Name: Disección, de exploración y morfométricos microTC Los análisis de la Baculum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Aprende análisis morfométrico computacional del baculum de ratón mediante disección y microTC. Este método cuantifica variación de tamaño y forma en 3D usando semilandmarks para estructuras sin puntos de referencia definidos.

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Tim Daley y Andrew Smith proporcionan muchas discusiones computacionales útiles durante los primeros días; Tim Daley escribió el programa necesario para rotate_translate_cylindrical Protocolo 5. Se proporcionaron recursos computacionales por el Cluster de Computación de Alto Rendimiento de la Universidad del Sur de California. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención # GM098536 (MDD).

Todos los procedimientos y el personal fueron aprobados por la Universidad de Instituto del Sur de California para el Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC), protocolo # 11394. 1. La disección y preparación Baculum <ol><li> La eutanasia a un ratón macho sexualmente maduros a través de dióxido de carbono durante la exposición, de acuerdo con los protocolos establecidos por el Comité Institucional Animal relevante Cuidado y Uso (IACUC). </li><li> Colocar el animal en posición supina, y prolongar el pene mediante la aplicación de presión con los pulgares lateral a la apertura del prepucio. </li><li> Una vez que se prolonga el pene, extender el tejido a través del prepucio medida de lo posible. </li><li> Con unas tijeras, cortar los extremos proximal del cuerpo del pene para el glande del pene donde reside el báculo. </li><li> Transferir el pene disecados a un tubo de 1,7 ml y añadir agua del grifo 200 l. Asegúrese de que el pene está completamente sumergido en el líquido. </li><li> Incubar el tejido en agua a ~ 50 ° C durante 3-5 días. </li><li&gt; Después de la incubación adecuada, retire el tejido circundante desde el báculo, el uso de fórceps bajo un microscopio de disección. chorro suavemente 70% de etanol para empujar tejido restante y limpiar el hueso. </li><li> Coloque el báculo diseccionado en un nuevo tubo de microcentrífuga con la tapa abierta. Deje la tapa abierta O / N se seque hueso. </li></ol> Escaneo 2. microTC <ol><li> Presione un soporte de escaneado cilíndrica microCT en un ladrillo de espuma de floristería para crear un cilindro de espuma de floristería. </li><li> Extraer el cilindro de espuma de floristería y cortar rodajas ~ 2-5 cm de espesor. </li><li> Empuje Bacula seca en la espuma de floristería, alrededor de la periferia de una división individual para minimizar la interferencia durante el escaneado. La orientación precisa de los huesos debe hacer notar que permite la correcta identificación de las muestras individuales en el Protocolo 4. </li><li> Con cuidado, coloque la rebanada con los huesos incrustados en el soporte microCT. </li><li> Adquirir las exploraciones microCT. En el caso de bacula ratón 14 </sup&gt;, Se utilizó un escáner uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Suiza) en el Centro de Imagen USC molecular bajo los siguientes parámetros: 90 kVp, 155 mu, 0,5 mm de Al filtro, 750 proyecciones por 180 (360 de cobertura), tiempo de exposición de 500 ms, y el tamaño del voxel de 15,5 mm. </li></ol> 3. Procesamiento microTC: Conversión de una pila .dcm a un archivo individual .xyz