La medición y Modelado contráctil que se secan en humano estrato córneo
1 de marzo de 2017
Este artículo describe un método para cuantificar el comportamiento de secado dinámica y las propiedades mecánicas del estrato córneo midiendo la resuelto espacialmente desplazamientos de secado en el plano de muestras de tejido circulares adheridas a un sustrato de elastómero. Esta técnica se puede utilizar para medir cómo los diferentes tratamientos químicos altera de secado y propiedades mecánicas del tejido.
El objetivo general de este método es cuantificar la rigidez mecánica dinámica y la acumulación de tensiones durante el secado en muestras ex vivo del estrato córneo humano, tras diferentes tratamientos químicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biomecánica y la ciencia cosmética, como la forma en que la composición del estrato córneo o el tratamiento del tejido cutáneo con productos de cuidado personal puede influir en sus propiedades mecánicas y en su comportamiento dinámico durante el secado. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una alternativa más rápida frente a otros métodos de evaluación mecánica, requiere significativamente menos tejido cutáneo y proporciona un secado más fisiológicamente relevante al prevenir la evaporación desde la cara inferior de la muestra.
Para preparar cubreobjetos recubiertos con elastómero, primero prepare el agente de curado Sylgard 184 mezclando los sólidos base con el agente de curado en una proporción de base a agente de curado de 55 a uno, hasta que la mezcla sea homogénea. Se necesitan seis gramos en total. A continuación, desgasifique la solución.
Luego, use la solución para recubrir las laminillas en un espinador. Con una pipeta de gran orificio, deposite un mililitro de la mezcla en el centro de una laminilla. A continuación, recubra la laminilla mediante centrifugación a 2.000 rpm durante 60 segundos.
Prepare cinco o seis cubreobjetos recubiertos de esta manera. Para curar los cubreobjetos, déjelos en un horno a 60 grados Celsius durante 12 horas. Al día siguiente, mida los espesores de las películas de elastómero.
Utilice una cuchilla para levantar un borde de la película de elastómero de la cubreobjetos. Luego, utilice un marcador indeleble para marcar el lado superior de la película de elastómero y para marcar la cubreobjetos tratada debajo. Ahora, utilizando un microscopio invertido, mida la altura Z entre los planos focales de las marcas para medir los espesores de la película.
Siga los procedimientos estándar para preparar el tejido de la capa córnea (SC). Para obtener muestras, tome troqueles de seis milímetros de diámetro del SC. En las muestras, coloque una marca en el centro de la cara más externa utilizando un marcador indeleble. A continuación, deposite perlas marcadoras fluorescentes sobre la superficie de la capa córnea (SC) flotando las muestras en 15 mililitros de agua, que contienen aproximadamente 90 microlitros de concentrado de perlas.
Utilice una agitación suave durante 30 minutos y ajuste la concentración de perlas según sea necesario. Después del tratamiento, sumerja cada muestra en agua para montarla sobre el elastómero. Coloque una cubreobjetos recubierta en un ángulo reducido, de 15 a 30 grados, debajo del SC con el elastómero hacia el lado inferior del SC. Luego levante la cubreobjetos del agua con el SC adherido encima, laminando así suavemente la muestra de SC sin arrugas ni aire atrapado.
A continuación, seque las muestras montadas en condiciones ambientales durante aproximadamente una hora. Una vez secas, transfiera las muestras a una cámara herméticamente sellada que contenga un recipiente con agua. Deje que las muestras se equilibren con la humedad durante 24 horas.
Al día siguiente, monte una muestra en una cámara de perfusión para una sesión prolongada de adquisición de imágenes. Coloque la cámara de perfusión sobre el sustrato y selle los bordes de la cámara de perfusión al elastómero utilizando grasa al vacío. Luego registre imágenes fluorescentes y de luz transmitida con un campo de visión suficientemente amplio para capturar toda la muestra de SC.
En las próximas 16 horas, tome una imagen cada 10 minutos. En una campana extractora química, cargue una pequeña tapa de plástico con un mililitro de silano. Transfiera la tapa a un recipiente sellado que contenga un portaobjetos recubierto con elastómero, sin contacto directo.
