Name: Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a capturar y analizar complejos proteicos nativos de lisados tisulares mediante electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. Este método estabiliza asociaciones proteicas lábiles para su identificación posterior.

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Con el apoyo de la DA034783 NIH / NIDA. Agradecemos a Bryan A. Killinger para la asistencia técnica con el multímero-página.

1. Preparación del tejido <ol><li> Preparar 10 ml de 4x tampón de muestra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ). NOTA: Esta solución madre se puede hacer de antemano y se almacena a 4 ° C. </li><li> Diluir 250! L de tampón de muestra 4x en 750! L dH 2 O que contiene 1x cóctel inhibidor de proteasa comercial. Vortex y se enfría en hielo. </li><li> Homogeneizar 20 mg de tejido diana en el 1 ml de 1x de hielo frío tampón de muestra BN-PAGE con 30 golpes de un homogeneizador Dounce limpio. NOTA: Para este experimento de demostración, el tejido diana es toda tejido cerebral de rata. Después de la homogeneización, las muestras pueden ser tratadas con detergente suave como el 2% de digitonina para solubilizar y permitir la electroforesis de proteínas de membrana. </li><li> Transferir el homogenado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y se centrifuga a 14.000 xg durante 30 min para sedimentar contenidos celulares insolubles. faetr centrifugación, se decanta el sobrenadante en un tubo limpio en hielo. </li><li> Siga las instrucciones del fabricante para medir la concentración de proteínas sobrenadante utilizando ácido bicinconínico (BCA) o ensayo de cuantificación de proteínas similar. </li><li> Si la muestra (s) de homogeneizado contiene detergente, añadir una cantidad de 5% de azul de Coomassie G-250 en solución acuosa suficiente para llevar la solución homogeneizado a 0,25% Coomassie. </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> Diluir 25 ml de 20x nativo azul (BN) Tampón de electroforesis de stock (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M de tricina, pH 6,8) en 475 ml dH 2 O que contiene 0,002% de azul de Coomassie para hacer 500 ml de tampón de ejecución 1x. <ol><li> Si las muestras contienen detergente, en lugar de hacer 250 ml de tampón de ejecución 1x que contiene 0,02% de Coomassie y otros 250 ml que contienen ninguno. </li></ol></li><li> tampón (s) Chill a 4 ° C. </li><li> Limpiar y montar un gel de poliacrilamida verter casete de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li&gt; Verter en gel de poliacrilamida BN (3% capa T de apilamiento, 6% T capa resolver) de acuerdo con una receta estándar 7, y colocar el peine bien. </li><li> Después de que los geles han polimerizado, enjuague el casete con dH 2 O y montar el aparato de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Retire el peine bien y llenar los pocillos con 1 x tampón de ejecución BN-PAGE. Evitar llenar toda la cámara interior con tampón hasta que las muestras se cargan. <ol><li> Si las muestras contienen detergente, llenar los pocillos con el tampón que contiene 0,02% de azul de Coomassie. NOTA: Realice los pasos 2.7 a 2.9 a 4 ° C. </li></ol></li><li> Utilizando puntas de carga de gel, una pipeta un volumen de homogeneizado que contiene 20 g de proteína en los pocillos deseados. Pipeta de un volumen equivalente de tampón de muestra 1x BN-PAGE en cualquier pocillos no utilizados. NOTA: Utilice la concentración de proteína determinada a partir del ensayo de BCA para calcular el volumen apropiado de homogeneizado para añadir alos pozos. </li><li> Después las muestras se cargan, llenar la cámara interior con tampón 1x BN-PAGE en marcha. Asegúrese de que el gel se sumergió por completo en tampón. A continuación, llenar la cámara exterior con tampón 1x funcionamiento hasta el nivel indicado por el fabricante. <ol><li> Si las muestras contienen detergente, llenar la cámara interior con el tampón 1x que contiene 0,02% de azul de Coomassie, y la cámara exterior con tampón de ejecución 1x libre de tinte. </li></ol></li><li> Conectar los electrodos a la fuente de alimentación, y a electroforesis las proteínas en el gel a 150 V hasta que la banda colorante avanza ~ 2 cm en la solución de capa. Parar y desconectar la fuente de alimentación. </li></ol> 3. El entrecruzamiento NOTA: Realice los pasos 3.1 a 3.6 a 4 ° C. <ol><li> Desmontar el aparato de electroforesis, y separar los cristales del casete de gel. Retirar y desechar la capa de apilamiento. </li><li> Corte cuidadosamente el gel justo por debajo del borde inferior de la frente de colorante. Tomarcuidado para hacer este corte tan lisa y recta posible, y luego desechar la pieza no utilizada de gel. Esto dejará una ~ 2 cm de ancho, franja horizontal de gel de poliacrilamida, que contendrá toda la proteína en la muestra de homogeneizado. </li><li> Recorte las porciones no utilizadas a lo largo de los bordes de la tira de gel. </li><li> Con cuidado, coloque la tira en 10 ml solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un pequeño recipiente, y mezclar suavemente por nutación durante 30 min para equilibrar. </li><li> Después de la equilibración, desechar y sustituir el PBS con otros 10 mL. Pipetear 500 l de 25 mM DSP disolvió en sulfóxido de dimetilo en la PBS, y continuar mezclando como anteriormente (etapa 3.4) durante 30 min. </li><li> Retirar la solución DSP. Añadir 10 ml de 0,375 M de tris (hidroximetil) aminometano clorhidrato (Tris-HCl), pH 8,8, que contienen 2% de dodecilsulfato sódico (SDS) para extinguir el DSP sin reaccionar. Continuar nutación durante 15 min. