El uso de condicionamiento de clásico de Eyeblink rastro para evaluar disfunción hipocampal en un modelo de rata de trastornos del espectro alcohólico Fetal

El objetivo general de este experimento es demostrar cómo el uso del condicionamiento clásico del parpadeo rastreado, una forma de aprendizaje asociativo, puede ayudar a detectar disfunción del hipocampo en un modelo de rata de los trastornos del espectro alcohólico fetal. Las crías de rata neonatales son expuestas a una dosis elevada de alcohol, con una concentración del 11,9 % volumen/volumen de alcohol, administrada de forma similar a un atracón. Durante el período equivalente al tercer trimestre en humanos en lo que respecta al crecimiento cerebral.

Este patrón de exposición al alcohol y dosis son factores clave para producir déficits cerebrales a lo largo del período de vida, imitando casos humanos de TEAF. Una región cerebral importante que se ve comprometida por la exposición temprana al alcohol es el hipocampo. Después de que las ratas crecen hasta la edad adulta, se examina la disfunción del hipocampo mediante el condicionamiento clásico del parpadeo con intervalo de traza.

Esta es una forma de orden superior de aprendizaje asociativo que depende de la integridad del hipocampo. Durante los días posnatales cuatro a nueve, las crías de rata se pesan cada mañana y se registran sus pesos. Los volúmenes de alimentación se obtienen entonces de una tabla preimpresa basada en el peso corporal.

Se administra una solución de alcohol al 11,9 % en volumen a ratones lactantes en dos tomas separadas por dos horas. La dosis diaria total de alcohol es de 5,25 gramos por kilogramo por día. Este paradigma de exposición aguda administra 0278 mililitros de alcohol por gramo de peso corporal por toma en solución de leche.

Extraiga la leche que contiene alcohol utilizando una jeringa estéril de un mililitro. Luego, expulse la solución en exceso para obtener la cantidad exacta necesaria. Sumerja la punta del tubo PE-10 en aceite de maíz fresco.

Esto facilita la inserción. Mida la longitud del tubo de PE-10 desde la boca del cachorro hasta su estómago. Si es necesario, ajuste el tapón de PE-50 para que actúe como una guía visual para el punto de detención.

Inserte cuidadosamente el tubo PE-10 en la boca del cachorro. Normalmente encontrará cierta resistencia cuando la punta llegue a la garganta. Manipule el tubo hasta que la punta se doble hacia la entrada del esófago.

Trate de evitar que el tubo se deslice hacia atrás, ya que puede estar resbaladizo con el aceite. Continúe hacia abajo por su esófago y, cuando la punta pase el esfínter gastroesofágico, entrará entonces en su estómago. Deténgase en este punto, estabilice la bomba y administre la solución.

Esto debe hacerse a un ritmo lento. Retire cuidadosamente el tubo PE-10 y examine al cachorro en busca de reflujo de solución, sangre o lesión física. Reemplace al cachorro con sus compañeros de camada si se encuentra bien.

Consulte el protocolo escrito y la lista de materiales para conocer los instrumentos específicos utilizados en el procedimiento de cirugía de párpado. Esterilice el campo quirúrgico con un desinfectante aprobado y autoclave todos los instrumentos y suministros quirúrgicos con anticipación. Después de inducir la anestesia adecuada en la rata con isoflurano, afeite su cabeza utilizando una máquina para recortar el pelaje, exponiendo una cantidad suficiente de piel para el sitio de incisión y el párpado izquierdo.

Su piel se esteriliza realizando tres fricciones alternadas con alcohol isopropílico al 70 % y povidona yodo. Siga el procedimiento estándar para asegurar la rata al aparato estereotáxico con las barras para las orejas. Proceda con la cirugía cuando la rata presente un plano anestésico adecuado.

Utilice la hoja del bisturí para realizar una incisión anteroposterior en la línea media. Esta incisión debe exponer una zona suficiente anterior a los ojos y ligeramente posterior a la línea lambda sutural. Utilice la hoja del bisturí para raspar cuidadosamente el periostio situado encima del cráneo, teniendo cuidado de no provocar un sangrado excesivo.

