Name: Tratamiento de las estructuras de ligamentos con suero acondicionado con ejercicio: Un modelo de ingeniería de tejidos traslacional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende a tratar estructuras de ligamentos con suero acondicionado por ejercicio para estudiar la síntesis de colágeno y la función del tejido conectivo. Este modelo traslacional permite analizar los efectos del ejercicio en ligamentos y tendones.

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Este trabajo fue apoyado por una beca postdoctoral del NSERC (DWDW), una beca de la Fundación ARCS (AL) y una beca de UC Davis College of Biological Sciences (KB).

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El presente manuscrito describe un modelo de tejido ligamentario que es una plataforma experimental útil para investigadores con un amplio espectro de temas de investigación, desde el desarrollo de tejidos hasta las preguntas clínicas / traslacionales. El modelo de ligamento modificado descrito aquí se basa en un protocolo versátil que puede adaptarse en varios puntos a lo largo del flujo de trabajo ( Figura 1 y sección de discusión ). Además, la naturaleza inherentemente reduccionista del entorno in vitro se puede acercar al dominio fisiológico suplementando medios de alimentación con suero humano o animal acondicionado. Las construcciones se pueden formar usando fibroblastos de una variedad de fuentes Aunque la metodología y los resultados representativos mostrados aquí se basan en el uso de fibroblastos primarios de ACL, el protocolo de aislamiento celular puede ajustarse para recoger otros tipos de fibroblastos primarios. Como se describeEn la Figura 4 , los ligamentos de ingeniería formados con células primarias aisladas de donantes humanos jóvenes muestran una baja variabilidad del donante. Las células primarias están limitadas por el aislamiento inicial y la restricción de paso; El uso de líneas celulares puede mejorar la reproducibilidad de los experimentos. El uso de otros tipos de células puede requerir modificaciones en los medios de cultivo celular y en la formulación de gel de fibrina. Por ejemplo, hemos observado que las células madre mesenquimatosas humanas (MSCs) no son capaces de formar tejidos lineales entre los anclajes de cemento brushite en el transcurso de 2 semanas, mientras que los fibroblastos superiores del tendón flexor digital equino superior, células estromales de médula ósea equina, fibroblastos de tendón embrionario de pollo , Y C3H10T1 / 2 MSC murino rápidamente contraer y digerir el gel de fibrina para formar un tejido lineal (observaciones no publicadas). Este contraste puede ser una consecuencia de las diferencias en la contractilidad celular, la proliferación y la producción de enzimas fibrinolíticas. Aplicación de productos químicosY estimulación mecánica En el método descrito en el presente documento, el tejido a base de fibrina se forma alrededor de anclajes de cemento de pincel, permitiendo la aplicación de estimulación mecánica a través de un biorreactor estirable 11 , así como para ensayos de tracción de punto final. La presencia de la interfase cementita-tejido blando (entesis) también presenta una oportunidad para una mayor investigación y mejora 22 , 26 (ver sección de aplicaciones clínicas a continuación). En este entorno in vitro , la contribución de los factores químicos y mecánicos puede identificarse más fácilmente; Un ejemplo de esto se muestra en la Figura 5 , por lo que el efecto del ambiente de suero después del ejercicio se separó de los estímulos mecánicos del ejercicio. Es posible que se necesiten estudios piloto para determinar el plazo de las intervenciones experimentales, la composición de los tratamientos y los criterios de valoración adecuados para esperar un cambio observable. ParaPor ejemplo, en el estudio de suero 1 post-ejercicio, la duración del tratamiento experimental fue limitada por el suministro de suero utilizado para suplementar los medios, de los cuales se alimentaron los constructos cada dos días. Además, durante la segunda semana de cultivo, se suplementaron los medios de cultivo con suero en reposo o post-ejercicio con ácido ascórbico y se mantuvo L-prolina mientras se eliminaba TGF-β1. El TGF-β1 es un factor de crecimiento pro-fibrótico conocido que aumenta en suero después del ejercicio 27 . Por lo tanto, para evitar oscurecer los efectos relacionados con TGF-β1 del suero posterior al ejercicio, esta citoquina no se mantuvo en el medio de cultivo. Este modelo de ligamento modificado también puede usarse para probar el efecto del estiramiento mecánico. Mediante la ingeniería de apretones de modelado inverso para sostener los extremos de anclaje del cemento brushite (similar al probador de tracción uniaxial representado en la figura 1 ), se pueden diseñar biorreactores de estiramiento<html> Los ligamentos. Nuestro laboratorio ha utilizado previamente este modelo para investigar la respuesta de señalización molecular de los ligamentos de ingeniería para el estiramiento de tracción uniaxial en un biorreactor 11 a medida que proporcionará una mejor comprensión para el diseño racional de un paradigma de estiramiento in vitro o incluso, potencialmente, in vivo Estiramiento / actividad / aplicaciones terapéuticas. Evaluación de los ligamentos de ingeniería Al igual que con el cultivo monocapa tradicional, las construcciones 3D pueden ser ensayadas para la expresión de genes / proteínas; Además, su morfología 3D también proporciona la oportunidad de evaluar los cambios funcionales y morfológicos y las construcciones pueden mantenerse en la cultura para estudios a largo plazo ( Figura 3 ). Mientras que los ligamentos de ingeniería no son equivalentes a los ligamentos nativos maduros, que tienen similitud con el desarrollo de tendones / ligamentos y se comportan de manera similar a los tejidos nativos en respuesta a los nutrientes, 26, factores de crecimiento 10 , hormonas 25 y ejercicio 11 , 28. Por lo tanto, si bien la precaución se justifica antes de hacer amplias generalizaciones de cualquier modelo in vitro , los resultados de la construcción del ligamento de prueba puede revelar o informar un mecanismo fisiológico particular que de lo contrario podría ser Imposible investigar in vivo. Suplemento de los medios de alimentación con suero acondicionado para un modelo flexible y dinámico con amplias aplicaciones El metaboloma del suero humano es un medio de ~ 4.500 compuestos incluyendo, pero no limitado a, glicoproteínas, lipoproteínas, derivados lipídicos, sustratos energéticos, metabolitos, vitaminas, enzimas, hormonas, neurotransmisores y una plétora de bloques de construcción / intermedios. 