El uso de condicionamiento de clásico de Eyeblink rastro para evaluar disfunción hipocampal en un modelo de rata de trastornos del espectro alcohólico Fetal

El objetivo general de este experimento es demostrar cómo el uso del condicionamiento clásico de parpadeo de traza, una forma de aprendizaje asociativo, puede ayudar a detectar la disfunción del hipocampo en un modelo de rata de trastornos del espectro alcohólico fetal. Las crías de ratas neonatas son desafiadas con una alta dosis de alcohol, una concentración de 11,9% de volumen de alcohol en forma de atracón. Durante el equivalente a un tercer trimestre en humanos con respecto al crecimiento cerebral.

Este patrón de exposición y dosis de alcohol son factores clave en la producción de déficits cerebrales a lo largo de la vida, que imitan los casos humanos de TEAF. Una región importante del cerebro que se ve comprometida por la exposición temprana al alcohol es el hipocampo. Después de que las ratas crecen como adultas, se les examina para detectar la disfunción del hipocampo utilizando el condicionamiento clásico de parpadeo de trazo.

Esta es una forma de aprendizaje asociativo de alto orden que se basa en la integridad del hipocampo. Durante los días postnatales cuatro a nueve, las crías de rata se pesan cada mañana y se registra su peso. A continuación, los volúmenes de alimentación se obtienen de una tabla preimpresa en función del peso corporal.

Se suministra una solución de alcohol al 11,9% por volumen a las crías de rata durante dos tomas separadas por dos horas. La dosis diaria total de alcohol es de 5,25 gramos por kilogramo al día. Este paradigma de exposición compulsiva proporciona 0278 milésimas de pulgada de alcohol por gramo de peso corporal por alimentación en solución láctea.

Extraiga la leche que contiene alcohol con una jeringa estéril de un mililitro. A continuación, expulse el exceso de solución para obtener la cantidad exacta necesaria. Sumerja la punta del tubo de PE-10 en aceite de maíz fresco.

Esto facilita la inserción. Mida la longitud del tubo de PE-10 desde la boca del cachorro hasta su estómago. Si es necesario, ajuste el tapón PE-50 para que actúe como una guía visual para el punto de parada.

Inserte con cuidado el tubo de PE-10 en la boca del cachorro. Por lo general, encontrará cierta resistencia cuando la punta se encuentre con la garganta. Maniobre el tubo hasta que la punta se doble en la entrada del esófago.

Trate de no dejar que el tubo se deslice hacia atrás, ya que puede estar resbaladizo con el aceite. Continúe por su esófago y a medida que la punta pasa por el esfínter gastroesofágico, ingresará a su estómago. Deténgase en este punto, estabilice la bomba y administre la solución.

Esto debe hacerse a un ritmo lento. Retire con cuidado el tubo de PE-10 y examine al cachorro en busca de retrolavado de solución, sangre o lesiones físicas. Reemplace al cachorro con sus compañeros de camada si está bien.

Consulte el protocolo escrito y la lista de materiales para conocer los instrumentos específicos utilizados en el procedimiento de cirugía de párpados. Esterilice el campo quirúrgico con un desinfectante aprobado y autoclave todos los instrumentos y suministros quirúrgicos con anticipación. Después de inducir la anestesia adecuada en la rata con isoflurano, afeitar su cabeza con un cortapieles, exponiendo una cantidad suficiente de piel para el sitio de la incisión y el párpado izquierdo.

Su piel se esteriliza mediante la realización de tres exfoliantes alternos que involucran alcohol isopropílico al 70% y povidona yodada. Siga el procedimiento estándar para asegurar la rata al dispositivo estereotáxico con las barras para los oídos. Proceda con la cirugía cuando la rata exhiba un plano anestésico adecuado.

Use la hoja del bisturí para hacer una incisión anterior posterior en la línea media. Esta incisión debe exponer suficiente área anterior a los ojos y ligeramente posterior a la línea sutoral lambda. Use la hoja del bisturí para raspar el periostio en la parte superior del cráneo, con cuidado, para no causar un sangrado excesivo.