Déjelos incubar a temperatura ambiente durante cinco horas. Mientras tanto, prepare 20 mililitros de solución de perlas según el protocolo descrito en el texto y viértalos en una placa de 10 centímetros de diámetro. Después de cinco horas, coloque lentamente los sustratos silanizados con la cara del elastómero hacia abajo en la solución de perlas.
Cargue dos sustratos en cada placa y deje que los sustratos reaccionen con las perlas durante 45 minutos. Posteriormente, utilizando pinzas, retire los sustratos y enjuáguelos con agua destilada para eliminar las perlas no unidas. A continuación, séquelos bajo un flujo suave de aire comprimido y guárdelos en una caja sellada y opaca.
Utilizando la técnica descrita previamente, transfiera las muestras de CS a un sustrato tratado en un baño de agua. Inmediatamente después de montar el CS, aplique una gota de cinco microlitros de solución de perlas marcadoras fluorescentes sin diluir sobre ella. Luego, deje secar el CS durante 60 minutos.
Ahora, mida el grosor de la SC utilizando el microscopio con un objetivo de 40x en una cámara de perfusión. Mida el grosor de la SC a lo largo del tiempo, utilizando un accesorio de enfoque remoto para registrar la diferencia en la altura Z entre las dos capas de microesferas. Una capa se encuentra en la interfaz entre la SC y el sustrato, y la otra está en la parte superior de la SC. Mediante las técnicas descritas, se preparó una muestra de SC y se recubrió con microesferas fluorescentes.
Después de 16 horas de secado, a 25 % de humedad relativa, se midieron los desplazamientos. Debido a la simetría circular de las muestras, estos desplazamientos se promediaron azimutalmente. Durante todo el proceso de secado, los desplazamientos azimutales permanecen pequeños.
Los perfiles de desplazamiento radial, sin embargo, aumentaron monótonamente desde el centro hasta el borde y crecieron en magnitud hasta que se alcanzó un equilibrio. Los perfiles registrados a intervalos de 30 minutos muestran la evolución temporal de los desplazamientos en el plano. El espesor promedio de la SC disminuyó durante el secado, principalmente durante las primeras dos horas.
Posteriormente, se analizó la dinámica de secado ajustando los perfiles de desplazamiento a un modelo de contractilidad lineal y elástico mediante un enfoque de mínimos cuadrados. A partir del modelo, se obtuvo el estrés de secado contractil y el módulo elástico. Ambos parámetros aumentaron rápidamente durante las primeras dos horas de secado.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar adherir completamente las muestras al sustrato. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la tinción de lípidos para responder preguntas adicionales, como cómo tratamientos cosméticos específicos alteran la composición lipídica del tejido.
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Descripción general
Este artículo describe un método para cuantificar la rigidez mecánica dinámica y el comportamiento de secado del estrato córneo humano. Al medir los desplazamientos de secado en el plano de muestras de tejido sobre un sustrato de elastómero, la técnica evalúa cómo los tratamientos químicos afectan las propiedades del tejido.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biomecánica
- Ciencia Cosmética
Antecedentes
- Comprender las propiedades mecánicas del estrato córneo es fundamental para aplicaciones de tratamiento de la piel.
- Los métodos actuales pueden requerir más tejido o tiempo del deseado.
- El comportamiento dinámico del secado puede influir en la eficacia de los productos de cuidado personal.
Objetivo del estudio
- Cuantificar los esfuerzos por desecación y la rigidez mecánica en muestras de piel ex vivo.
- Evaluar el impacto de diversos tratamientos químicos sobre las propiedades de la piel.
- Proporcionar una alternativa rápida a los métodos existentes de evaluación mecánica.
Métodos Utilizados
- Preparación de cubreobjetos recubiertos con elastómero utilizando Sylgard 184.
- Medición de desplazamientos por secado resueltos espacialmente.
- Evaluación de las propiedades mecánicas tras el tratamiento.
- Prevención de la evaporación desde la cara inferior de la muestra para mantener la relevancia fisiológica.