29 La inspección adicional del metaboloma del suero humano de acuerdo con las clases compuestas 29 revela additiBeneficios de integrar el suero experimental en experimentos in vitro. Es decir, la mayoría de los ~ 4500 compuestos en suero son hidrofóbicos o derivados de lípidos, subrayando la importancia de las proteínas de unión para el transporte / solubilización. Se deduce que sería prácticamente imposible recapitular experimentalmente la dinámica de transporte del compuesto endógeno y, por tanto, la biodisponibilidad y las interacciones compuesto-objetivo. Por lo tanto, el suero experimental es particularmente eficaz para el estudio de compuestos que se sabe que dependen de moléculas accesorias para la solubilización, el transporte, la unión de diana y el mecanismo de acción. Nuestro laboratorio tiene un interés de largo plazo en los beneficios para la salud del ejercicio. El ejercicio mejora la función celular y de órganos en una variedad de tejidos en todo el cuerpo 12 , un efecto que puede atribuirse a una variedad de factores (por ejemplo, IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 ,Exosomas 16 , 17 ) que se liberan en la circulación sistémica. El medio bioquímico posterior al ejercicio refleja factores liberados tanto de la contracción de las hormonas sensibles al ejercicio de los músculos esqueléticos como de los factores liberados como resultado de la estimulación del sistema nervioso simpático de las glándulas secretoras ( por ejemplo , cortisol y catecolaminas de la glándula suprarrenal 18 y crecimiento Hormona de la pituitaria anterior 19 ). Recientemente utilizamos un modelo de suero pre y post-ejercicio para investigar los efectos del medio bioquímico inducido por el ejercicio en el tejido de ingeniería. 1 Si bien subsisten numerosas preguntas importantes relacionadas con la investigación relacionada con el ejercicio, el modelo no se limita de ninguna manera. Por ejemplo, se puede obtener suero, ya sea de origen animal o humano, después de intervenciones dietéticas o farmacológicas, o de diferentes grupos de edad o población clínicaS 30 . De esta manera, los compuestos exógenos o endógenos de interés estarán presentes en el suero y los medios de tratamiento, en cantidades biodisponibles e interactuarán con el tejido diana de acuerdo con el medio endógeno ( es decir , en un contexto más fisiológico). Este enfoque es dinámico, ya que es muy probable que una determinada intervención ejerza un efecto multiorgánico (y multi-compuesto) y, por lo tanto, el entorno fisiológico será co-modificado. Si bien este enfoque presenta ciertos desafíos, ya que múltiples variables bioquímicas sistémicas se alteran simultáneamente, es un enfoque que puede ayudar a superar los inconvenientes de metodología experimental puramente reduccionista [ 31 , 32] . En conjunto, la implementación de suero condicionado junto con un tejido de ingeniería tisular (biomimético in vitro ) de tejido se puede utilizar como una herramienta para la fisiología, la nutrición y las preguntas de investigación clínica. <stronG&gt; Las aplicaciones clínicas son numerosas El modelo de ingeniería de tejidos presentado aquí puede ser utilizado para investigar las preguntas de investigación anatómica y clínica que los modelos in vitro tradicionales no pueden. Un ligamento o tendón in vivo contiene una región de transición de tejido blando a duro llamada entesis. El enthesis, que es vulnerable a la lesión mecánica relacionada con el estrés 33 , puede ser estudiado en sección transversal a través de técnicas de microscopía histoquímica y electrónica 22 , 26 . Esta única interfaz es doblemente importante para aquellos con movilidad baja o restringida, ya que la inactividad física perjudica la capacidad del tejido conectivo para transferir la carga a regiones de bajo a alto cumplimiento 34 , lo que resulta en una disminución general en el cumplimiento de los tejidos y un mayor riesgo de lesiones. Nuestro laboratorio ha utilizado recientemente este modelo de ingeniería de tejidos 25 &lt;/ Sup&gt; para modelar otra población, las mujeres atletas, que están en riesgo de lesiones del tejido conectivo: la incidencia de lesión del LCA es aproximadamente cinco veces mayor que sus homólogos masculinos 35 . Los mecanismos potenciales que sustentan esta disparidad basada en el sexo en la lesión se investigaron mediante el tratamiento de construcciones ligamentales con concentraciones fisiológicas de la hormona sexual femenina, el estrógeno, en concentraciones que imitaban etapas del ciclo menstrual. Curiosamente, altas concentraciones de estrógenos inhibieron la expresión génica y la actividad de la lysl oxidasa, la enzima primaria responsable de la creación de lisina-lisina enlaces cruzados en la matriz de colágeno de ligamentos y tendones. Es importante destacar que 48 h de alto estrógeno (para simular la fase folicular) disminuyó la rigidez de la construcción del ligamento sin alterar la densidad de colágeno de los constructos. Desde un punto de vista fisiológico, esto sugiere que el aumento de la laxitud ligamentaria en las mujeres puede deberse, al menos en parte, a la disminuciónFormación de enlaces cruzados. Desde una perspectiva experimental, estos hallazgos 25 destacan la utilidad del modelo de construcción 3D, que permitió examinar la actividad funcional de reticulación. Desde un punto de vista clínico, este modelo ahora se puede utilizar para detectar rápidamente intervenciones que pueden prevenir los efectos negativos del estrógeno de la función del ligamento. Comentarios de cierre Aquí presentamos una metodología detallada para la formación de ligamentos de ingeniería y su utilidad como un modelo de tejido 3D in vitro . El modelo es altamente adaptable a una amplia gama de objetivos, proporcionando flexibilidad en el tipo de células, intervenciones y medidas de resultado de interés. La suplementación de los medios de alimentación con suero acondicionado añade un contexto fisiológico que no se puede lograr en un ambiente in vitro tradicional, mejorando el modelado de la fisiología in vivo . En resumen, creemos que este es un modo ampliamente aplicableL con implicaciones emocionantes para fomentar los campos de la fisiología y la ingeniería de tejidos.