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li> Mientras tira de gel se temple, preparar SDS-PASoluciones de gel de GE acuerdo con métodos estándar 9. No añadir reactivos de polimerización. </li><li> Después de inactivar, devuelva la tira de gel ΒΝ a temperatura ambiente, y emitir la tira en una nueva casete de gel. <ol><li> Para ello, recoger cuidadosamente el gel y colocarlo en una placa espaciadora casete de gel limpia. </li><li> Orient la tira por lo que la parte inferior de la frente de colorante es la más cercana a la parte superior de nuevo casete (es decir, el lado que viajó más lejos durante BN-página debe estar más cerca de la parte superior de la nueva casete; la tira de gel debe ser volteado de su previa orientación). Véase la Figura 3. </li><li> Coloque la tira de tal manera que su borde superior se encuentra incluso con el lugar donde va a ser el borde superior de la placa de cubierta (es decir, será en la parte superior de la nueva gel). Asegúrese de que el frente de colorante es paralela a los bordes horizontales de la placa de vidrio. </li><li> Empuje un lado de la tira extirpado contra una de las paredes del espaciador, dejando espacio en tél otro lado para gel para ser vertido y un estándar de proteína o escalera para ser cargado. </li><li> Si el borde inferior de la tira de gel contiene ningún zonas poco uniformes, corte con cuidado a la basura. Si está presente, se atrapar burbujas durante gel vertido. </li><li> Una vez que la tira de gel se coloca correctamente, coloque la placa de cubierta sobre la placa espaciadora. Aplique una leve presión para expulsar las burbujas de aire atrapadas. </li><li> Continuar para montar el aparato de gel-vertido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Añadir los reactivos de polimerización para el tampón de gel de resolución, y se vierte en el casete de gel preparado, usando una pipeta serológica. Llenar el casete de gel a ~ 2 cm por debajo de la tira de gel BN-PAGE extirpado, para dejar espacio para el apilamiento de capas. </li><li> Añadir 100! L butanol sobre la parte superior del gel se vierte, y permitir que 30 min para la polimerización de la capa de la solución. Retirar el butanol. </li><li> Añadir los reactivos de polimerización para la solución de gel de apilado. El uso de un serologpipeta ical, se vierte la capa de apilamiento para llenar todo el espacio vacío que queda en el casete de gel. <ol><li> Incline la casete de gel como la capa de apilamiento se vierte de modo que llene el espacio por debajo de la tira de gel, y las burbujas de aire no están atrapados. </li><li> A medida que el tampón de gel de apilamiento llena el espacio vacío debajo de la tira de gel, gradualmente devolver el casete de gel a pie de nivel. </li><li> Continuar para llenar el espacio vacío al lado de la tira de gel escindido con el tampón de gel de apilamiento, hasta que casi se desborda. </li></ol></li><li> Permitir que la capa de apilamiento polimerizar durante 30 min. NOTA: Hacer 10x SDS-PAGE tampón de ejecución (tris 250 mM (hidroximetil) aminometano (TRIS), 1,9 M de glicina, 1% SDS), mientras que el gel se polimeriza. Esto también se puede hacer de antemano y se almacena a temperatura ambiente. </li><li> Diluir 50 ml de 10X tampón de SDS-PAGE corriente Stock en 450 ml dH 2 O para hacer tampón de trabajo 1x. </li><li> Después de la capa de apilamiento ha polimerizado, retire la casete de gel de la coladaaparato, enjuague con dH 2 O, y montar el aparato de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Llenar la cámara interior completamente con tampón de ejecución SDS-PAGE 1x, a continuación, llenar la cámara exterior hasta el nivel indicado por el fabricante. </li><li> Cargar el espacio al lado de la tira de gel escindido con una escalera de peso molecular o patrón de proteína apropiada. </li><li> Coloque los electrodos a la fuente de alimentación, y a electroforesis las muestras a 120 V. Cuando el colorante Coomassie se sale de la gel, parar y desconectar la fuente de alimentación. </li><li> Analizar el gel usando métodos estándar de electrotransferencia y detección de proteínas mediante la unión 10 de anticuerpo. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