Elimine el exceso de tejido conectivo y sangre con un hisopo de algodón y enjuague el área con solución salina estéril entre cada raspado. Perfore un orificio comenzando directamente detrás de la sutura coronal en un hueso parietal. Retire cualquier sangre y restos óseos con un hisopo de algodón.

Utilice pinzas de punta para sujetar un tornillo de 0 80. Utilice un destornillador de joyero para fijar el tornillo al orificio, apretándolo lo suficiente sin dañar el tejido cortical cerebral, generalmente de tres a cuatro vueltas completas. Siga el mismo procedimiento para asegurar los tornillos restantes.

Deben haber dos tornillos fijados bilateralmente detrás de la sutura coronal y uno en el hueso parietal derecho, anterior a la sutura lambda. Sujete la piel superior en el sitio de la incisión del ojo izquierdo con la pinza de cuatro pulgadas para apósitos y dirija la pinza de tres pulgadas para apósitos hacia la comisura de este ojo. Tome una aguja de calibre 26 y 3/8 de pulgada e insértela a través de la comisura del párpado.

Gire la aguja para que el lado biselado quede hacia arriba. Inserte la segunda aguja en el centro del párpado. Utilice pinzas finas para sostener un alambre 3T e insértelo en una de las agujas.

No es necesario insertarlo completamente. Siga el mismo procedimiento para el segundo alambre 3T. Sostenga ambas agujas con una mano mientras sostiene el cabezal con la otra mano.

En un movimiento continuo, retire las agujas del párpado mientras guía el soporte craneal en la misma dirección. Mientras sostiene el soporte del EMG con una mano, use la pinza de apósito de tres pulgadas con la otra mano para enrollar el cable de 10T alrededor de uno o ambos tornillos del lado derecho. Guarde este cable de manera que no sobresalga de los tornillos.

La etapa inicial de EMG debe centrarse antes de pasar al siguiente paso. Utilice la pinza de vendaje de cuatro pulgadas para crear un pequeño bolsillo separando la piel, es decir, la fascia superficial del músculo temporal. Una vez creado el bolsillo, use las tijeras de iris para cortar más tejido conectivo, trabajando hacia la comisura del ojo izquierdo.

Tenga cuidado de no profundizar demasiado ni cortar ningún vaso sanguíneo. Tome un electrodo bipolar y moldee el cable conductor de modo que pueda ajustarse a lo largo de la curvatura del músculo temporal. Los dos extremos estarán situados posteriormente al ojo izquierdo y el extremo inferior del electrodo bipolar estará situado directamente encima del cráneo.

Mezcle el polvo de Ortho Jet con los componentes líquidos para obtener una consistencia líquida. Aplique la pasta con una espátula microscópica alrededor de todo el sitio de incisión. Tenga cuidado de no dejar caer ninguna pasta sobre los ojos de la rata y manténgala contenida.

Deje que el Ortho Jet alcance un estado semiseco, luego use la pinza para astillas para eliminar el acrílico excesivo en la etapa craneal de EMG y los hilos del electrodo bipolar. Corte el alambre 3T sobrante, dejando unos pocos centímetros para trabajar.

Retire cuidadosamente el blindaje de PTFE de cada alambre 3T utilizando la pinza microdisectora. Esto permite que hagan contacto con el músculo orbicular de los párpados. Utilice la pinza microdisectora para crear ganchos en cada extremo de los alambres 3T.

Corte el exceso de alambre con cuidado, teniendo precaución de no cortar demasiado para que el alambre restante no se retraiga dentro del párpado. Los cables se fabrican en el laboratorio. Primero se conecta el enchufe bipolar blanco, lo cual permite la administración del estímulo de choque US.

Posteriormente se conecta el enchufe naranja del cabezal de EMG. Este registra la actividad electromiográfica cuando la rata parpadea. Ambos enchufes conducen a un conmutador redondo en la parte superior del brazo, que mantiene la continuidad de la señal mientras la rata se mueve libremente.

Se enciende el aislador de estímulos y se realizan las verificaciones finales del equipo. Esto incluye ajustar la línea base del EMG a un nivel visible en la pantalla del ordenador. En la sesión uno, la intensidad del choque se establece inicialmente en 4 miliamperios y se aumentará en incrementos de 4 miliamperios cada dos ensayos.