Limpie el exceso de tejido conectivo y sangre con un hisopo con punta de algodón y enjuague el área con solución salina estéril entre raspaduras. Taladre un orificio que comience directamente detrás de la sutura coronal en un hueso parietal. Retire cualquier residuo de sangre y hueso con un hisopo con punta de algodón.

Utilice pinzas de astilla para sujetar un tornillo 0 80. Use un destornillador de joyería para sujetar el tornillo al orificio, apriete el tornillo lo suficiente sin dañar el tejido cerebral cortical, generalmente de tres a cuatro vueltas completas. Siga el mismo procedimiento para asegurar los tornillos restantes.

Debe haber dos tornillos asegurados bilateralmente detrás de la sutura coronal y uno en el hueso parietal derecho, anterior a la sutura lambda. Agarre la piel superior en el sitio de la incisión de su ojo izquierdo con las pinzas de vendaje de cuatro pulgadas y dirija las pinzas de vendaje de tres pulgadas hacia la esquina de este ojo. Tome una aguja de calibre 26 de 3/8 de pulgada e insértela a través de la esquina del párpado.

Gire la aguja de modo que el lado biselado quede hacia arriba. Inserta la segunda aguja en el centro del párpado. Use pinzas finas para agarrar un alambre 3T e insertarlo en una de las agujas.

No es necesario insertarlo por completo. Siga el mismo procedimiento para el segundo cable 3T. Agarre ambas agujas con una mano mientras agarra la etapa de la cabeza con la otra mano.

En un movimiento continuo, aleje las agujas del párpado mientras guía la etapa de la cabeza en la misma dirección. Mientras sostiene la platina de la cabeza EMG con una mano, use las pinzas de vendaje de tres pulgadas con la otra mano para envolver el cable 10T alrededor de uno o ambos tornillos en el lado derecho. Guarde este cable para que no sobresalga de los tornillos.

La etapa principal de EMG debe estar centrada antes de pasar al siguiente paso. Use las pinzas de vendaje de cuatro pulgadas para crear un pequeño bolsillo separando la piel, es decir, la fascia superficial del músculo temporal. Con el bolsillo creado, usa las tijeras de iris para cortar más tejido conectivo, trabajando hacia la esquina del ojo izquierdo.

Tenga cuidado de no profundizar demasiado ni cortar ningún vaso sanguíneo. Tome un electrodo bipolar y dé forma al cable de alambre para que se pueda ajustar a lo largo de la curvatura del músculo temporal. Las dos puntas estarán situadas detrás del ojo izquierdo y el extremo inferior del electrodo bipolar estará situado directamente sobre el cráneo.

Mezcle el polvo Ortho Jet en componentes líquidos para obtener una consistencia líquida. Aplique la pasta con una microespátula alrededor del sitio de la incisión. Ten cuidado de no dejar caer ninguna pasta en los ojos de la rata y mantenla contenida.

Deje que el Ortho Jet llegue a un estado semiseco, luego use las pinzas de astilla para eliminar el exceso de acrílico en la etapa de la cabeza EMG. Y las roscas del electrodo bipolar. Corta el exceso de alambre 3T, dejando unos centímetros para trabajar.

Retire con cuidado el blindaje de PTFE de cada cable 3T con las pinzas de microdisección. Esto les permite entrar en contacto con el músculo orbicular de los ojos. Utilice las pinzas de microdisección para crear ganchos en cada extremo de los alambres 3T.

Corta el exceso de alambre, teniendo cuidado de no cortar tanto que el alambre restante se retraiga hacia el párpado. El cableado se fabrica internamente. El enchufe bipolar blanco se conecta primero, y esto permite la entrega del estímulo de choque estadounidense.

A continuación, se conecta el enchufe naranja de la etapa de la cabeza EMG. Registra la actividad electromiográfica a medida que la rata parpadea. Ambos enchufes conducen a un conmutador redondo en la parte superior del brazo que mantiene la continuidad de la señal a medida que la rata se mueve libremente.