Resultados principales
- El método permite una evaluación rápida de las propiedades mecánicas de la piel.
- Diferentes tratamientos químicos alteran significativamente el comportamiento durante el secado.
- Se requiere menos tejido en comparación con los métodos tradicionales.
Conclusiones
- Esta técnica mejora la comprensión de la biomecánica de la piel.
- Proporciona información sobre los efectos de los productos cosméticos en la piel.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar la formulación y eficacia de los productos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite una evaluación rápida y fisiológicamente relevante de las propiedades mecánicas del estrato córneo en condiciones de desecación, apoyando la evaluación temprana de formulaciones cosméticas y de cuidado personal. Al cuantificar los cambios dinámicos en el estrés por desecación y en el módulo elástico, proporciona información predictiva sobre la función de barrera y la resistencia del tejido, orientando las decisiones de avance o interrupción en las etapas de desarrollo de productos. El enfoque de alto rendimiento y bajo requerimiento de tejido mejora la eficiencia del cribado y reduce la dependencia de ensayos mecánicos tradicionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Investiga cómo los tratamientos cosméticos alteran las propiedades biomecánicas del estrato córneo, apoyando la comprobación de hipótesis mecanicistas.
- Valor operativo: Permite la evaluación rápida de los efectos de las formulaciones sobre la rigidez del tejido y el estrés por desecación con un consumo mínimo de muestra.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera perfiles cuantitativos de desplazamiento con resolución espacial que se correlacionan con los cambios en las propiedades mecánicas durante el secado.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras y las mediciones mediante perforaciones circulares adheridas a elastómeros, mejorando la reproducibilidad entre los grupos de tratamiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona los cambios inducidos por la formulación en el comportamiento de secado con la integridad de la barrera, lo que respalda la relevancia traslacional para los resultados en salud cutánea.
- Valor operativo: Proporciona una lectura continua de la evolución mecánica durante ciclos de secado de 16 horas, permitiendo la evaluación de la eficacia con resolución temporal.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, donde se evalúa el impacto de la formulación en la biomecánica de la piel antes de la optimización del fármaco líder, ofreciendo un puente entre el cribado molecular y la evaluación funcional del tejido.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre cómo los productos de cuidado personal influyen en la mecánica del estrato córneo y en la acumulación de estrés inducido por el secado.
- Selección: Proporciona construcciones estandarizadas de tejido-elastómero listas para ensayos, adecuadas para comparaciones multifactoriales en cribados de formulaciones.
- Análisis: Extrae el estrés por secado y el módulo elástico a partir de perfiles de desplazamiento ajustados, lo que permite la comparación cuantitativa de los efectos de los tratamientos a lo largo del tiempo.
- Investigación Traducional: Relaciona la dinámica mecánica del secado con la función de barrera, aportando información sobre la relevancia preclínica de las intervenciones cosméticas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar diversos activos cosméticos, humectantes y limpiadores bajo condiciones controladas de secado.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en los efectos de la formulación sobre la resistencia mecánica del tejido y el comportamiento de secado relacionado con la barrera.
- Valor operativo: El alto rendimiento, el bajo consumo de tejido y la prevención de artefactos por evaporación mejoran la fiabilidad y escalabilidad del ensayo.
- Valor estratégico: Permite la reducción temprana de riesgos de candidatos a formulaciones al identificar aquellos que agravan el estrés mecánico inducido por el secado.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de ingredientes cosméticos según su compatibilidad biomecánica con el estrato córneo.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en modelado biomecánico y análisis de imágenes para el seguimiento de desplazamientos y ajuste de modelos.
- Acceso a centrífugas de goteo, cámaras de perfusión y control ambiental para secado regulado por humedad.
- Normalización de protocolos de perforación de tejidos, etiquetado con microesferas y recubrimiento de elastómeros entre diferentes usuarios.
- Consideraciones de adaptación para distintos grosores de tejido o complacencias del sustrato al extenderse más allá del estrato córneo humano.
- Límite práctico: el método supone un comportamiento elástico lineal y simetría circular, supuestos que podrían no cumplirse en estados tisulares patológicos o severamente alterados.