Este procedimiento de incorporación gradual permite que una rata se acostumbre al estímulo de choque. En el octavo ensayo, la intensidad del choque se mantiene en 1,6 miliamperios durante esta sesión y todas las sesiones posteriores. Un ordenador independiente ejecuta un osciloscopio digital de cuatro canales que nos permite realizar diagnósticos de señales en tiempo real.

Observe el parpadeo que emitió la rata en la caja uno. El osciloscopio también indica que la señal basal de EMG es relativamente limpia y con bajo nivel de ruido. Las cámaras web nos permiten monitorear también a cada rata.

Esta es una captura de pantalla del software blink versión 4.0 que muestra una época de prueba de 1400 milisegundos. En los primeros 280 milisegundos, no se presentan estímulos para obtener una medida de la actividad basal de la EMG. La línea amarilla indica el umbral, en el cual cualquier respuesta de EMG que supere 4 voltios por encima del valor basal promedio previo al CS será considerada una respuesta de parpadeo.

El estímulo condicionado de tono a 85 decibeles se presenta en el momento de 280 milisegundos. El tono permanece activo durante 380 milisegundos, lo que corresponde al momento de 660 milisegundos. Después de que se apaga, hay un intervalo de 500 milisegundos en el que no se presenta ningún estímulo. Este periodo se denomina período de traza, durante el cual la rata debe asociar la terminación del tono (EC) con el inicio del choque (EI), que aún se entregará en la marca de 1160 milisegundos.

El estímulo aversivo de descarga eléctrica dura 100 milisegundos. Naturalmente, el estímulo aversivo de descarga eléctrica provoca una respuesta defensiva de parpadeo conocida como respuesta incondicionada, o RI, que se mide en una ventana temporal de 140 milisegundos. Una sesión de entrenamiento consta de 100 ensayos.

Hay 90 ensayos en los que se asocian el EC y el EI, y en cada décimo ensayo, solo se presenta el EC. Hay 10 ensayos con solo EC por sesión. Estos ensayos nos permiten evaluar si se produce o no el aprendizaje de la asociación entre el EC y el EI.

La expresión en forma de respuestas condicionadas, o RC, se manifiesta cuando el estímulo aversivo (US) no está presente. El intervalo entre ensayos se promedia en 30 segundos, de modo que el inicio de cada ensayo no sea predecible. En cualquier ensayo dado, una rata puede parpadear en cualquier momento y su EMG será registrado por el software.

Cualquier parpadeo ocular discreto que supere la línea de umbral se considerará una respuesta en una de cuatro categorías según su momento de ocurrencia y la época del ensayo. Si la rata parpadea durante los primeros 80 milisegundos tras el inicio del tono como estímulo condicionado (CS), la respuesta se considera una respuesta de sobresalto o SR. Esta es una respuesta no asociativa que indica el rendimiento sensoriomotor, pero no el aprendizaje de la asociación entre CS y US en sí. Si parpadea después del período de SR pero antes de que se administre el estímulo incondicionado (US) de choque, entonces ha emitido una respuesta condicionada.

Como se mencionó anteriormente, la RC es la medida principal del aprendizaje asociativo. No se espera que la RC se desarrolle durante las fases iniciales del entrenamiento, pero a medida que avanza el entrenamiento a lo largo de muchos ensayos y sesiones, este tipo de respuestas se vuelven más frecuentes, de mayor amplitud y pueden estar mejor sincronizadas. Dividimos las RC en dos tipos: RC totales y RC adaptativas.

Los RC totales reflejan la capacidad general de aprendizaje, mientras que los RC adaptativos reflejan la habilidad del animal para sincronizar bien su parpadeo. Inmediatamente antes del inicio del choque, como una forma de prepararse, el período de RC adaptativo es de 200 milisegundos antes del inicio del estímulo incondicionado (US). En mamíferos con un hipocampo intacto, la expresión de los RC adaptativos refleja una participación elevada del hipocampo en la sincronización adecuada del parpadeo en relación con la presentación de los dos estímulos.