Se enciende el aislador de estímulo y se realizan las comprobaciones finales del hardware. Esto incluye ajustar la línea de base de EMG a un nivel que se pueda ver en la pantalla de la computadora. En la primera sesión, la intensidad del choque se establece primero en 4 miliamperios y se incrementará en unidades de 4 mil amperios cada dos pruebas.

Este procedimiento de introducción gradual permite que una rata se aclimate al estímulo de choque. Para la octava prueba, la intensidad del choque se mantiene en 1,6 miliamperios durante esta sesión y todas las sesiones posteriores. Un ordenador independiente ejecuta un osciloscopio digital de cuatro canales que nos permite realizar diagnósticos de señal en tiempo real.

Fíjate en el parpadeo que emitió la rata en la caja uno. El osciloscopio también indica que la señal EMG de referencia es relativamente limpia con poco ruido. Las cámaras web también nos permiten monitorear a cada rata.

Esta es una captura de pantalla de la versión 4.0 del software Blink que muestra una época de prueba que dura 1400 milisegundos. En los primeros 280 milisegundos, no se presentan estímulos para obtener una medida de la actividad EMG basal. La línea amarilla indica la línea de umbral en la que cualquier respuesta EMG que supere los 4 voltios por encima del valor basal promedio anterior a CS será elegible como una respuesta de parpadeo.

El estímulo de condición tonal de 85 decibelios se entrega en el punto de tiempo de 280 milisegundos. El tono permanece encendido durante 380 milisegundos, lo que corresponde al punto de tiempo de 660 milisegundos. Después de que se apaga, hay un intervalo de 500 milisegundos en el que no se presentan estímulos. Esto se denomina el período de rastreo en el que la rata debe resolver el desplazamiento del tono CS con el inicio del choque US, que aún debe entregarse en la marca de 1160 milisegundos.

El choque dura 100 milisegundos. Naturalmente, el choque US provoca una respuesta de parpadeo defensiva conocida como respuesta incondicionada, o UR, que se mide en una ventana de tiempo de 140 milisegundos. Una sesión de entrenamiento consta de 100 ensayos.

Hay 90 ensayos en los que el CS y el US están emparejados y en cada décimo ensayo, solo se entrega el CS. Hay 10 pruebas de solo CS por sesión. Estos ensayos nos permiten indagar si el aprendizaje de la asociación CS US o no.

En forma de respuestas de condición, o CR, se expresa cuando el US de choque no está presente. El intervalo entre juicios se promedia en 30 segundos, por lo que el inicio de cada juicio no es predecible. En cualquier ensayo, una rata puede parpadear en cualquier momento y su EMG será registrado por el software.

Cualquier parpadeo discreto que supere la línea de umbral se considerará una respuesta en una de las cuatro categorías en función de cuándo se produzcan y de la época de prueba. Si la rata parpadea durante los primeros 80 milisegundos después del inicio del tono CS, la respuesta se considera una respuesta de sobresalto o SR. Se trata de una respuesta no asociativa que es indicativa del rendimiento sensoriomotor y no del aprendizaje de la asociación CS US per se. Si parpadea después del período de SR pero antes de que se produzca el US de choque, entonces ha emitido una respuesta condicionada.

Como se mencionó anteriormente, la RC es la medida principal del aprendizaje asociativo. No se espera que la RC se desarrolle durante las primeras fases del entrenamiento, pero a medida que el entrenamiento avanza a lo largo de muchas pruebas y sesiones, estos tipos de respuestas se vuelven más frecuentes, más amplias y pueden estar más sincronizadas. Dividimos los CR en dos tipos, CR totales y CR adaptables.

Los CR totales reflejan la capacidad general de aprendizaje, mientras que los CR adaptativos reflejan la capacidad del animal para cronometrar bien su parpadeo. Inmediatamente antes del inicio del choque, como una forma de prepararse, el período de RC adaptativo es de 200 milisegundos antes del inicio del choque. En los mamíferos con un hipocampo intacto, la expresión de CR adaptativos refleja un alto nivel de implicación del hipocampo en el momento adecuado del parpadeo en relación con la entrega de los dos estímulos.

