y se diferencian en los tipos de células neuronales perdidos. Tanto las células de Müller y de células progenitoras neuronal núcleos replican su DNA y se someten a la mitosis en lugares distintos de la retina, es decir, que migran entre el basal capa interior Nuclear (INL) y la capa exterior Nuclear (ONL), respectivamente, en un proceso descrito como interkinetic La migración nuclear (INM). INM predominantemente se ha estudiado en la retina en desarrollo. Para examinar la dinámica del INM en el adulto regeneración de la retina del pez cebra en detalle, se requiere imágenes de células vivas de las células marcadas con fluorescencia las células de Müller / progenitoras neuronales. Aquí, proporcionamos las condiciones para aislar y retinas cultura dorsalesde Tg [GFA: nGFP] pez cebra mi2004 que fueron expuestos a una luz intensa constante durante 35 h. También se muestra que estos cultivos de retina son viables para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas, la adquisición de imágenes de forma continua z-stack en todo el espesor de la retina explante para un máximo de 8 h utilizando microscopía multifotónica para monitorear el comportamiento migratorio de GFA: células positivas nGFP . Además, se describen los detalles para realizar el análisis posterior a la proyección de imagen para determinar la velocidad del INM apical y basal. En resumen, hemos establecido las condiciones para estudiar la dinámica del INM en un modelo adulto de la regeneración neuronal. Esto hará avanzar nuestra comprensión de este proceso celular crucial y nos permitirá determinar los mecanismos que controlan el INM.

El aislamiento de la retina de acuerdo con el procedimiento descrito en el esquema de la Figura 1 permite que el cultivo de una retina dorsal aplanado de adulto-luz dañado Tg [GFAP: nGFP] mi2004 pez cebra durante un período de al menos 24 h en un 5% de CO 2 / ambiente de aire. Estos explantes de retina montados en plano-se pueden utilizar para planos focales de imagen a nivel de tejidos profundos. Un ejemplo es las células de Müller / núcle...

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

El objetivo general de este procedimiento de aislamiento es permitir la visualización de células vivas de las células proliferantes que están experimentando migración nuclear intercinética en cultivos de explantes retinianos de pez cebra dañado. Este método puede responder preguntas clave en la regeneración retiniana, como qué mecanismos impulsan la migración nuclear intercinética o si la glía de Müller en una célula progenitora renal presenta una migración nuclear intercinética regulada de manera similar. La principal ventaja de esta técnica es que permite monitorear el comportamiento dinámico de las células proliferantes que experimentan migración nuclear intercinética durante la regeneración, lo que posibilita la investigación de mecanismos específicos de la fase del ciclo celular.Aunque este método puede proporcionar información sobre la migración nuclear intercinética, también puede aplicarse a otras áreas de investigación retiniana, como el estudio del comportamiento de la microglía o la fagocitosis de neuronas en degeneración por parte de la glía de Müller. Comience este procedimiento transfiriendo el pez cebra sobre una toalla de papel seca. Luego, retire uno de los ojos co

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Demostramos un protocolo para generar embriones quiméricos de pez cebra para vivir el comportamiento de imagen celular durante la embriogénesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

En este video, las técnicas para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporcionan. Time-lapse de imágenes se utiliza para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de...

Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

Las células que mueren son expulsados ​​de los tejidos epiteliales por la contracción concertada de las células vecinas sin interrumpir la función de barrera. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. A continuación se describen los métodos para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra a una resolución de celulares.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

El video muestra un método para cultivar células ganglionares primarias de la retina de embriones de pez cebra. Los embriones en etapa temprana se someten a disección para aislar los ojos, que posteriormente se disocian mecánicamente en una suspensión de células ganglionares de la retina. Esta suspensión celular se cultiva en cubreobjetos recubiertos con proteínas adhesivas para facilitar el desarrollo de los axones.

Generación de cultivos primarios de ganglios angulares de la retina a partir de embriones de pez cebra

Fuente: Lahne, M., et.al. Cultivo de explantes de retina de pez cebra transgénico adulto para obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía multifotónica. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller en explantes de retina de pez cebra incrustados en agarosa después del daño de los fotorreceptores inducido por la luz. El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) liberado por los fotorreceptores dañados activa las células...

Imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller durante la regeneración de la retina del pez cebra

el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Proyección de imagen del tejido retiniano puede proporcionar información de unicelulares que no se desprende de los métodos bioquímicos tradicionales. Este protocolo describe la preparación de rodajas de retinales de pez cebra para la proyección de imagen confocal. Fluorescentes genéticamente codifican sensores o indicador tintes permiten visualización de numerosos procesos biológicos en los tipos de células retinianas distintas.

Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos

Aquí, presentamos un protocolo para mostrar cómo photoconversion celular se logra a través de la exposición Ultravioleta a áreas específicas que expresan la proteína fluorescente, Eos, en animales vivos.

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Presentamos un protocolo eficiente y fácil de usar para la preparación de cultivos celulares primarios de células de embriones de pez cebra para transfección celular directo imágenes así como un protocolo para preparar células primarias del cerebro del pez cebra adulto.

Cultura y transfección de células primarias de pez cebra

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Este protocolo describe el uso de un peróxido de hidrógeno genéticamente codificado (H2O2)-biosensoren neuronas de pez cebra cultivadas y larvas para evaluar las funciones fisiológicas de señalización de H 2 O2durante el desarrollo del sistema nervioso. Se puede aplicar a diferentes tipos de células y modificar con tratamientos experimentales para estudiar especies reactivas de oxígeno (ROS) en el desarrollo general.

Ros imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal

Aprende a realizar imágenes de células vivas mediante microscopía multifotónica en explantes de retina de pez cebra Danio rerio. Este método permite observar la migración nuclear intercinética durante la regeneración retiniana en tiempo real.

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