Las lesiones de tendones y ligamentos son comunes y pueden tener consecuencias debilitantes sobre la movilidad normal y la calidad de vida. La intervención quirúrgica es a menudo necesaria, pero puede tener un éxito limitado y variado 4 , 5 . La comprensión actual de cómo los tendones y los ligamentos se desarrollan, maduran y responden a la lesión es incompleta, por lo tanto, los modelos de investigación eficaces son necesarios para proporcionar una visión sobre el desarrollo de tratamientos más eficaces 5 . Para abordar esta brecha de conocimiento, pueden utilizarse modelos animales, pero los estudios in vivo son intrínsecamente complejos con dificultad en controlar el medio ambiente y dirigir directamente las intervenciones al tejido deseado. En contraste, el entorno experimental puede ser fácilmente controlado y monitorizado in vitro con cultivo de células monocapa tradicional. Sin embargo, esta técnica puede simplificar excesivamente el ambiente químico y mecánico y por lo tanto no puede recapituEl comportamiento in vivo de las células. La ingeniería de tejidos es capaz de casar las ventajas del complejo ambiente in vivo en modelos animales con el control del ambiente in vitro y proporciona una herramienta adicional para estudiar la fisiología. Además, armado con una mejor comprensión del desarrollo del ligamento, ingeniería de tejidos también puede proporcionar una fuente de tejido de injerto cuando la reconstrucción quirúrgica es necesaria [ 6] . Por lo tanto, el método descrito en este documento valida un tejido in vitro 3D manipulado que puede usarse para estudiar la función y morfología del ligamento. Las construcciones de tendones o ligamentos a base de fibrina se han utilizado como un modelo in vitro para estudiar procesos fisiológicos que incluyen fibrilación 7 de colágeno y desarrollo de tendones 8 , así como aplicaciones de traducción en las que se ha evaluado su utilidad como tejido de injerto en un modelo de oveja de cru anteriorCial (ACL) 9 . Nuestro laboratorio ha establecido previamente un modelo de ligamento 3D dirigido a través de dos brushite, un fosfato de calcio material sustituto óseo, anclajes de cemento. Este modelo puede ser sometido a diferentes condiciones experimentales con facilidad simplemente complementando los medios de cultivo con factores biológicos 10 o aplicando estimulación mecánica 11 . Es importante destacar que este modelo de ligamento de hueso a hueso permite el análisis en profundidad de la entesis, la interfaz entre los huesos y los nervios elementos, que es susceptible de lesión. En el estudio destacamos 1 para presentar esta metodología, estábamos interesados ​​en el efecto de los cambios inducidos por el ejercicio en el medio bioquímico en la función del ligamento. El ejercicio mejora la función celular y de órganos en una variedad de tejidos en todo el cuerpo 2 , 3 , </suP&gt; 12 , un efecto que puede atribuirse a la liberación de varios conocidos (por ejemplo IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 , exosomes 16 , 17 ) y otros factores bioquímicos desconocidos liberados en la circulación sistémica . Además, el medio bioquímico después del ejercicio se enriquece con hormonas sensibles al ejercicio, cuya liberación es estimulada por estimulación del sistema nervioso simpático de las glándulas secretoras ( por ejemplo , cortisol y catecolaminas de la glándula suprarrenal 18 y hormona del crecimiento de la pituitaria 19 ). Sin embargo, en vivo , es imposible diferenciar los efectos del estímulo mecánico del ejercicio de los cambios bioquímicos inducidos por el ejercicio. Aunque algunos estudios han caracterizado el aumento esperado de ciertas hormonas circulantes y citoquinas en respuesta al ejercicioE como se mencionó anteriormente, hay demasiados factores, tanto conocidos como desconocidos, para recapitular fielmente in vitro. Es decir, aislar algunos factores para un estudio in vitro aborda inadecuadamente la complejidad de la respuesta bioquímica. En este estudio, se investigó cómo los cambios en el medio bioquímico del suero, impulsado por el ejercicio, afecta la función del ligamento de ingeniería. Para aislar los efectos de los cambios bioquímicos, obtuvimos suero de participantes humanos antes y después de un ejercicio de resistencia y lo usamos para tratar ligamentos de ingeniería 3D formados usando fibroblastos del ligamento cruzado anterior (ACL) humano. Utilizando este modelo, podemos obtener datos funcionales, incluyendo efectos sobre las propiedades mecánicas y el contenido de colágeno, así como cuantificar los efectos sobre la señalización molecular.

