Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

El objetivo general de este protocolo es permitir a los investigadores capturar, separar y analizar complejos de proteínas nativas extraídos de lisados de tejidos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Este método puede ayudar a los investigadores que estudian proteínas porque es capaz de estabilizar asociaciones de proteínas que de otro modo serían lábiles en condiciones casi nativas, lo que permite su identificación y posterior análisis. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza métodos biológicos comunes, por lo que es ampliamente aplicable y se puede adaptar a los objetivos del investigador individual.

Para comenzar este procedimiento, prepárese para la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul como se describe en el protocolo de texto. Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y electroforese las proteínas en el gel a 150 voltios hasta que la banda de tinte progrese aproximadamente dos centímetros en la capa de resolución. En este punto, detenga y desconecte la fuente de alimentación.

Después de desmontar el aparato de electroforesis, separe los cristales del casete de gel. Retire y deseche la capa de apilamiento. Corta con cuidado el gel justo debajo del borde inferior del frente del tinte, teniendo cuidado de que este corte sea lo más suave y recto posible.

Luego, desecha el pedazo de gel sin usar. Recorta las partes no utilizadas a lo largo de los bordes de la tira de gel. Coloque con cuidado la tira en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato en un recipiente pequeño y mezcle suavemente por notación durante 30 minutos para equilibrar.

Después del equilibrio, deseche y reemplace el PBS con otros 10 mililitros. Pipetear 500 microlitros de DSP de 25 milimolares disueltos en dimetilsulfóxido en el PBS y continuar mezclando como antes durante 30 minutos. Después de 30 minutos, vierta la solución DSP.

A 10 mililitros de HSCL 0,375 molar, pH 8,8, que contiene 2% de dodecil sulfato de sodio para apagar el DSP no reaccionado. Continúe la anotación durante 15 minutos. Mientras la tira de gel se enfría, prepare las soluciones de gel SDS-PAGE de acuerdo con los métodos estándar.

No agregue los reactivos de polimerización. Después del enfriamiento, regrese la tira de gel nativo azul a temperatura ambiente y colóquela en un nuevo casete de gel. Para hacer esto, recoja con cuidado el gel y colóquelo sobre una placa espaciadora de casete de gel limpia.

Oriente la tira de modo que se voltee de su orientación anterior y la parte inferior del frente del tinte esté más cerca de la parte superior del nuevo casete. Coloque la tira de manera que su borde superior quede a la altura de donde estará el borde superior de la placa de cubierta. Asegúrese de que el frente del tinte esté paralelo a los bordes horizontales de la placa de vidrio.

Empuje un lado de la tira extirpada contra una de las paredes del espaciador, dejando espacio en el otro lado para verter el gel y cargar un patrón de proteínas o una escalera. Si el borde inferior de la tira de gel contiene áreas irregulares o irregulares, córtelas con cuidado. Una vez que la tira de gel esté colocada correctamente, coloque la placa de cubierta sobre la placa espaciadora.

Aplique una presión suave para expulsar las burbujas de aire atrapadas. Continúe ensamblando el aparato de vertido de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La tira de gel a veces se desplaza cuando se coloca la placa superior.

Es útil dejar que la tira cuelgue un poco sobre el borde de la placa superior para que se pueda ajustar con una espátula para corregir cualquier cambio. Añada reactivos de polimerización al tampón de gel de resolución y viértalo en el casete de gel preparado con una pipeta serológica. Llene el casete de gel hasta aproximadamente dos centímetros por debajo de la tira de gel PAGE azul nativo extirpada para dejar espacio para la capa de apilamiento.

Luego, agregue 100 microlitros de butanol sobre la parte superior del gel vertido y espere 30 minutos para la polimerización de la capa de resolución antes de verter el butanol. A continuación, agregue los reactivos de polimerización a la solución de gel de apilamiento. Con una pipeta serológica, vierta la capa de apilamiento para llenar todo el espacio vacío restante en el casete de gel.

Incline el casete de gel a medida que se vierte la capa de apilamiento para que llene el espacio debajo de la tira de gel y las burbujas de aire no queden atrapadas. A medida que el tampón de gel apilable llena el espacio vacío debajo de la tira de gel, regrese gradualmente el casete de gel a una base nivelada. Continúe llenando el espacio vacío junto a la tira de gel extirpada con el tampón de gel apilable hasta que casi se desborde.

Luego, deje que la capa de apilamiento se polimerice durante 30 minutos. Después de que la capa de apilamiento se haya polimerizado, retire el casete de gel del aparato de vertido, enjuáguelo con agua destilada y ensamble el aparato de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Llene completamente la cámara interior con 1x búfer de ejecución SDS-PAGE.

A continuación, llene la cámara exterior hasta el nivel indicado por el fabricante. Cargue el espacio junto a la tira de gel extirpada con una escala de peso molecular o el estándar de proteína adecuado. Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y electroforese las muestras a 120 voltios.

Cuando el tinte Coomassie se escurra por el gel, deténgalo y desconecte la fuente de alimentación. Analice el gel utilizando métodos estándar de electrotransferencia y detección de proteínas basada en anticuerpos. La validación de multimer-PAGE se muestra aquí a través de immunoblot.

El complejo de kinesina capturado se escinde por diphyo-3-itol, lo que demuestra que los agregados de alto peso molecular se forman mediante la reticulación de sustituyentes más pequeños. En la imagen, los lisados cerebrales tratados con concentraciones crecientes de SDS o Triton aumentaron la detección de alfa-sinucleína monomérica mientras que disminuyeron la detección del oligómero soluble tetrómero. Aquí, se muestran los resultados representativos de multimer-PAGE utilizado para capturar complejos solubles en lisado de cerebro de rata.

Las proteínas se detectaron mediante inmunotransferencia. El peso monomérico esperado de cada proteína se muestra debajo de los carriles. De manera similar, aquí se muestra la captura de complejos unidos a membranas.

Multimer-PAGE ocasionalmente falla en capturar un complejo, como se muestra en el complejo respiratorio SDHA de dos manchas. Una discusión de las posibles explicaciones para esto se puede encontrar en el protocolo de texto. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas ocho horas si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la reticulación en gel de complejos de proteínas nativas seguida de una refundición y separación en gel por SDS-PAGE secundaria. No olvide que trabajar con acrilamida puede ser extremadamente peligroso y se debe usar equipo de protección personal mientras se lanza el gel. Siguiendo este procedimiento, los complejos estabilizados separados pueden eluirse o cortarse del gel y pueden analizarse por muchos medios, incluida la inmunodetección o la espectrometría de masas, según las necesidades del investigador.