interacciones proteína-proteína son importantes para cada tarea de los seres vivos llevan a cabo. Debido a esto, son objeto de un intenso escrutinio y la investigación. Multímero-página es un nuevo método para capturar, separar, y el análisis de una amplia gama de complejos de proteínas. Hemos demostrado anteriormente su aplicabilidad al estudio de oligimerization de la proteína α-sinucleína asociada a la enfermedad 11. Sin embargo, es extensible a muchos complejos de proteínas, como se demuestra...

<html> La función celular normal depende de interacciones proteína-proteína 1, 2. Como resultado, las enfermedades humanas son a menudo marcadas por las perturbaciones en el montaje y comportamiento de varios complejos de proteínas 3. La capacidad de caracterizar tales interacciones es por lo tanto crítico. medios actuales de detección de estas interacciones requieren la purificación de proteínas diana, a menudo seguidas por desplegable de sus socios que interactúan. Convencionales de purificación se lleva a cabo por centrifugación diferencial, precipitación y / o cromatografía 4. Estos métodos son mucho tiempo, deben ser alterados para cada proteína diana, y a menudo resultan en bajos rendimientos. Métodos de purificación modernos implican la fusión de etiquetas peptídicas a proteínas diana, seguido por inmunoprecipitación o extracción en columnas cargadas con perlas unidas a una molécula de captura 5,&quot;&gt; 6. Si bien esto es extensible a muchas proteínas, se requiere modificación de la secuencia de la diana, potencialmente resultando en construcciones que difieren en afinidad por sus parejas de unión habituales. La delicada naturaleza de algunas interacciones proteína-proteína significa este método puede no ser aplicable a muchos escenarios. Además, las pull-down ensayos usados ​​para mapear las interacciones proteína-proteína pueden no capturar una imagen precisa celular, debido a los grados de libertad restringidos y los niveles no nativos de la proteína cebo. Idealmente, los complejos de proteínas podrían ser detectados en sus estados nativos, sin la necesidad de purificación o pull-down. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) se desarrolló como una alternativa menos desnaturalizante a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), y permite la separación de algunas proteínas y complejos de muestras biológicas 7. Sin embargo, las proteínas en BN-PAGE separado basado en un larnúmero ge de variables, incluyendo el tamaño, carga, estructura tridimensional, y la asociación con otras moléculas. Las interacciones de estos factores a menudo resultan en co-separación de proteínas, la formación de agregados, y una pobre resolución banda de proteína. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo de dos dimensiones resuelve algunos, pero no todos, de estos problemas 8. Para evitar las complicaciones asociadas con la separación nativa, algunos autores utilizan reactivos de amina reactiva de reticulación, tales como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar complejos de proteínas en lisados de tejido 4. Estos lisados ​​tratados a continuación, se pueden desnaturalizar y se separaron por SDS-PAGE, mientras que preserva el tamaño nativo y maquillaje de complejos de proteínas. Sin embargo, ya que los reactivos de reticulación reaccionan basa en la proximidad de una molécula a otra, y las proteínas en los lisados ​​de tejido tienen muchos grados de libertad y estocásticamente puede interactuar, cruz fondo no específica-linking puede ser alto, especialmente en muestras concentradas. Esto puede conducir a resultados difíciles de interpretar. Aquí, demostramos el uso de un método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominado electroforesis en gel de poliacrilamida-multímero (multímero-PAGE), para separar y detectar los conjuntos de proteínas en mezclas complejas. Inicialmente, lisado de células se suspende en gel de poliacrilamida a través de BN-PAGE. El gel que contiene lisado se hace reaccionar luego con el DSP reactivo de reticulación. Pseudo-inmovilizado y ligeramente separadas en el gel, las proteínas son mucho menos propensos a reaccionar de manera no específica, lo que significa reactividad fondo reticulante se reduce. Después de la reticulación, las bandas de gel se extirpan y se separó a través de SDS-PAGE. El gel resultante se puede analizar entonces por cualquier medio típicamente asociados con electroforesis en gel de poliacrilamida. Este método permite la separación y la detección de complejos de proteínas nativas en lisado de tejido sin modificar, sin la necesidad de purificación adicional o pull-downorte.