<table><tbody><tr><td>Austerlitz Pasadores para insectos, minuciosos de acero inoxidable, tamaño 0,20</td><td>Entomoravia</td><td>N/A</td><td>Para anclajes de cemento brushita</td></tr><tr><td>&beta;-fosfato tricálcico</td><td>Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)</td><td>N/A</td><td>Para anclajes de cemento brushite ácido</td></tr><tr><td>o-fosfórico, 85% (p/p)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX0995</td><td>Para anclajes de cemento brushite</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500g</td><td>Para anclajes de cemento brushite Falcon</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>Para placas recubiertas de silicona</td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit de elastómero de silicona</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>Para placas recubiertas de silicona</td></tr><tr><td>1x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>Para el aislamiento y la expansión celular</td></tr><tr><td>100x antibiótico/ solución antimicótica</td><td>VWR</td><td>45000-616</td><td>Para el aislamiento celular</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>Para el aislamiento celular</td></tr><tr><td>100x solución de penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Para el aislamiento celular</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0.22&nbsp; y micro; m poro, de polietersulfona, irradiado con rayos gamma</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Para la esterilización de reactivos</td></tr><tr><td>DMEM alto en glucosa con piruvato de sodio y L-glutamina</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>Para cultivo de células y tejidos</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>BioSera</td><td>FBS2000</td><td>Componente de los medios de digestión de tejidos y medios de crecimiento</td></tr><tr><td>Penicilina G Sal de potasio</td><td>MP Biomedicals 0219453680</td><td>- 100 MU</td><td>Componente de los medios de crecimiento. Disolver en agua a 100.000 U/mL, esterilizar por filtro, alícuota y almacenar a -20ºC.</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de poliestireno CELLSTAR (145 mm x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>82050-598</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Para aislamiento celular</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Para cultivo celular. Diluir al 0,05% en PBS</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>Para medios de congelación celular</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Contenedor de congelación criogénica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Para congelación celular</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Rojo Plástico 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>367820</td><td>Para la recolección de suero humano</td></tr><tr><td>Catéteres Bound Tree Insyte Autoguard IV, aguja de 22 g x 1 pulgada</td><td>Fisher Scientific</td><td>354221</td><td>Para la recolección de suero humano</td></tr><tr><td>Trombina, origen bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648-1KU</td><td>Para la formación de ligamentos artificiales. Disolver a 200 U/mL en medios DMEM con alto contenido de glucosa. Filtro a 0.22 &mu; m, alícuota, y almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinógeno, origen bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Para la formación de ligamentos de ingeniería. Disolver a 20 mg/mL en medios DMEM con alto contenido de glucosa. Filtro a 0.22 &mu; m, alícuota, y almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Aprotinina de pulmón bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428</td><td>Para la formación de ligamentos artificiales. Disolver a 10 mg/mL en agua. Filtro a 0.22 &mu; m, alícuota, y almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Ácido 6-aminohexanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07260-100g</td><td>Para la formación de ligamentos artificiales. Disolver a 0,1 g/mL en agua. Filtro a 0.22 &mu; m, alícuota, y almacene a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico, 2-fosfato, sesquimagnesio, sal, hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td>Componente de los medios de alimentación. Disolver en medios DMEM con alto contenido de glucosa a una concentración de 50 mM. Filtro a 0.22 &mu; m y almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Componente de los medios de alimentación. Disolver en PBS a una concentración de 50 mM. Filtro a 0.22 &mu; m y almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Transformando el factor de crecimiento y beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Componente de los medios de alimentación. Reconsistute de acuerdo con las instrucciones del fabricante a una concentración de 10 &mu; g/mL. Alícuota y almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0.22&nbsp; y micro; m, polietersulfona, 250&nbsp; mL, EMD radioesterilizado</td><td>Millipore SCGPU02RE</td><td></td><td>Para la esterilización por reactivos</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Diluir en agua hasta 6 M</td></tr><tr><td>4-Dimetilaminobenzaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39070-50g</td> Para ensayo de <td>hidroxiprolina</td></tr><tr><td>Cloramina-T trihidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402869-100g</td><td>Para ensayo</td></tr> <tr><td>de hidroxiprolinatrans-4-Hidroxi-L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H54409-100g</td> Para ensayo de <td>hidroxiprolina</td></tr><tr><td>1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>279544-1L</td><td>Para ensayo de hidroxiprolina</td></tr><tr><td>Ácido perclórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421-250ml</td><td>Para ensayo de hidroxiprolina</td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0073-9</td><td>Para ensayo de hidroxiprolina</td></tr><tr><td>Hidróxido de</td> <td>sodioFisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>Para ensayo de hidroxiprolina</td></tr><tr><td>Tolueno, anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>Para ensayo de hidroxiprolina</td></tr><tr><td>Placas de poliestireno transparente de 96 pocillos Corning Costar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-656</td><td>Para ensayo de hidroxiprolina</td></tr></tbody></table>

tratamiento de las estructuras de ligamentos con suero acondicionado con ejercicio: un modelo de ingeniería de tejidos traslacional

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Los experimentos in vitro son esenciales para comprender los mecanismos biológicos; Sin embargo, la brecha entre el cultivo de tejidos monocapa y la fisiología humana es grande, y la traducción de los hallazgos es a menudo pobre. Por lo tanto, existe una amplia oportunidad para enfoques experimentales alternativos. Aquí presentamos un enfoque en el que las células humanas se aíslan de remanentes humanos del tejido del ligamento cruzado anterior, se expanden en cultivo y se usan para formar ligamentos manipulados. El ejercicio altera el medio bioquímico en la sangre de tal manera que se mejora la función de muchos tejidos, órganos y procesos corporales. En este experimento, los medios de cultivo de construcción de ligamentos se suplementaron con suero humano experimental que ha sido &quot;condicionado&quot; por el ejercicio. Por lo tanto, la intervención es más biológicamente relevante ya que un tejido experimental está expuesto al medio bioquímico endógeno completo, incluyendo proteínas de unión y compuestos adyuvantes que pueden alterarse en tándem con la actividad de unAgente desconocido de interés. Después del tratamiento, los ligamentos de ingeniería pueden ser analizados para determinar la función mecánica, el contenido de colágeno, la morfología y la bioquímica celular. En general, hay cuatro ventajas principales en comparación con el cultivo monocapa tradicional y los modelos animales, del modelo fisiológico del tejido del ligamento que se presenta aquí. En primer lugar, las construcciones ligamentales son tridimensionales, permitiendo cuantificar las propiedades mecánicas ( es decir , la función) tales como la tensión de tracción final, la carga máxima de tracción y el módulo. En segundo lugar, la entesis, la interfaz entre los huesos y los nervios elementos, se puede examinar en detalle y dentro del contexto funcional. En tercer lugar, la preparación de los medios con suero post-ejercicio permite que los efectos del medio bioquímico inducido por el ejercicio, que es responsable de la amplia gama de beneficios para la salud del ejercicio, sean investigados de manera imparcial. Finalmente, este modelo experimental avanza la investigación científica de una manera humana y ética reemplazando el uso deAnimales, un mandato básico de los Institutos Nacionales de Salud, el Centro para el Control de Enfermedades y la Administración de Alimentos y Medicamentos.

