Tratamiento de las estructuras de ligamentos con suero acondicionado con ejercicio: Un modelo de ingeniería de tejidos traslacional

El objetivo general de este modelo es determinar el impacto del ejercicio y la nutrición en la síntesis y función del tejido conectivo. Esta técnica utiliza suero humano que se toma antes y después del ejercicio para tratar los tejidos 3D, de modo que podamos entender cómo afecta el ejercicio a la función de los ligamentos y tendones. La garantía de tejidos 3D combina los beneficios de los ensayos in vitro bien caracterizados con la función, la morfología y las características bioquímicas de los tejidos in vivo.

Después de preparar placas de 35 milímetros recubiertas de silicona con anticipación de acuerdo con el protocolo de texto, prepare los moldes de anclaje colocando un alfiler minucioso en el centro de cada pozo cilíndrico en los moldes. Combine la solución de fosfato beta tricálcico y ácido cítrico ortofosfórico a uno a tres gramos por mililitro en un bote de pesaje de plástico sobre hielo. Use un raspador de celda de plástico para mezclar vigorosamente el cemento.

Triture el cemento para continuar mezclando y pipetee la mezcla en los moldes, luego centrifuga el molde lleno a 2, 250 veces g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, deje que los anclajes de cemento brushite se asienten a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, retire los anclajes del molde y fije dos anclajes, a 12 milímetros de distancia en cada placa recubierta de silicona.

Esterilice las placas con alfileres rociándolas con etanol al 70%, llene tanto las placas como las tapas, luego coloque las placas en un gabinete de seguridad biológica o BSC. Después de al menos 30 minutos, aspire las placas y déjelas probar en el BSC. Vuelva a colocar las tapas y guárdelas en el BSC hasta que las necesite.

Cumplir con las regulaciones locales de riesgo biológico para el uso y la eliminación adecuados de material de riesgo biológico. Mantener la esterilidad y realizar los pasos de formación de constructos en una cabina de seguridad biológica. Después de preparar fibroblastos primarios, reactivos y placas recubiertas de silicona con anclajes de brushita clavados, de acuerdo con el protocolo de texto, cultive las células en placas de 15 centímetros hasta una confluencia del 70%.

A continuación, prepare una mezcla maestra compuesta por lo siguiente, 681 microlitros por constructo de suspensión celular, 29 microlitros por constructo de trombina, dos microlitros por constructo de aprotinina y dos microlitros por constructo de ácido aminohexanoico. Después de mezclar bien la solución, agregue 714 microlitros a cada placa clavada en un patrón en forma de ocho alrededor de los anclajes de cemento brushita, asegurándose de que la mezcla maestra entre en contacto directo con los lados de los anclajes. Golpee suavemente cada plato para distribuir uniformemente la mezcla.

El paso más crítico es la formación del gel de fibrina asentado en la célula. Asegúrese de que la mezcla maestra de asientos de celda entre en contacto directo con los anclajes y golpee la placa para distribuir la mezcla de manera uniforme. Un plato a la vez, agregue 286 microlitros de fibrinógeno gota a gota de manera uniforme sobre el plato.

Deslice inmediatamente la placa hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir el fibrinógeno y formar los geles de fibrina incrustados en las células, luego proceda a la siguiente placa. Coloque las construcciones en una incubadora estéril mantenida a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, e incube durante al menos 15 minutos para permitir la polimerización del fibrinógeno. Prepare dos mililitros por construcción de medio de alimentación complementando el medio de crecimiento con 200 micromoles de ácido ascórbico, 50 micromoles de Prolene y cinco nanogramos por mililitro de TGF beta 1.

Utilice dos mililitros de medio de alimentación para cubrir cada constructo, y cultive los constructos en una incubadora estéril mantenida a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante un total de 14 días, o hasta el punto final deseado, refrescando el medio cada dos días con dos mililitros de medio de alimentación. Para recolectar suero humano, extraiga una muestra de sangre en reposo de acuerdo con el protocolo de texto, luego haga que los participantes realicen un modo de ejercicio que se ajuste a su objetivo de investigación. Aquí se muestra una sesión de 30 minutos de ejercicio de resistencia de alta intensidad.

Recoja una muestra de sangre 15 minutos después de la sesión de ejercicio, luego, después de permitir que la sangre coagule, centrifugue la muestra a 1.500 veces g durante 10 minutos. En condiciones estériles, transfiera el suero a tubos estériles para la preparación de los medios. Después de la preparación de las construcciones de ligamento, realice pruebas de tracción utilizando un probador de tracción en un baño PBS con mordazas moldeadas inversas que se acoplan al transductor de fuerza.

Eso mantiene los anclajes de cemento brushite en su lugar durante la prueba. Usando calibradores digitales, determine la longitud y la longitud de las construcciones de ligamento, y calcule el área de la sección transversal del tejido. Desenganche la construcción del ligamento de la placa y coloque los anclajes en las mordazas moldeadas inversamente, asegurándose de que la construcción esté sumergida en PBS, luego ajuste la distancia entre las mordazas, ajustando la longitud de la construcción a su longitud inicial.

Comience la prueba y esfuerce el constructo hasta el fallo a una velocidad de deformación de 0,4 milímetros por segundo, o 3% por segundo. Después de la prueba, procese el tejido y lleve a cabo la cuantificación de colágeno de los ligamentos diseñados de acuerdo con el protocolo de texto. Después de uno o dos días en cultivo, los fibroblastos ACL se han unido al gel de fibrina, han extendido los procesos celulares y han comenzado a ejercer fuerzas de tracción.

Se genera tensión entre los dos puntos de anclaje, y las células se alinean paralelas a este eje, y comienzan a depositar colágeno. Aquí se muestra un gráfico representativo de deformación por estrés para un ligamento probado hasta el fallo. En estos experimentos, se aisló suero humano de muestras de sangre antes y después del ejercicio y se utilizó en lugar de FBS para generar medios enriquecidos con el medio bioquímico inducido por el ejercicio.

Como se muestra en este gráfico, después de un período de cultivo de 14 días, las construcciones de ligamento demostraron un aumento significativo tanto en la carga máxima de tracción como en el contenido de colágeno en respuesta al suero posterior al ejercicio. Una vez dominados, las construcciones de ligamentos se pueden hacer en el transcurso de dos días, y estarán listas para las pruebas de tracción, la cuantificación del contenido de colágeno y otros análisis bioquímicos en dos semanas. Este modelo traslacional in vitro in vivo es parte de una misión más amplia para comprender cómo el ejercicio mejora la función de ligamentos, tendones y, en realidad, casi todos los tejidos del cuerpo.

Por lo tanto, esta es una técnica realmente robusta y fuerte donde podemos determinar el contenido de colágeno y la función del tejido conectivo después de tratamientos con ejercicio, nutrición, carga, cualquier tipo de factores de crecimiento, todo tipo de intervenciones diferentes que podemos hacer en humanos o animales.