<table><tbody><tr><td><fuerte>químicos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&épsilon;-Ácido aminocaproico</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>tóxico.</td></tr><tr><td>Acrilamida/bisacrilamida 37,5:1 (solución madre al 40%T)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Tóxico.</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti conejo IgG-HRP de cabra</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de ácido bicinconínico</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Kit de sustrato de quimioluminiscencia</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie azul G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Tóxico.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiobis(succinimidilpropionato)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Leche descremada</td><td>en polvo LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel</td> <td>de inhibidores de proteasa HaltThermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>Para valoración. Cáustico.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>Para la activación de la membrana de PVDF. Nocivo.</td></tr><tr><td>Anti &alfa;-sinucleína IgG monoclonal de conejo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-metilenebisacrilamida</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Tóxico.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de transferencia de fluoruro de polivinilideno</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>SDS solución (10% p/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (tampón de 0,5 M, pH 6,8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (tampón de 1,5 M, pH 8,8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 lector de microplacas</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Microfuge 22R</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL homogeneizador</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>onzas Mezclador de vórtice</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tejidos ultrasónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multímero-page: un método para capturar y proteína resolver complejos en muestras biológicas

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Hay muchos métodos bien desarrollados para la purificación y el estudio de proteínas individuales y péptidos. Sin embargo, la mayoría de las funciones celulares se llevan a cabo por las redes de interacción complejos de proteínas, que son a menudo difíciles de investigar debido a que su unión es no covalente y fácilmente perturbado por técnicas de purificación. Este trabajo describe un método de estabilización y separación de los complejos de proteínas nativas a partir de tejido no modificado usando electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tejido se carga en un gel de poliacrilamida azul-nativo no desnaturalizante, a continuación, se aplica una corriente eléctrica hasta que la proteína migra una corta distancia en el gel. La tira de gel que contiene la proteína migrado después se escinde y se incubó con los ditiobis de amina reactiva reticulantes reactivos (succinimidil propionato), que estabiliza covalentemente complejos de proteínas. La tira de gel que contiene complejos reticulados se moldea a continuación en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, y tél complejos se separan por completo. El método se basa en técnicas y materiales familiares para la mayoría de los biólogos moleculares, lo que significa que es barato y fácil de aprender. A pesar de que está limitado en su capacidad para separar adecuadamente los complejos extremadamente grandes, y no ha sido universalmente exitosa, el método fue capaz de capturar una amplia variedad de complejos bien estudiados, y es probable aplicable a muchos sistemas de interés.

En este experimento de demostración, multímero-PAGE se realizó en toda lisado de cerebro de rata. Las proteínas resultantes separados se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF), y después se sondaron con anticuerpos contra las proteínas que se sabe que forman complejos. La figura 1 muestra una validación del protocolo por dos medios. En primer lugar, se demuestra que las proteínas reticuladas son escindibles mediante la adición de un agente reduc...

Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).

Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

El objetivo general de este protocolo es permitir a los investigadores capturar, separar y analizar complejos proteicos nativos extraídos de lisados tisulares mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Este método puede ayudar a los investigadores que estudian proteínas porque es capaz de estabilizar asociaciones proteicas normalmente lábiles en condiciones cercanas a las nativas, lo que permite su identificación y posterior análisis. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza métodos biológicos comunes, por lo que es ampliamente aplicable y puede adaptarse a los objetivos de cada investigador.Para comenzar este procedimiento, prepárese para la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul según se describe en el protocolo escrito. Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y realice la electroforesis de las proteínas en el gel a 150 voltios hasta que la banda de colorante avance aproximadamente dos centímetros dentro de la capa de resolución. En este punto, detenga y desconecte la fuente de alimentación.Después de desarmar el aparato de electroforesis, separen los paneles de vidrio de la cassette de gel. Retire y deseche la capa de concentración. Corte cuidadosamente el gel justo debajo del borde inferior del frente de colorante, teniendo cuidado de que este corte sea lo más suave y recto posible.Luego, deseche el trozo de gel no utilizado. Recorte las porciones no utilizadas a lo largo de los bordes de la tira de gel. Coloque cuidadosamente la tira en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato en un recipiente pequeño y mezcle suavemente mediante agitación durante 30 minutos para equilibrar.Tras la equilibración, deseche y reemplace el PBS con otros 10 mililitros. Pipetee 500 microlitros de DSP 25 milimolar disuelto en dimetilsulfóxido en el PBS y continúe mezclando como antes durante 30 minutos. Después de 30 minutos, vierta la solución de DSP.Añada 10 mililitros de HCl 0,375 M, pH 8,8, que contenga 2% de dodecilsulfato de sodio para inactivar el DSP no reaccionado. Continúe la incubación durante 15 minutos. Mientras la tira de gel se está inactivando, prepare soluciones de gel SDS-PAGE según métodos estándar.No agregue los reactantes de polimerización. Después de la inhibición, devuelva la tira de gel nativo azul a temperatura ambiente y coloque la tira en una nueva cubeta de gel. Para hacer esto, levante cuidadosamente el gel y colóquelo sobre una placa separadora limpia de la cubeta de gel.Oriente la tira de modo que esté girada con respecto a su orientación anterior y el borde inferior del frente de colorante esté más cerca de la parte superior del nuevo casete. Coloque la tira de manera que su borde superior quede alineado con la posición donde estará el borde superior de la placa de cubierta. Asegúrese de que el frente de colorante sea paralelo a los bordes horizontales de la placa de vidrio.Presione un lado de la tira recortada contra una de las paredes espaciadoras, dejando espacio en el otro lado para verter el gel y cargar un patrón proteico o escalera. Si el borde inferior de la tira de gel presenta áreas irregulares o dentadas, córtelas cuidadosamente. Una vez que la tira de gel esté correctamente posicionada, coloque la placa de cubierta sobre la placa espaciadora.Aplique presión suave para expulsar cualquier burbuja de aire atrapada. Continúe ensamblando el aparato para verter geles según las instrucciones del fabricante. La tira de gel a veces se desplaza cuando se coloca la placa superior.Es útil dejar que la tira sobresalga un poco por el borde de la placa superior para poder ajustarla con una espátula y corregir cualquier desplazamiento. Añada los reactivos de polimerización al tampón del gel de resolución y viértalos en la cassette de gel preparada utilizando una pipeta serológica. Llene la cassette de gel hasta aproximadamente dos centímetros por debajo de la tira de gel de electroforesis nativa azul recortada para dejar espacio para la capa de concentración.Luego, agregue 100 microlitros de butanol sobre la parte superior del gel vertido y deje 30 minutos para la polimerización de la capa de resolución antes de verter el butanol. A continuación, agregue los reactivos de polimerización a la solución del gel de concentración. Utilizando una pipeta serológica, vierta la capa de concentración para llenar todo el espacio vacío restante en la cassette del gel.Incline el cassette del gel al verter la capa de apilamiento para que llene el espacio debajo de la tira de gel y no queden atrapadas burbujas de aire. A medida que el tampón del gel de apilamiento llena el espacio vacío debajo de la tira de gel, devuelva gradualmente el cassette del gel a una posición nivelada. Continúe llenando el espacio adyacente a la tira de gel seccionada con el tampón del gel de apilamiento hasta que casi desborde.Luego, permita que la capa de apilamiento polimerice durante 30 minutos. Después de que la capa de apilamiento haya polimerizado, retire el cassette del gel del aparato de vertido, enjuáguelo con agua destilada y arme el aparato de electroforesis según las instrucciones del fabricante. Llene completamente la cámara interna con tampón de electroforesis 1x SDS-PAGE.Luego, llene la cámara externa hasta el nivel indicado por el fabricante. Cargue el espacio junto a la tira de gel extraída con una escala de peso molecular o el patrón de proteína adecuado. Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y realice la electroforesis de las muestras a 120 voltios.Cuando el colorante Coomassie salga del gel, detenga la electroforesis y desconecte la fuente de alimentación. Analice el gel utilizando métodos estándar de electrotransferencia y detección de proteínas con anticuerpos. La validación de la electroforesis en gel de multímeros se muestra aquí mediante inmunotransferencia.El complejo de cinasina capturado es escindido por difio-3-itol, lo que demuestra que los agregados de alto peso molecular se forman mediante la unión cruzada de sustituyentes más pequeños. Aquí se muestra que lisados cerebrales tratados con concentraciones crecientes de SDS o Triton incrementaron la detección de alfa-sinucleína monomérica mientras reducían la detección del tetrámero oligómero soluble. A continuación, se presentan resultados representativos de multimer-PAGE utilizados para capturar complejos solubles en lisado cerebral de rata.Las proteínas se detectaron mediante inmunotransferencia. El peso monomérico esperado de cada proteína se muestra debajo de las bandas. De manera similar, aquí se muestra la captura de complejos unidos a la membrana.La electroforesis en gel de multímeros (Multimer-PAGE) a veces no logra captar un complejo, como se muestra en la doble tinción del complejo respiratorio SDHA. En el protocolo escrito se puede encontrar una discusión sobre posibles explicaciones para este fenómeno. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente ocho horas si se lleva a cabo correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la reticulación en gel de complejos proteicos nativos seguida de la recolocación del gel y separación mediante SDS-PAGE secundaria. No olvide que trabajar con acrilamida puede ser extremadamente peligroso y se debe usar equipo de protección personal mientras se coloca el gel. Tras este procedimiento, los complejos estabilizados separados pueden eluirse o cortarse del gel y pueden analizarse de diversas maneras, incluyendo inmunodetección o espectrometría de masas, según las necesidades del investigador.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La célula permeable reticulante DSP [ditiobis (propionato de succinimidilo)] estabiliza interacciones transitoria e...