Visión general de la formación del ligamento genético y la intervención experimental La figura 1 muestra una visión general de la formación de ligamentos manipulados. El cemento de brushita, un material sustitutivo óseo 22, se prepara combinando una solución de ácido ortofosfórico / ácido cítrico con fosfato de β-tricálcico en pocillos cilíndricos. Alternativamente, si no se mide directamente la función mecánica de los tejidos, se pueden usar suturas de seda 3-0 como anclas en la formación de un tejido. Estos se separan 12 mm en placas de 35 mm revestidas con silicona y se esterilizan por inmersión en etanol al 70%. Los fibroblastos se aíslan de los restos del ligamento cruzado anterior obtenidos durante la cirugía de reconstrucción del LCA. Después de la expansión, 2,5 x 10 ^ { 5 } células se encapsulan en un gel de fibrina formado en el plato fijado con anclaje de cemento de cepita. Después de la formación,Se pueden examinar los cambios en las propiedades mecánicas, el contenido de colágeno, la proliferación celular, la expresión génica, los niveles de proteínas y la morfología de los tejidos. A lo largo del cultivo, las células contraen el gel de fibrina y forman un tejido lineal entre los dos anclajes ( Figura 2A ). Después de 1-2 días en cultivo, las células se han unido al gel de fibrina, procesos de células extendidas, y comenzaron a ejercer fuerzas de tracción ( Figura 2B ). A medida que el gel de fibrina es contraído por fuerzas de tracción y descompuesto por enzimas celulares, se genera tensión entre los dos puntos de anclaje y nuestras células se alinean paralelamente a este eje ( Figura 2B ) y comienzan a depositar colágeno. Después de 4-5 días, las construcciones se han contraído alrededor de los anclajes formando un tejido cilíndrico lineal ( Figura 2A , en este punto pueden aplicarse estímulos externos al sistemaEn este momento evita la interrupción del proceso lineal de formación de tejidos). Las intervenciones pueden consistir en completar los medios de cultivo con suero humano o animal después de una intervención dada, citoquinas exógenas y factores de crecimiento, emplear estimulación mecánica o cambiar otros factores ambientales tales como la tensión del oxígeno. Usando medio de crecimiento (DMEM con 10% de FBS y 100 U / mL de penicilina) suplementado con 200 μM de ácido ascórbico, 50 μM de L-prolina y 5 ng / ml de TGF-β1, hemos determinado que la proliferación celular continúa a lo largo de un cultivo de 2 semanas ( Figura 2C ) y de hecho, la microscopía de luz revela un tejido denso que contiene células altamente alineadas a los 14 días de cultivo ( Figura 2B ). Evaluación de los ligamentos de ingeniería Al final del período de cultivo, los ligamentos de ingeniería se pueden evaluar en una variedadY de maneras. Una ventaja importante de este sistema es la capacidad de determinar cambios funcionales en el tejido a través de pruebas mecánicas, una evaluación vital teniendo en cuenta el papel mecánico del ligamento nativo. Las pruebas de tracción uniaxial se pueden utilizar para medir las propiedades mecánicas, incluyendo la carga al fallo, la resistencia a la tracción final y el módulo de Young. Las propiedades viscoelásticas también pueden medirse con ensayos de relajación de tensión y fluencia. La figura 3A representa un ligamento manipulado mantenido en empuñaduras moldeadas inversas en un probador de tracción uniaxial construido a la medida. La empuñadura derecha se une a un transductor de fuerza para medir la carga a través del ligamento a medida que el tejido se somete a un fallo. La Figura 3B muestra una gráfica de esfuerzo-deformación representativa para una prueba de fallo. Después de someterse a ensayos mecánicos, las mismas construcciones se pueden secar y procesar para un ensayo de hidroxiprolina 23 para evaluar el contenido total de colágeno, así como otros bioquímicosEnsayos clínicos. Con un número suficiente de muestras adicionales por condición, puede realizarse un examen exhaustivo de una intervención experimental, incluyendo sus efectos sobre la proliferación celular, la expresión de genes y proteínas y la morfología histológica. Mientras que 14 días es un punto final típico de nuestros estudios, ligamentos de ingeniería siguen mejorando en sus propiedades mecánicas y el contenido de colágeno a través de 28 días de cultivo como se muestra en la Figura 3C y puede sobrevivir por lo menos 3 meses en el cultivo [ 24] . La variabilidad de los donantes es una consideración importante para la repetibilidad experimental. La Figura 4 muestra un experimento representativo descrito por Lee et al. 25 comparando 7 diferentes donantes de ACL (n = 3 machos y n = 4 mujeres) que demuestran propiedades de tracción típicas y contenido de colágeno después de un cultivo de 2 semanas en el descrito anteriormente<html> Los medios de crecimiento suplementados. El uso de células de colecciones ACL similares, la edad del donante, el tiempo después de la lesión, el sexo, etc., los ligamentos modificados demuestran una baja variabilidad entre donantes y características similares entre donantes masculinos y femeninos con la excepción de la diferencia en la fracción de colágeno. En el estudio mencionado anteriormente, los ligamentos de ingeniería se utilizaron como un modelo in vitro para investigar por qué las mujeres tienen un riesgo significativamente mayor de lesión del LCA que los hombres, y demostró que los fibroblastos de ACL aislados de las donantes femeninas no inherentemente más débiles y menos colágeno ingeniería ligamentos [ 25] . El impacto del medio de