NOTA: Cada escaneo microCT produce una pila de .dcm, o &quot;DICOM&quot;, archivos que representan finas imágenes tomadas a través del objeto. Toda la geometría computacional aguas abajo requiere archivos .XYZ planas, que es simplemente un archivo de texto que contiene cuatro columnas - los ejes X, Y, y Z coordenadas de cada píxel, y la intensidad del píxel, que van desde -5000 (negro) a 5000 (blanco). Un umbral de píxeles por encima de 3000 generalmente funciona bien como un umbral para definir huesos. <ol><li> Instalar Python (www.python.org) y los módulos de Python COMANDOS, DICOM, PYLAB, SYS, y NumPy. </li><li> Abrir &quot;01_process_dicom.py &quot;{} Figshare con cualquier editor de texto. En la sección Variables, camino de cambio, los umbrales de pixel, y de directorios según sea necesario. </li><li> Ejecutar &quot;01_process_dicom.py pitón&quot;. El progreso se imprimen en la pantalla. Dentro de cada directorio llamado en el paso 3.2, un nuevo archivo se hace nombrado; por ejemplo, directory_name.PT3000.xyz, donde PT3000 indica el umbral de pixel indica en el paso 3.2. </li></ol> 4. procesamiento microTC: La segmentación de salida de muestra individual .xyz Archivos <ol><li> Instalar R (https://www.r-project.org/) con el RGL biblioteca. </li><li> Abra el archivo &#39;02_segment_dicoms.r&#39; {} Figshare con cualquier editor de texto. En la sección Variables, cambiar el nombre de la ruta para que apunte al archivo creado en el Protocolo .xyz 3 anterior. </li><li> Desde dentro de R, ejecute la &quot;fuente ( &#39;02_segment_dicoms.r&#39;)&quot; comando (sin las comillas). </li><li> Después de que la imagen tridimensional del archivo .xyz creado en el Protocolo 3 aparece, introduzca la number de los especímenes en el archivo general .xyz. A continuación, etiquetar y seleccionar los puntos de cada muestra utilizando las funciones de desplazamiento y zoom. NOTA: En el fondo, se harán archivos .XYZ separados para cada muestra. Estos aparecen en un directorio llamado, por ejemplo, XYZ_FILES_PT3000, donde PT3000 indica el umbral de píxeles utilizado. </li></ol> 5. &quot;Alineación&quot; Espécimen .xyz Archivos para Común Coordenadas. <ol><li> Abra la secuencia de comandos &quot;03_transform.py&quot; Python {} Figshare, lo que requiere el módulo adicional mattdean_modules.py {} Figshare, así como dos aplicaciones autónomas: &quot;rotate_translate_cylindrical&quot; (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) y &quot;qconvex&quot; (www.qhull.org/html/qconvex.htm) que son utilizados por esta secuencia de comandos. </li><li> En la sección Variables, identificar los nombres completos de las rutas de mattdean_modules.py, rotate_path y qconvex_dir. Además, identificar la ruta completa al directorio que contiene el individuo .xyz archivos creados en el paso 4. </li><li> 03_transform.py correr, lo que crea un nuevo archivo por espécimen con el sufijo .TRANSFORMED.xyz. </li></ol> 6. &quot;rebana&quot; Espécimen Alineados .XYZ archivos para identificar Semi-hitos. <ol><li> Abrir y ejecutar la secuencia de comandos de Python &quot;04_identify_landmarks.py&quot; {} Figshare. En la sección Variables, identificar los nombres de ruta completa al directorio que contiene los archivos .TRANSFORMED.xyz. Este script identifica 802 semirremolques de puntos de referencia que pueden utilizarse para cuantificar el tamaño y la forma de la estructura. </li></ol>

