Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas
5 de mayo de 2017
Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).
El objetivo general de este protocolo es permitir a los investigadores capturar, separar y analizar complejos proteicos nativos extraídos de lisados tisulares mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Este método puede ayudar a los investigadores que estudian proteínas porque es capaz de estabilizar asociaciones proteicas normalmente lábiles en condiciones cercanas a las nativas, lo que permite su identificación y posterior análisis. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza métodos biológicos comunes, por lo que es ampliamente aplicable y puede adaptarse a los objetivos de cada investigador.
Para comenzar este procedimiento, prepárese para la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul según se describe en el protocolo escrito. Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y realice la electroforesis de las proteínas en el gel a 150 voltios hasta que la banda de colorante avance aproximadamente dos centímetros dentro de la capa de resolución. En este punto, detenga y desconecte la fuente de alimentación.
Después de desarmar el aparato de electroforesis, separen los paneles de vidrio de la cassette de gel. Retire y deseche la capa de concentración. Corte cuidadosamente el gel justo debajo del borde inferior del frente de colorante, teniendo cuidado de que este corte sea lo más suave y recto posible.
Luego, deseche el trozo de gel no utilizado. Recorte las porciones no utilizadas a lo largo de los bordes de la tira de gel. Coloque cuidadosamente la tira en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato en un recipiente pequeño y mezcle suavemente mediante agitación durante 30 minutos para equilibrar.
Tras la equilibración, deseche y reemplace el PBS con otros 10 mililitros. Pipetee 500 microlitros de DSP 25 milimolar disuelto en dimetilsulfóxido en el PBS y continúe mezclando como antes durante 30 minutos. Después de 30 minutos, vierta la solución de DSP.
Añada 10 mililitros de HCl 0,375 M, pH 8,8, que contenga 2% de dodecilsulfato de sodio para inactivar el DSP no reaccionado. Continúe la incubación durante 15 minutos. Mientras la tira de gel se está inactivando, prepare soluciones de gel SDS-PAGE según métodos estándar.
No agregue los reactantes de polimerización. Después de la inhibición, devuelva la tira de gel nativo azul a temperatura ambiente y coloque la tira en una nueva cubeta de gel. Para hacer esto, levante cuidadosamente el gel y colóquelo sobre una placa separadora limpia de la cubeta de gel.
Oriente la tira de modo que esté girada con respecto a su orientación anterior y el borde inferior del frente de colorante esté más cerca de la parte superior del nuevo casete. Coloque la tira de manera que su borde superior quede alineado con la posición donde estará el borde superior de la placa de cubierta. Asegúrese de que el frente de colorante sea paralelo a los bordes horizontales de la placa de vidrio.
Presione un lado de la tira recortada contra una de las paredes espaciadoras, dejando espacio en el otro lado para verter el gel y cargar un patrón proteico o escalera. Si el borde inferior de la tira de gel presenta áreas irregulares o dentadas, córtelas cuidadosamente. Una vez que la tira de gel esté correctamente posicionada, coloque la placa de cubierta sobre la placa espaciadora.
Aplique presión suave para expulsar cualquier burbuja de aire atrapada. Continúe ensamblando el aparato para verter geles según las instrucciones del fabricante. La tira de gel a veces se desplaza cuando se coloca la placa superior.
Es útil dejar que la tira sobresalga un poco por el borde de la placa superior para poder ajustarla con una espátula y corregir cualquier desplazamiento. Añada los reactivos de polimerización al tampón del gel de resolución y viértalos en la cassette de gel preparada utilizando una pipeta serológica. Llene la cassette de gel hasta aproximadamente dos centímetros por debajo de la tira de gel de electroforesis nativa azul recortada para dejar espacio para la capa de concentración.
Luego, agregue 100 microlitros de butanol sobre la parte superior del gel vertido y deje 30 minutos para la polimerización de la capa de resolución antes de verter el butanol. A continuación, agregue los reactivos de polimerización a la solución del gel de concentración. Utilizando una pipeta serológica, vierta la capa de concentración para llenar todo el espacio vacío restante en la cassette del gel.
