Modelización del comportamiento del cáncer de ovario en un esferoide multicelular Microdevice 3D dinámico peritoneal

El objetivo general de este procedimiento es crear una plataforma dinámica de cocultivo basada en microfluídica para emular el entorno intraperitoneal con los componentes celulares y mecánicos donde se produce la metástasis del cáncer de ovario. Al utilizar este micro para esta plataforma, ayuda a responder a las preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como el microambiente de la diseminación peritoneal. La principal ventaja de esta técnica es que un cocultivo 3D bajo flujo libre controlado con precisión imita mejor la comunicación in vivo entre las células de cáncer de ovario y las células de metotedia que se produce en una cavidad peritoneal.

Después de diseñar y dibujar el patrón de canal microfluídico y producirlo de acuerdo con el protocolo de texto, aplique una capa de SU82075 Photoresist sobre la oblea de silicona con una velocidad de giro de 1800 RPM. Hornee la oblea recubierta de fotorresistencia directamente en una placa caliente a 65 grados centígrados durante cinco minutos. Y luego a 95 grados centígrados durante 25 minutos para eliminar el exceso de solvente.

Aplica una segunda capa de SU82075 Photoresist sobre la oblea para obtener un grosor final de 250 micrómetros. Coloque la oblea recubierta de fotorresistencia directamente sobre una placa caliente a 65 grados centígrados durante siete minutos y luego a 95 grados centígrados durante 30 minutos antes de enfriar lentamente la oblea a temperatura ambiente. A continuación, alinea y coloca la máscara fotográfica directamente encima de la oblea.

Luego expóngalo a la luz ultravioleta durante 20 segundos para cruzar el patrón. En una placa caliente, hornee la oblea recubierta a 65 grados centígrados durante cinco minutos y a 95 grados centígrados durante 12 minutos para eliminar el solvente y la prelimerización. Retire el Photoresist no transversal sumergiendo la oblea en un revelador SU8 durante 25 minutos.

Luego, con isopropanal, enjuague la oblea y use aire presurizado para secarla. Combine la base de polidimetilsiloxano o PDMS y el agente de curado en una proporción de masa de 10 a uno y use el mezclador centrífugo bajo la función de mezcla y desgasificación para mezclar la solución. Vierta lentamente la mezcla de PDMS sobre la oblea hasta una altura de aproximadamente cinco milímetros.

Desgasifique el PDMS en un desecador de vacío durante 40 minutos. A continuación, cure el PDMS en el horno a 65 grados centígrados durante dos horas. Despegue con cuidado la losa de PDMS del maestro y recorte el PDMS a lo largo de los canales hasta que tenga el tamaño de un portaobjetos de vidrio.

Luego, con un punzón de biopsia de un milímetro, perfore el PDMS para crear las entradas y salidas del dispositivo. Utilice aire presurizado para limpiar la superficie del PDMS y luego, con cinta adhesiva, elimine el polvo y los residuos de PDMS. Ahora coloque la losa de PDMS con el lado del canal hacia arriba en un limpiador de plasma.

A continuación, coloque un portaobjetos de vidrio limpio en el limpiador de plasma junto a la losa de PDMS. Trate el PDMS y el portaobjetos de vidrio bajo plasma de aire a un nivel de alta frecuencia de radio o RF durante un minuto. Luego, después de quitar las muestras del limpiador de plasma, una el PDMS al portaobjetos de vidrio para crear un enlace covalente irreversible.

Coloque el chip PDMS en una placa caliente a 150 grados centígrados durante una hora para mejorar la fuerza de unión y devolver la hidrofobicidad del PDMS antes de su uso. Para recubrir los canales microfluídicos con fibronectina, comience utilizando 30 microlitros de etanol al 75% para esterilizar los canales. Retire el etanol y use PBS para enjuagar los canales dos veces.

A continuación, aspire completamente el PBS de los canales. Prepare 10 microgramos por mililitro de solución de fibronectina en medio M199MCDB105 sin suero con 30 microlitros de la solución, llene lentamente los canales y use cinta adhesiva para sellarlos. A continuación, incuba el chip a cuatro grados centígrados durante la noche.