<ol><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.anthro.34.081804.120613">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li>
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<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , 2nd, Elsevier. (2012).</li>
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<li>Dines, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+selection+targets+cetacean+pelvic+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Sexual selection targets cetacean pelvic bones.</a> Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).</li>
<li>Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/2041-210X.12035/abstract">geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data.</a> Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los pasos críticos en el protocolo anterior son: 1) la disección de la Bacula, 2) la recopilación de las imágenes microCT, 3) convertir la salida microCT en un archivo plano de coordenadas XYZ, 4) la segmentación de salir del punto de enturbiamiento de cada espécimen, 5) la transformación de cada muestra a un normalizado sistema de coordenadas, y 6) la definición de semi-hitos. Estos pasos se modifican fácilmente para adaptarse a diferentes objetos. Estos métodos probable se pueden aplicar a...

El campo de la morfometría incluye una diversidad de métodos para cuantificar el tamaño y la forma de la forma biológica, un paso fundamental en la investigación científica 1, 2, 3, 4, 5, 6. Tradicionalmente, el análisis estadístico de tamaño y forma comienza con la identificación de puntos de referencia en una estructura biológica, y luego la medición de distancias lineales, ángulos y proporciones, que podrían ser analizados en un marco multivariado. Morfometría geométrica basada en el punto de referencia es un enfoque que mantiene la posición espacial de los puntos de referencia, la preservación de la información geométrica de la colección de datos a través de análisis y visualización 5. Análisis de Procrustes Generalizado (GPA) se puede aplicar para eliminar la variación en la localización, escala y rotación de las señales para producir una alineación entre los especímenes que Minimizes sus diferencias al cuadrado - lo que queda es la forma disimilitud 7. Un concepto importante de cualquier análisis morfométricos es homología, o la idea de que uno puede identificar con fiabilidad puntos de referencia que representan características biológicamente significativas y discretos que se corresponden entre muestras o estructuras. Por ejemplo, cráneos humanos tienen procesos homólogos, agujeros, suturas y conductos que pueden permitir a los análisis morfométricos. Desafortunadamente, la identificación de puntos de referencia correspondientes es difícil a través de muchas estructuras biológicas, especialmente aquellos con superficies lisas o curvas 8, 9, 10. Nos acercamos a este problema a continuación, utilizando la geometría computacional. El flujo de trabajo general es generar una exploración de tres dimensiones del objeto que se puede representar como una nube de puntos, y luego girar y transformar ese punto de turbidez para que todo specimens están orientadas en un sistema de coordenadas común. Luego definimos matemáticamente semi-hitos de regiones específicas del objeto. Discretas semi-hitos colocados en dichas regiones son biológicamente arbitraria 11. La realización de GPA y los análisis estadísticos posteriores puede producir efectos indeseables 8, 12 porque hitos colocados de manera arbitraria pueden no ser biológicamente homóloga. Por lo tanto, permitimos que estos puntos de referencia para semirremolques matemáticamente &quot;slide&quot;. Este procedimiento minimiza la diferencia de potencial entre las estructuras. Como se ha argumentado en otras partes del algoritmo de deslizamiento se utiliza aquí es apropiada para cuantificar regiones anatómicas similares que carecen de puntos de referencia de fácil identificación 3, 6, 8, 10, 11, 12 correspondiente. Estos métodos tienen su limitations 13, sino que debe ser adaptable a los objetos de diferente tamaño y forma. A continuación, se expone cómo se aplicó este método en un estudio reciente del báculo del ratón 14, un hueso en el pene que se ha perdido y ganado varias veces durante la evolución de los mamíferos independientes 15. Se discute la disección y preparación de un hueso específico, el báculo (Protocolo 1), la generación de imágenes microCT (Protocolo 2), y la conversión de estas imágenes a un formato que permite a toda la geometría computacional aguas abajo (Protocolos 3 y 4). Después de estos pasos, cada muestra está representada por ~ 100K coordenadas xyz. luego caminamos a través de una serie de transformaciones que se alinean de manera efectiva todos los especímenes en una orientación común (Protocolo 5), para definir puntos de referencia semirremolques de especímenes alineados (Protocolo 6). Protocolos 1-4 deben ser similares independientemente de que se está analizando el objeto. Protocolo 5 y 6 son spe Protocoloficamente diseñado para un báculo, pero es nuestra esperanza de que al detallar estos pasos, los investigadores pueden imaginar modificaciones que serían relevantes para su objeto de interés. Por ejemplo, se aplicaron modificaciones de estos métodos para estudiar las ballenas huesos de la pelvis y los huesos de las costillas 16.

<table><tbody><tr><td>Tijeras de disección</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>La mayoría de los tamaños deberían funcionar</td></tr><tr><td>Pinza de disección, punta fina, curvada</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>Se diluye al 70% para disecciones</td></tr><tr><td>Espuma Floral</td><td>Venta al por mayor Floral</td><td>6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>Escáner uCT50&nbsp;</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, Suiza</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

disección, de exploración y morfométricos microtc los análisis de la baculum

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

morfometría moderna proporciona potentes métodos para cuantificar la variación del tamaño y forma. Un requisito básico es una lista de coordenadas que definen puntos de referencia; Sin embargo, tales coordenadas deben representar estructuras homólogas en todos los especímenes. Mientras que muchos objetos biológicos consisten en puntos de referencia de fácil identificación para satisfacer la hipótesis de homología, muchos carecen de este tipo de estructuras. Una posible solución es matemáticamente lugar semi-hitos en un objeto que representa la misma región morfológica a través de muestras. A continuación, se expone una tubería recientemente desarrollado para definir matemáticamente semi-hitos del báculo del ratón (hueso del pene). Nuestros métodos deberían ser aplicables a una amplia gama de objetos.

Las coordenadas XYZ de los semi-hitos producidos en el Protocolo nº 6 se pueden importar directamente en cualquier análisis de morfometría geométrica basada en el hito 17. El cálculo de tuberías anteriormente se ha aplicado para estudiar bacula ratón 14, así como de la pelvis y huesos de las costillas de ballenas 16. Más detalles sobre la definición de cálculo de semi-hitos se presentan aquí, en un intento de ayudar ...