Por su propia naturaleza, el condicionamiento clásico del parpadeo de traza es mucho más difícil de adquirir que el condicionamiento clásico del parpadeo de retraso, en el cual la CS tonal y el US de choque se superponen en el tiempo. Aunque la expresión de las RC puede variar de un sujeto a otro y puede verse gravemente afectada por alteraciones en circuitos cerebrales específicos, se espera que la UR se emita durante cada ensayo apareado CS-US. Por lo tanto, esta medida refleja el rendimiento sensoriomotor y, al igual que las respuestas de sobresalto, no indican en sí la adquisición de la asociación CS-US.

En la siguiente serie de clips de video, verá la configuración del software y el inicio del entrenamiento del parpadeo. Se activa el software de parpadeo y se cargan los dos archivos pertinentes: un archivo de rata que contiene los datos del sujeto, y el archivo de condicionamiento del parpadeo con intervalo.

El programa se establece de antemano hasta que comience el entrenamiento. Cuando inicia el entrenamiento, observe que hay un temporizador en la parte inferior derecha de la pantalla que cuenta regresivamente hasta el siguiente ensayo. A continuación se muestra una grabación en video en vivo de la sesión uno, ensayo 15, en la que se emite una RP, pero aún no se han desarrollado RCs.

Aquí hay una repetición a un tercio de la velocidad. En la siguiente serie de clips, verá capturas de pantalla de la misma rata control no intubada mientras avanza a través de seis sesiones de entrenamiento. Eventualmente, emite tanto respuestas condicionadas totales como respuestas condicionadas adaptativas.

Aquí hay un clip de video en vivo de la sesión seis, ensayo 96, en el que se producen dos parpadeos, uno una RC adaptativa y el otro una UR. A continuación se muestra una repetición a un tercio de la velocidad. En este último clip, verá un video en vivo de una rata intubada con alcohol en su último ensayo de la sesión seis, un ensayo con solo el EC; incluso después de 600 ensayos de entrenamiento, no emite una RC adaptativa de forma confiable. Después de recopilar los datos, se examinan para detectar ensayos deficientes, que consisten en artefactos de ruido elevado y actividad EMG inusual en la línea base previa al EC, utilizando un algoritmo de error integrado para detectar valores atípicos.

Los ensayos válidos que se conservan se analizan posteriormente para determinar las respuestas condicionadas (RC), las respuestas incondicionadas (RI), el número total de RC y las RC adaptativas en función del porcentaje de respuestas, la amplitud, la latencia y otras medidas críticas. En este primer conjunto de resultados se muestran las RC adaptativas medias a lo largo de seis sesiones de entrenamiento. Tanto el porcentaje como la amplitud de las respuestas fueron estadísticamente significativos entre el grupo con alcohol por intubación y los dos grupos de control desde la segunda hasta la sexta sesión.

Esto indica que la frecuencia y la intensidad de las respuestas condicionadas adaptativas se vieron afectadas en ratas expuestas al alcohol durante el desarrollo temprano. En este segundo conjunto de resultados se muestran las respuestas incondicionadas medias. Tanto la frecuencia como las mediciones de amplitud no presentaron diferencias estadísticamente significativas entre ninguno de los grupos.

Estos resultados indican que la exposición temprana al alcohol no afectó la capacidad de las ratas para parpadear ante el estímulo incondicionado, sino que el deterioro que presentaron se debió a una falla en la asociación adecuada entre el EC y el EI durante la adquisición. En este experimento, examinamos la relación entre el cerebro y el comportamiento determinando si la exposición al alcohol durante el desarrollo, administrada de forma similar a un atracón, afecta al hipocampo, tal como se refleja en déficits de condicionamiento clásico del parpadeo con intervalo. De hecho, el condicionamiento clásico del parpadeo es una herramienta útil para evaluar las consecuencias neuroconductuales asociadas con la exposición al alcohol durante el desarrollo cerebral.

Es muy versátil en el sentido de que, al modificar los parámetros del estímulo o los requisitos de aprendizaje asociativo, también se puede evaluar la integridad funcional de diferentes sistemas cerebrales fuera del hipocampo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de los aspectos complejos relacionados con la administración de alcohol a ratas neonatas, la implantación de electrodos y la realización del procedimiento de prueba del parpadeo. Agradecemos que haya visto este video.