Incline el cassette del gel al verter la capa de apilamiento para que llene el espacio debajo de la tira de gel y no queden atrapadas burbujas de aire. A medida que el tampón del gel de apilamiento llena el espacio vacío debajo de la tira de gel, devuelva gradualmente el cassette del gel a una posición nivelada. Continúe llenando el espacio adyacente a la tira de gel seccionada con el tampón del gel de apilamiento hasta que casi desborde.
Luego, permita que la capa de apilamiento polimerice durante 30 minutos. Después de que la capa de apilamiento haya polimerizado, retire el cassette del gel del aparato de vertido, enjuáguelo con agua destilada y arme el aparato de electroforesis según las instrucciones del fabricante. Llene completamente la cámara interna con tampón de electroforesis 1x SDS-PAGE.
Luego, llene la cámara externa hasta el nivel indicado por el fabricante. Cargue el espacio junto a la tira de gel extraída con una escala de peso molecular o el patrón de proteína adecuado. Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y realice la electroforesis de las muestras a 120 voltios.
Cuando el colorante Coomassie salga del gel, detenga la electroforesis y desconecte la fuente de alimentación. Analice el gel utilizando métodos estándar de electrotransferencia y detección de proteínas con anticuerpos. La validación de la electroforesis en gel de multímeros se muestra aquí mediante inmunotransferencia.
El complejo de cinasina capturado es escindido por difio-3-itol, lo que demuestra que los agregados de alto peso molecular se forman mediante la unión cruzada de sustituyentes más pequeños. Aquí se muestra que lisados cerebrales tratados con concentraciones crecientes de SDS o Triton incrementaron la detección de alfa-sinucleína monomérica mientras reducían la detección del tetrámero oligómero soluble. A continuación, se presentan resultados representativos de multimer-PAGE utilizados para capturar complejos solubles en lisado cerebral de rata.
Las proteínas se detectaron mediante inmunotransferencia. El peso monomérico esperado de cada proteína se muestra debajo de las bandas. De manera similar, aquí se muestra la captura de complejos unidos a la membrana.
La electroforesis en gel de multímeros (Multimer-PAGE) a veces no logra captar un complejo, como se muestra en la doble tinción del complejo respiratorio SDHA. En el protocolo escrito se puede encontrar una discusión sobre posibles explicaciones para este fenómeno. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente ocho horas si se lleva a cabo correctamente.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la reticulación en gel de complejos proteicos nativos seguida de la recolocación del gel y separación mediante SDS-PAGE secundaria. No olvide que trabajar con acrilamida puede ser extremadamente peligroso y se debe usar equipo de protección personal mientras se coloca el gel. Tras este procedimiento, los complejos estabilizados separados pueden eluirse o cortarse del gel y pueden analizarse de diversas maneras, incluyendo inmunodetección o espectrometría de masas, según las necesidades del investigador.
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Descripción general
Este protocolo presenta un método para estabilizar y separar complejos proteicos nativos a partir de lisados tisulares utilizando un sistema novedoso de electroforesis en gel de poliacrilamida en dos dimensiones (PAGE). Permite el análisis de asociaciones proteicas en condiciones cercanas a las nativas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- bioquímica
- proteómica
- electroforesis
Antecedentes
- Comprender los complejos proteicos es fundamental para muchos estudios biológicos.
- Las asociaciones proteicas nativas pueden ser lábiles y difíciles de analizar.
- Los métodos biológicos comunes facilitan la aplicación de esta técnica.
- Este método permite enfoques personalizados para el análisis de proteínas.
Objetivo del estudio
- Capturar y analizar complejos proteicos nativos a partir de lisados de tejidos.
- Estabilizar las asociaciones proteicas para una mejor identificación.
- Proporcionar un método ampliamente aplicable para los investigadores.
Métodos Utilizados
- Preparación para la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul.
- Electroforesis de proteínas a 150 voltios.