suero post-ejercicio sobre la función del ligamento in vitro Hemos demostrado previamente la capacidad de los ligamentos diseñados para ser utilizados para sondear los procesos fisiológicos 1 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 25. En el siguiente experimento representativo según lo informado por West et al. 1 , determinamos los efectos bioquímicos del ejercicio sobre la función del ligamento y destacamos la metodología y los hallazgos aquí. Se formaron ligamentos de ingeniería utilizando células de ACL humanas y se aplicó una intervención, al día 7 de cultivo, que consistía en medios de cultivo acondicionados con suero humano recogido antes o después del ejercicio. En pocas palabras, reclutó a jóvenes varones sanos participantes y recogió muestras de sangre antes y después de un ataque agudo de ejercicio de resistencia que aumenta las hormonas circulantes y citoquinas, incluyendo la hormona del crecimiento humano (GH). El suero humano se aisló de muestras de sangre antes y después del ejercicio y se usó en lugar de suero bovino fetal en el medio de cultivo durante la segunda semana de cultivo de ligamento manipulado ( Figura 5A ). Las muestras de suero antes y después del ejercicio se analizaron usando ELISA para los cambios en la GH y el factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), elCuya concentración puede ser alterada por el ejercicio ( Figura 5B ). Esta información se utilizó para correlacionar los efectos del suero en los ligamentos de ingeniería con cambios en el suero en respuesta al ejercicio. Después de un período de cultivo de 14 días, las construcciones del ligamento se evaluaron mediante pruebas mecánicas y una determinación de hidroxiprolina del contenido de colágeno y demostraron un aumento significativo tanto en la carga máxima de tracción como en el contenido de colágeno en respuesta al suero posterior al ejercicio. Con el objetivo de evaluar si este efecto estaba relacionado con liberaciones inducidas por ejercicio de GH o IGF-1, se formaron ligamentos manipulados en un experimento separado y se trataron con una respuesta a la dosis de GH recombinante humana o IGF-1. Curiosamente, mientras que la GH sérica aumentó en la sangre ( Figura 5B- i), el aumento progresivo de la concentración de GH recombinante en el medio de cultivo no aumentó el contenido de colágeno ( Figura 5D- i) o mecánicaPropiedades (datos no mostrados) en ligamentos manipulados. Por el contrario, los niveles séricos de IGF-1 no aumentaron después del ejercicio, pero un experimento de dosis-respuesta reveló que los niveles crecientes en los medios de cultivo mejoraban el contenido de colágeno de las construcciones ligamentarias ( Figura 4D- iii). Por lo tanto, mientras que el ejercicio dio lugar a fuertes aumentos en la GH post-ejercicio, el experimento de dosis-respuesta utilizando rhGH plantea dudas sobre si GH es directamente responsable de la mejora fenotípica de los ligamentos de ingeniería (al menos, la isoforma 22 kDa por sí sola no Parecen ser responsables). Por el contrario, mientras que el IGF-1 sérico no se alteró a los 15 minutos después del ejercicio, el ensayo de rhIGF-1 en un amplio intervalo de concentraciones reveló que el IGF-1 es capaz de mejorar el contenido de colágeno; Sin embargo, debe observarse que el aumento de las concentraciones de rhIGF-1 a través de un intervalo que estimó los niveles fisiológicos no aumentó significativamente el contenido de colágeno. Así, el único entorno de suero post-ejercicioNal era importante para mejorar la mecánica y el colágeno de los ligamentos de ingeniería. En el estudio resaltado aquí 1 , el volumen de suero experimental fue limitado debido a consideraciones éticas; Así, los bioensayos 2D a corto plazo, que tenían demandas de suero más bajas, se utilizaron para investigar más a fondo los mecanismos moleculares responsables del aumento de colágeno que se observó. Los fibroblastos de ACL se cultivaron hasta la confluencia en placas de 6 pocillos y se trataron durante 1 hora con suero en reposo o post-ejercicio, y se compararon con respuestas de dosis de GH recombinante, IGF-1, TGF-β1 y la activación de dianas en PI3K / mTORC1 , ERK1 / 2, y Smad vías de señalización se determinaron. En la presencia de suero post-ejercicio, el PI3K / mTORC1 y ERK1 / 2 vía mostró una mayor activación, evaluada por la fosforilación de S6K ( Figura 5D- i) y ERK1 / 2 ( Figura 5D- ii), respectivamente.En comparación con las respuestas a la dosis de hormonas y citoquinas, mientras que la GH tuvo un pequeño efecto positivo en la señalización de mTOR ( Figura 5D- i) y IGF-1 mostraron un efecto positivo a la dosis más baja, los tres tratamientos de GH, IGF-1 y TGF -Β1 no tuvo en cuenta el aumento de PI3K / mTORC1 y ERK1 / 2 de señalización. En conjunto, nuestro modelo de ligamento 3D manipulado y datos de bioensayos 2D sugieren que el ambiente de suero después del ejercicio es capaz de mejorar la función del ligamento y el contenido de colágeno mediante la activación de las vías PI3K / mTORC1 y ERK1 / 2. En resumen, utilizando un modelo de ligamento modificado combinado con suero condicionado al ejercicio, pudimos i) investigar el efecto del ambiente sérico post-ejercicio sobre la función ligamentaria y el colágeno, ii) correlacionar los cambios en el fenotipo del ligamento con los cambios en la concentración hormonal del suero, Con el objetivo de determinar qué cambios en el suero condujeron a cambiosEn los ligamentos de ingeniería, y iii) ampliar el alcance del trabajo mediante el uso de bioensayos 2D para sondear los objetivos moleculares del medio bioquímico del suero para determinar los mecanismos moleculares que son activados por el suero posterior al ejercicio que conducen a mejoras en la función del ligamento. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general de la formación y el uso de ligamentos de ingeniería. Los anclajes de cemento Brushite se fabrican y se fijan en placas recubiertas de silicona. Los fibroblastos primarios son aislados y expandidos a partir de los restos de ACL. Los ligamentos de ingeniería se forman encapsulando fibroblastos en un gel de fibrina alrededor de dos anclajes de cemento de pincelita. Los ligamentos de ingeniería se cultivan y se tratan con cualquier estímulo químico o mecánico específico ( por ejemplo , a través de un biorreactor) deseado. En el punto final deseado, los ligamentos de ingeniería se pueden recoger y evaluar para mecánicaL propiedades, expresión génica, contenido de colágeno, expresión proteica e histología. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig2.jpg" /> Figura 2. Los fibroblastos de ligamentos primarios forman un ligamento de hueso a hueso basado en fibrina que atraviesa dos anclajes de cemento de pincelita. ( A ) Con el tiempo, los fibroblastos contraen el gel de fibrina alrededor de los anclajes de cemento de cepita formando un tejido lineal. ( B ) En los tres primeros días, las células se unen al gel de fibrina y ejercen fuerzas de tracción, alineando las células con el eje largo del constructo. Durante 14 días, las células forman un tejido altamente alineado. Barra de escala = 160 μm. ( C ) El contenido de ADN de los ligamentos de ingeniería sigue aumentandoVer 14 días en cultivo como las células proliferan. Los datos se presentan como media ± SD con n = 3-4 construcciones por grupo. Grupos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig3.jpg" /> Figura 3: Las propiedades mecánicas del ligamento mecánico y el contenido de colágeno mejoran con el tiempo. ( A ) Las construcciones ligamentales se ensayan uniaxialmente a tracción para determinar el efecto de una intervención dada en la función ligamentaria. Como se muestra, dos puños impresos en 3D, moldeados en reversa, mantienen anclajes de forma recíproca que están puenteados por el tendón de ingeniería. Los anclajes están acoplados a un motor paso a paso y un transductor de fuerza para generar curvas de tensión / deformación del tejido ensayado, permitiendo determinar propiedades mecánicas. ( B &lt;/ Strong&gt;) Curva de tensión-deformación representativa de un ligamento manipulado que se sometió a un fallo. En el transcurso de 28 días, la resistencia a la tracción final (UTS), ( D ) la carga máxima de tracción (MTL), el módulo de Young y la fracción de colágeno ( F ) continúan mejorando. Los datos se presentan como media ± DE con n = 5 construcciones por grupo. * Indica una diferencia significativa con respecto a todos los demás grupos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig4.jpg" /> Figura 4: Los ligamentos de ingeniería pueden ser evaluados para determinar la funcionalidad y el contenido bioquímico, mostrando una baja variabilidad del donante. Se formaron ligamentos de ingeniería 7 diferentes donantes (n = 3 machos, n = 4 mujeres). Después de 2 semanas oF), se evaluaron las diferencias en ( A ) carga máxima de tracción, ( B ) resistencia a la tracción final (UTS), ( C ) módulo de Young, ( D ) área de sección transversal (CSA), ( E ) Construir, y ( F ) colágeno como una fracción de masa seca. Los datos se presentan como media ± SD y la significación estadística fue con la prueba t de Student. * Indica diferencia significativa con otros grupos (p &lt;0,05). Figura adaptada de Lee et al. 25 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig5.jpg" /> Figura 5. Los ligamentos de ingeniería demuestran cambios mecánicos y bioquímicos en respuesta al bioloIntervenciones médicas. ( A ) Se aisló el suero de muestras de sangre recogidas de sujetos pre- (RestTx) y post-ejercicio (ExTx) y se usaron para tratar ligamentos de ingeniería durante la segunda semana de cultivo. ( B ) (i) La hormona del crecimiento humano (GH) y (ii) los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) -1 en el resto y el suero de ejercicio se cuantificaron mediante ELISA. ( C ) Los ligamentos de ingeniería tratados con ExTx demostraron mejorar (i) el contenido de colágeno y (ii) la máxima carga de tracción. La significación estadística de las comparaciones apareadas (RestTx y ExTx) se analizó mediante una prueba t con un nivel de significación establecido en p &lt;0,05. ( D ) Se utilizó una dosis-respuesta de (i) GH y (ii) IGF-1 para determinar las posibles contribuciones de estos factores a los cambios en el contenido de colágeno debidos a ExTx. E) Se usaron bioensayos 2D para comparar los efectos de dosis crecientes de GH, RestTx y ExTx sobre dianas de señalización molecular tales como la fosforilación de (i) S6K Thr389 y (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . Comparación estadística de más de dos grupos experimentales se realizó mediante ANOVA y Tukey HSD. Los datos se presentan en forma de media ± DE. * Indica una diferencia significativa con respecto al control (p &lt;0,05) y § indica una diferencia significativa de 150 ng / ml y 300 ng / ml de IGF-1. Figura adaptada de West et al. 1 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos un modelo de tejido ligamentario en el que las construcciones tridimensionales se tratan con el suero humano condicionado al ejercicio y se analizan el contenido de colágeno, la función y la bioquímica celular.