El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

En este video, se describe la caracterización de los complejos multiproteicos (PSM) por el azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (BN-PAGE). En una primera dimensión, se dializan lisados ​​celulares están separados por BN-PAGE para identificar PSM individual. En una segunda dimensión SDS-PAGE, PSM de interés se subdividen para analizar sus componentes por inmunotransferencia.

Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

Este video describe PAGE multimérico para separar complejos de proteínas nativas de homogeneizados de tejidos. La técnica es un híbrido de las técnicas blue native-PAGE y SDS-PAGE. Los complejos separados pueden caracterizarse y estudiarse por su papel en el funcionamiento celular.

Multimer-PAGE para separar complejos de proteínas nativas: una técnica de separación híbrida que consiste en Blue Native-PAGE y SDS-PAGE para separar proteínas multiméricas intactas del lisado de tejidos.

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Este manuscrito describe el protocolo para la purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP). Este novedoso método facilita el aislamiento específico y la caracterización proteómica aguas abajo de cualquier dos proteínas obran recíprocamente, mientras que excluyendo un complejado proteínas individuales como complejos formados con competidores socios de enlace.

Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

Las interacciones proteína-proteína y proteína-metabolito son cruciales para todas las funciones celulares. Adjunto, describimos un protocolo que permite el análisis paralelo de estas interacciones con una proteína de elección. Nuestro protocolo fue optimizado para cultivos de células vegetales y combina la purificación de la afinidad con la proteína basada en espectrometría de masa y detección de metabolitos.

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Se presenta un protocolo BN-MS crioscrioso versátil que utiliza un microtome para perfiles de complexomo de alta resolución.

Perfiles de Complexome de Alta Resolución por Cryoslicing BN-MS Analysis

Este protocolo combina la fotometría de masas con un novedoso sistema de microfluídica para investigar las interacciones proteína-proteína de baja afinidad. Este enfoque se basa en la dilución rápida de complejos altamente concentrados en solución, lo que permite mediciones de baja afinidad y amplía la aplicabilidad de la fotometría masiva.

Análisis de la formación de complejos proteicos a concentraciones micromolares mediante el acoplamiento de microfluídica con fotometría de masas

Aprenda a capturar y analizar complejos proteicos nativos de lisados tisulares mediante electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. Este método estabiliza asociaciones proteicas lábiles para su identificación posterior.

Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

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