- Seguimiento del avance de la banda de colorante en el gel.
- Uso de un agente entrecruzante de proteínas reactivo con aminas.
Resultados principales
- Estabilización exitosa de complejos proteicos nativos.
- Separación eficaz de proteínas en lisados de tejidos.
- Identificación de asociaciones proteicas en condiciones casi nativas.
Conclusiones
- Este método mejora el análisis de complejos proteicos.
- Es adaptable a diversos objetivos de investigación.
- El uso de métodos comunes aumenta la accesibilidad para los investigadores.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El PAGE de multímeros permite a los equipos de I+D de biofármacos estabilizar y resolver complejos proteicos nativos a partir de lisados tisulares en condiciones casi nativas, apoyando la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Al preservar asociaciones proteicas lábiles que a menudo se pierden en la purificación convencional, este método mejora la confianza predictiva en el análisis de vías y en la identificación de dianas terapéuticas basadas en complejos. Este enfoque potencia la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la evaluación preclínica al proporcionar lecturas cuantitativas y reproducibles de la formación de complejos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas al capturar interacciones proteicas nativas sin perturbar los enlaces no covalentes.
- Valor operativo: Utiliza técnicas accesibles de electroforesis nativa azul y SDS-PAGE, familiares para la mayoría de los equipos de biología molecular, lo que reduce la necesidad de formación especializada.
- Valor predictivo: Facilita la validación funcional de objetivos al estabilizar complejos para su identificación posterior mediante inmunotransferencia o espectrometría de masas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera perfiles de complejos resueltos que pueden servir como biomarcadores cuantitativos para la estandarización de ensayos en campañas de cribado.
- Valor operativo: Se basa en reactivos y equipos económicos y ampliamente disponibles, lo que permite una implementación escalable en instalaciones centrales.
- Preparación del ensayo: Produce complejos separados por SDS-PAGE compatibles con métodos de detección posteriores como la inmunodetección, facilitando la integración en cribados de alto contenido.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos al preservar la integridad compleja para su validación en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Permite evaluar la formación de complejos bajo distintas condiciones (por ejemplo, exposición a detergentes o SDS), aportando información sobre la robustez del blanco.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite tomar decisiones de avance o interrupción basadas en la estabilidad y abundancia del complejo, reduciendo el abandono en fases tardías debido a incertidumbres mecanicistas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El PAGE de multímeros se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando un puente mecanicista hacia la validación preclínica al permitir el análisis de complejos proteicos nativos en muestras derivadas de tejidos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al capturar complejos endógenos a partir de lisados de tejidos no modificados.
- Selección: Permite el desarrollo de ensayos mediante la separación y detección reproducible de complejos, facilitando la evaluación del efecto de compuestos sobre la interacción con el blanco.
- Análisis: Ofrece separación cuantitativa de complejos proteicos mediante SDS-PAGE secundaria, permitiendo la comparación de condiciones o tratamientos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al mantener la estabilidad de los complejos para su validación en modelos de enfermedad, apoyando la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad de plataforma reutilizable en lugar de un ensayo de un solo uso, adaptable a múltiples blancos y áreas de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las redes de interacción proteica.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante protocolos basados en geles estandarizados y técnicas familiares de electroforesis.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en objetivos, minimizando la inversión en mecanismos mal validados.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo al proporcionar evidencia directa de la formación y estabilidad de complejos en contextos nativos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de PAGE nativo y PAGE-SDS, incluyendo la preparación de geles y la separación electroforética.
- Depende del acceso a equipos de electroforesis, fuentes de alimentación y reactivos estándar como el agente entrecruzante DSP y SDS.
- Necesita una estandarización entre equipos para lograr una captura y detección consistentes de complejos en grupos de descubrimiento y preclínicos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos de tejidos y tamaños de complejos, ya que la eficiencia de separación puede variar según el peso molecular.
- Limitado por las dificultades para resolver complejos extremadamente grandes y la posible variabilidad en la eficiencia de entrecruzamiento, como se indica en la bibliografía citada.