Muchas estructuras biológicas carecen de puntos de referencia fácilmente definibles, por lo que es difícil aplicar métodos morfométricos modernas. Aquí se ilustran métodos para estudiar la baculum ratón (un hueso en el pene), incluyendo la disección y el escaneo microCT, seguido de métodos computacionales para definir semirremolques puntos de referencia que se utilizan para cuantificar el tamaño y la forma de la variación.

Disección, de exploración y morfométricos microTC Los análisis de la Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

El objetivo general de esta disección y análisis morfométrico es ilustrar la solidez de nuestra metodología morfométrica para estudiar estructuras con formas complejas, como el hueso del pene del ratón. Tuvimos la idea inicial de este estudio cuando nos dimos cuenta de que los métodos existentes para medir la variación del baculo, como tomar dimensiones de longitud y anchura, perdían toda la información sobre la curvatura y la complejidad de la forma; por ello, ideamos este método para cuantificar la variación en tamaño y forma de cualquier hueso o estructura de interés en tres dimensiones. La principal ventaja de esta técnica es que aplica morfometría moderna a estructuras sin puntos de referencia anatómicos.Esto debería impulsar el campo al proporcionar mediciones mejoradas y reproducibles de estructuras complejas. Coloque un ratón macho sexualmente maduro, previamente sacrificado, en posición supina y protruya el pene aplicando presión con el pulgar lateralmente a la abertura prepucial. Una vez que el pene emerja, extienda el tejido a través del prepucio tanto como sea posible.A continuación, utilizando tijeras, corte el cuerpo del pene proximal a la glándula del pene donde se encuentra el pene óseo, separando así el pene. Luego, sumerja completamente el pene en aproximadamente 200 microlitros de agua del grifo en un tubo de microcentrifugado. Para ablandar el tejido, incúbelo a unos 50 grados celsius durante tres a cinco días.El ablandamiento del tejido reduce la posibilidad de que el hueso se rompa durante la extracción. Después de la incubación, utilice un microscopio de disección y pinzas para eliminar la mayor parte del tejido que rodea el baculum. Tras la disección gruesa, rocíe suavemente etanol al 70 por ciento para desprender el tejido restante y limpiar el hueso.Luego, coloque el baculum diseccionado en un nuevo tubo de microcentrifugado y deje que el hueso se seque a temperatura ambiente con la tapa abierta. Para comenzar, prepare el material en el que se colocará el hueso. Presione un soporte cilíndrico para escáner CT en un bloque de espuma para floristería.Luego, extraiga el cilindro resultante de espuma y corte rebanadas de espuma de entre dos y cinco centímetros de grosor. Ahora inserte de 10 a 15 bacula secos en la espuma de floristería alrededor del perímetro de una rebanada individual para minimizar interferencias durante el escaneo. Tenga en cuenta la orientación precisa del hueso para su identificación futura.A continuación, coloque cuidadosamente los huesos envueltos en espuma dentro del portamuestras de tomografía computarizada micro-CT y coloque el portamuestras en un escáner micro-CT 50. Configure el escáner micro-CT 50 como sigue: utilice 90 kilovolt pascals, un tamaño de vóxel de 155 angstroms, un filtro de aluminio de 5 mililitros, 750 proyecciones por 180 grados y un tiempo de exposición de 500 milisegundos.Luego proceda a escanear la muestra. Los huesos de baculum fueron diseccionados, preparados y escaneados utilizando el protocolo descrito. Muchos huesos pueden colocarse en un solo escaneo de tomografía computarizada.Las imágenes se procesaron posteriormente mediante geometría computacional, como se describe en el protocolo escrito. Este proceso de imagen debería ser aplicable al estudio de una amplia variedad de huesos y otros sujetos de interés. El análisis proporciona información detallada sobre las características anatómicas del objeto y es altamente automatizado.Este proceso solo requirió aproximadamente 10 ajustes manuales al analizar 369 baculos. Lo interesante es que nuestros métodos podrían aplicarse a una gran variedad de estructuras complejas. Estos métodos nos permitieron cuantificar el tamaño y la forma del baculum en tres dimensiones.

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