Tratamiento de las estructuras de ligamentos con suero acondicionado con ejercicio: Un modelo de ingeniería de tejidos traslacional

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

El objetivo general de este modelo es determinar el impacto del ejercicio y la nutrición sobre la síntesis y función del tejido conectivo. Esta técnica utiliza suero humano obtenido antes y después del ejercicio para tratar tejidos tridimensionales, con el fin de comprender cómo el ejercicio afecta la función de los ligamentos y tendones. El tejido tridimensional combina las ventajas de los ensayos in vitro bien caracterizados con la función, morfología y características bioquímicas de los tejidos in vivo.Después de preparar con antelación placas de 35 milímetros recubiertas con silicona según el protocolo descrito en el texto, prepare moldes de anclaje colocando un alfiler minutien en el centro de cada pozo cilíndrico en los moldes. Combine el fosfato tricálcico beta y la solución de ácido ortofosfórico cítrico a una proporción de uno a tres gramos por mililitro en un recipiente plástico para pesar sobre hielo. Utilice un raspador celular de plástico para mezclar vigorosamente el cemento.Triture el cemento para continuar la mezcla y pipetee la mezcla en los moldes; luego, centrifugue el molde lleno a 2.250 ×g durante cinco minutos. Tras la centrifugación, deje que los anclajes de cemento de brushita fragüen a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, retire los anclajes del molde y sujete dos anclajes, separados 12 milímetros entre sí, en cada placa recubierta de silicona.Esterilice las placas sujetadas rociándolas con etanol al 70%, llenando tanto las placas como las tapas, y luego coloque las placas en una cabina de seguridad biológica, o BSC. Después de al menos 30 minutos, aspire las placas y déjelas secar en la cabina de seguridad biológica. Vuelva a colocar las tapas y guárdelas en la BSC hasta que sean necesarias.Cumpla con las regulaciones locales sobre riesgos biológicos para el uso y desecho adecuado de materiales biopeligrosos. Mantenga la esterilidad y realice los pasos de formación del constructo en una cabina de seguridad biológica. Después de preparar los fibroblastos primarios, los reactivos y las placas recubiertas con silicona que contienen anclas de brushita, según el protocolo descrito en el texto, cultive las células en placas de 15 centímetros hasta alcanzar una confluencia del 70 %.A continuación, prepare una mezcla maestra compuesta por lo siguiente: 681 microlitros por construcción de suspensión celular, 29 microlitros por construcción de trombina, dos microlitros por construcción de aprotinina y dos microlitros por construcción de ácido aminohexanoico. Después de mezclar bien la solución, agregue 714 microlitros a cada placa fijada en un patrón de ocho alrededor de los anclajes de cemento de brushita, asegurándose de que la mezcla maestra entre en contacto directo con los lados de los anclajes. Toque suavemente cada placa para distribuir uniformemente la mezcla.El paso más crítico consiste en formar el gel de fibrina con células asentadas. Asegúrese de que la mezcla maestra para el asentamiento celular entre en contacto directo con los anclajes, y golpee suavemente la placa para distribuir la mezcla de manera uniforme. Una placa a la vez, añada 286 microlitros de fibrinógeno de forma gota a gota y distribuyéndolos uniformemente sobre la placa.Deslice inmediatamente la placa hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado, para distribuir el fibrinógeno y formar los geles de fibrina con células embebidas; luego, continúe con la siguiente placa. Coloque los constructos en un incubador estéril mantenido a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, e incube durante al menos 15 minutos para permitir la polimerización del fibrinógeno. Prepare dos mililitros por constructo de medio de alimentación suplementando el medio de crecimiento con 200 micromoles de ácido ascórbico, 50 micromoles de prolina y cinco nanogramos por mililitro de TGF beta 1.Utilice dos mililitros de medio de cultivo para cubrir cada constructo y cultive los constructos en un incubador estéril mantenido a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante un total de 14 días, o hasta el punto final deseado, renovando el medio cada segundo día con dos mililitros de medio de cultivo. Para recolectar suero humano, tome una muestra de sangre en reposo según el protocolo descrito, luego haga que los participantes realicen un tipo de ejercicio que se ajuste al objetivo de su investigación. Aquí se muestra una sesión de 30 minutos de ejercicio resistido de alta intensidad.Recolecte una muestra de sangre 15 minutos después de la sesión de ejercicio; luego, tras permitir que la sangre coagule, centrifugue la muestra a 1.500 ×g durante 10 minutos. En condiciones estériles, transfiera el suero a tubos estériles para la preparación del medio. Tras la preparación de los constructos de ligamento, realice pruebas de tracción utilizando un equipo de tracción en un baño de PBS con pinzas moldeadas inversamente acopladas al transductor de fuerza.Esto mantiene los anclajes de cemento de brushita en su lugar durante la prueba. Utilizando un calibrador digital, determine la longitud y el ancho de los constructos de ligamento y calcule el área de la sección transversal del tejido. Desenganche el constructo de ligamento de la placa y coloque los anclajes en las mordazas moldeadas inversamente, asegurándose de que el constructo esté sumergido en PBS; luego, ajuste la distancia entre las mordazas, estableciendo la longitud del constructo a su longitud inicial.Inicie la prueba y deforme el constructo hasta su falla a una velocidad de deformación de 0,4 milímetros por segundo, o 3 % por segundo. Tras la prueba, procese el tejido y realice la cuantificación de colágeno de los ligamentos ingenierizados según el protocolo descrito en el texto. Después de uno o dos días en cultivo, los fibroblastos del LCA se han adherido al gel de fibrina, extendido sus prolongaciones celulares y comenzado a ejercer fuerzas de tracción.Se genera tensión entre los dos puntos de anclaje, y las células se alinean paralelas a este eje y comienzan a depositar colágeno. Aquí se muestra un gráfico representativo de tensión-deformación para un ligamento ensayado hasta la falla. En estos experimentos, el suero humano se aisló a partir de muestras de sangre antes y después del ejercicio y se utilizó en lugar de suero bovino fetal (FBS) para generar un medio enriquecido con el entorno bioquímico inducido por el ejercicio.Como se muestra en este gráfico, tras un período de cultivo de 14 días, los constructos de ligamento mostraron un aumento significativo tanto en la carga máxima a tracción como en el contenido de colágeno en respuesta al suero post-ejercicio. Una vez dominada la técnica, los constructos de ligamento pueden elaborarse en el transcurso de dos días y estarán listos para pruebas de tracción, cuantificación del contenido de colágeno y otros análisis bioquímicos en dos semanas. Este modelo traslacional in vitro e in vivo forma parte de una misión más amplia destinada a comprender cómo el ejercicio mejora la función de los ligamentos, tendones y, de hecho, casi todos los tejidos del cuerpo.Por lo tanto, esta es una técnica realmente robusta y potente con la que podemos determinar el contenido de colágeno y la función del tejido conectivo tras tratamientos con ejercicio, nutrición, carga mecánica, factores de crecimiento de todo tipo, y todo tipo de intervenciones diferentes que podemos realizar en humanos o animales.

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Bioengineering

Bioingeniería

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Tratamiento de las estructuras de ligamentos con suero acondicionado con ejercicio: Un modelo de ingeniería de tejidos traslacional (Video) | JoVE Journal

Tratamiento de las estructuras de ligamentos con suero acondicionado con ejercicio: Un modelo de ingeniería de tejidos traslacional

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