Por su propia naturaleza, el condicionamiento clásico de parpadeo es mucho más difícil de adquirir que el condicionamiento clásico de parpadeo retardado, donde el tono CS y el shock US se superponen en el tiempo. Si bien la expresión de RC puede variar de un sujeto a otro y puede verse gravemente afectada por desafíos a circuitos cerebrales discretos, se espera que la UR se emita durante cada ensayo emparejado de CS US. Como tal, esta medida refleja el rendimiento sensoriomotor y, al igual que las respuestas de sobresalto, no son indicativas del aprendizaje de la asociación CS US per se.

En la siguiente serie de videoclips, verá la configuración del software y el inicio del entrenamiento de parpadeo. Se activa el software de parpadeo y se reclutan los dos archivos pertinentes. Un archivo rat que contiene los datos del sujeto y el archivo de condicionamiento de parpadeo de seguimiento.

El programa se establece hasta que comienza la capacitación. A medida que comienza el entrenamiento, observe que hay un temporizador en la parte inferior derecha de la pantalla que cuenta regresivamente para la siguiente prueba. Aquí hay una grabación de video en vivo de la primera sesión, prueba 15, donde se emite un UR pero aún no se han desarrollado CR.

Aquí hay una repetición a un tercio de la velocidad. En la siguiente serie de clips, verá capturas de pantalla de la misma rata de control no intubada a medida que avanza a través de seis sesiones de entrenamiento. Con el tiempo, emite tanto RC totales como RC adaptativas.

Aquí hay un videoclip en vivo de la sexta sesión, prueba 96, donde se emiten dos parpadeos, uno un CR adaptativo y el otro un UR. Aquí hay una repetición a un tercio de la velocidad. En este clip final, verá un video en vivo de una rata intubada con alcohol en su última prueba de la sesión seis, una prueba solo de CS, incluso después de 600 pruebas de entrenamiento, no emite una RC adaptativa de manera confiable. Una vez recopilados los datos, se examinan para detectar ensayos erróneos, que consisten en artefactos de alto ruido y una actividad EMG de referencia inusual previa a la CS mediante un algoritmo de error incorporado para detectar valores atípicos.

Los buenos ensayos que se mantienen se analizan más a fondo para las RS, las UR, las RC totales y las RC adaptativas con respecto al porcentaje de respuestas, la amplitud, la latencia y otras medidas críticas. En este primer conjunto de resultados se muestran las RC adaptativas medias a lo largo de seis sesiones de entrenamiento. Tanto las medidas de porcentaje como de amplitud fueron estadísticamente significativas entre el grupo intubado con alcohol y los dos grupos control desde la segunda hasta la sexta sesión.

Esto indica que la frecuencia y la fuerza de las RC adaptativas se vieron afectadas en ratas expuestas al alcohol durante el desarrollo temprano. Las respuestas medias incondicionadas se muestran en este segundo conjunto de resultados. Tanto las medidas de frecuencia como las de amplitud no fueron estadísticamente diferentes entre ninguno de los grupos.

Estos resultados indican que la exposición temprana al alcohol no afectó la capacidad de las ratas para parpadear al estímulo incondicionado, sino que el deterioro que exhibieron se debió a una falla en la asociación adecuada del CS y el US durante la adquisición. En este experimento, examinamos la relación del comportamiento cerebral determinando si la exposición al alcohol en el desarrollo que se produce en forma de atracón afecta al hipocampo, como se refleja en los déficits y el condicionamiento clásico del parpadeo. De hecho, el condicionamiento clásico del parpadeo es una herramienta útil para evaluar las consecuencias neuroconductuales asociadas con la exposición al alcohol durante el desarrollo del cerebro.

Es muy versátil en el sentido de que, al cambiar los parámetros del estímulo o los requisitos de aprendizaje asociativo, también se puede evaluar la integridad funcional de diferentes sistemas cerebrales fuera del hipocampo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de las complejidades involucradas con la administración de alcohol a las crías de ratas neonatales, la implantación de electrodos y la realización del procedimiento de prueba de parpadeo. Te damos las gracias por ver este video.