Para sembrar células de mesotelia peritoneal primaria o HPMC en los canales microfluídicos, después de enjuagar las células cultivadas de acuerdo con el protocolo de texto, use dos mililitros de medio de cultivo 10%FBS para volver a suspender las HPMC. Con un hemocitómetro, cuente las células y ajuste la concentración celular a 3,5 veces 10 a la sexta célula por mililitro. Caliente el chip microfluídico recubierto de fibronectina en una incubadora a 37 grados centígrados durante cinco minutos antes de usarlo.

A continuación, aspire completamente la solución de fibronectina y pipetee lentamente 30 microlitros de suspensión de HPMC en cada canal. Use cinta adhesiva para sellar los canales y coloque el dispositivo en la incubadora de CO2 durante la noche. Para inducir la formación de esferoides de cáncer de ovario, disuelva la agarosa al 0,5% en agua esterilizada.

Dispense 50 microlitros de la solución de agarosa en los pocillos de las placas de 96 pocillos. Después de contar las células de cáncer epitelial humano previamente cultivadas, vuelva a suspender las células en un medio de cultivo al 5% de FBS a una densidad de 5.000 células por mililitro. Transfiera 200 microlitros de suspensión celular a cada pocillo recubierto de agarosa.

Y cultivar las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2 durante 48 horas. Transfiera los esferoides cancerosos a un tubo de centrífuga de 50 mililitros prehumedecido con un mililitro de medio libre de suero y centrifuga los esferoides a 750 veces G durante cinco minutos. Después de la preparación de 2,5 microgramos por mililitro de solución de CMFDA en medio M199MCDB105 libre de suero.

Vuelva a suspender los esferoides cancerosos en un mililitro de la solución e incube los esferoides a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Luego cuente el número de esferoides y use un medio sin suero para ajustar la concentración a 2, 000 esferoides por mililitro. Antes de la carga de esferoides, inyecte lentamente 100 microlitros de medio M199MCDB105 libre de suero para lavar las células de mesotelio no adheridas dentro de los canales.

Cargue 30 microlitros de suspensión de esferoide marcada con fluorescencia en cada canal. A continuación, coloque el chip microfluídico en la incubadora de CO2. Ensamble una plataforma de profusión conectando una jeringa cargada con medio M199MCDB105 sin suero fresco a un tubo de un metro de largo.

Coloque la jeringa en la bomba de jeringa y asegure el émbolo y el cuerpo de la jeringa. A continuación, instale la bomba de jeringa en posición horizontal a la misma altura que el chip microfluídico dentro de la incubadora. Infunda rápidamente todo el tubo con medio presionando y manteniendo presionado el botón de avance rápido hasta que el medio se desborde en el tubo.

A continuación, ejecute la inyección al caudal deseado. Conecte el tubo a la entrada del canal de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, utilice un tubo de salida corta para conectar la salida del canal a un tubo cónico de 50 mililitros para recoger el medio de salida.

Por último, utilice un microscopio de campo claro o de fluorescencia para observar los HPMC y los esferoides del cáncer. Utilizando la plataforma microfluídica descrita en este video, se modelaron esferoides de cáncer de ovario con células mesoteliales en condiciones hidrodinámicas. Como se muestra en esta figura, las células mesoteliales que se cultivaron en el microdispositivo durante 16 horas formaron con éxito una monocapa de HPMC.

En este experimento, los esferoides multicelulares con diámetros de aproximadamente 100 micrómetros que son similares en tamaño a los encontrados en las sociedades de pacientes se marcaron con un colorante fluorescente verde CMFDA. A continuación, los esferoides se transfirieron a canales microfluídicos recubiertos de HPMC y permanecieron en suspensión, y se capturaron las morfologías celulares. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en varias horas durante tres días si se realiza correctamente.

Uno de cada 10 en este procedimiento, es importante recordar que hay que evitar introducir burbujas de aire en los canales microfluídicos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el tratamiento con medicamentos, los ensayos de adhesión y los ensayos de aclaramiento de mesotelio para responder preguntas adicionales, como el efecto del microambiente introperitoneal en la progresión del cáncer. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer exploraran la mestastasis peritoneal en humanos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar un microdispositivo peritoneal con flujo fluido para iniciar el comportamiento del cáncer de ovario en la cavidad peritoneal. No olvide que trabajar con azufres orgánicos como la acetona, como revelador y ciclina puede ser extremadamente peligroso. Las precauciones de MP, como el uso de guantes y una bata de laboratorio, siempre se deben tomar cuando se realiza este procedimiento por primera vez.

Todos los trámites relacionados con esta oficina deben realizarse bajo extrema cobertura.