Name: Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Aprenda a aislar células tumorales circulantes en un modelo ortotópico de cáncer colorrectal en ratones. Esta técnica microquirúrgica permite generar tumores reproducibles para estudiar metástasis y progresión tumoral.

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Este trabajo fue apoyado por la fundación alemana de la investigación (WE 3548 / 4-1) y Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Los experimentos con animales presentados aquí fueron revisados ​​y permitidos de forma independiente por un Comité de Cuidado de Animales y Uso Animal institucional y gubernamental y fueron conducidos de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencias de Animales de Laboratorio (FELASA). Se tomaron todas las medidas posibles para minimizar el sufrimiento, incluyendo anestesia y analgesia o, si es necesario, eutanasia prematura. 1. Preparación de células y organoides NOTA: Utilice un volumen de 20 μL con 100.000 células para cada inyección. Utilizar la matriz de la membrana basal (BMM) para evitar fugas y asegurar la inyección estandarizada. Para asegurar resultados reproducibles, realice ensayos de autenticación de líneas celulares ( por ejemplo , mediante perfiles STR) a intervalos regulares. <ol><li> Preparación de suspensiones celulares primarias a partir de tejido fresco NOTA: Siempre trabaje bajo condiciones estériles. La transferencia inmediata de losEl tejido resecado de la sala de operaciones al laboratorio sobre hielo es necesario para asegurar la alta viabilidad de las células. El bienestar del paciente y el tratamiento óptimo deben ser siempre la primera prioridad. Por lo tanto, las muestras de tejido para la investigación deben obtenerse de una manera que no interfiera con el posterior tratamiento patológico y estadificación del tumor resecado. En la mayoría de los casos, por lo tanto, es razonable tener las muestras para la investigación obtenida por un patólogo entrenado con el fin de garantizar la no interferencia con el diagnóstico patológico. <ol><li> Inmediatamente después de la extracción estéril de la muestra resecada (idealmente ~ 1 cm 3 ), coloque la muestra de tejido en un tubo de 50 mL previamente llenado con 20-30 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Guarde el tubo en hielo y transfiéralo inmediatamente al laboratorio. </li><li> Poner el tejido en una placa de Petri y lavar dos veces con un montón de PBS para eliminar la sangre restante. </li><li> Cortar el tejido en trozos pequeños (~ 2-4 mm) con una scaLpel ( por ejemplo , con una cuchilla # 20 o # 36). </li><li> Utilizar el disociador de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el fin de disociar aún más el tejido tumoral a una suspensión de una sola célula. Alternativamente, utilice otros protocolos de digestión enzimática del tumor. </li><li> Contar las células de la suspensión de una sola célula resultante ( por ejemplo , en un contador de cuchillas o un hemocitómetro). </li><li> Centrifugar (5 min a 1.500 xg) y lavar la suspensión celular dos veces con PBS. </li><li> Resuspender las células en BMM a una concentración de 5 x 10 6 células / mL y mantenerlos en hielo. </li></ol></li><li> Preparación de líneas celulares para inyección <ol><li> Cultivar todas las líneas celulares de cáncer colorrectal en condiciones normales de cultivo (37 ° C, 5% CO 2 ) y prepararlas el día de la cirugía. </li><li> Cosechar las células de acuerdo con los protocolos de cultivo de células estándar, contar las células ( por ejemplo , en un contador de cuchara o un hemocitómetro) y calcular la demandaCantidad necesaria para todas las inyecciones dependiendo del número de animales a inyectar. </li><li> Prepare 3-5x del volumen realmente necesario para tener en cuenta las pérdidas de pipeteo y el volumen muerto de la jeringa de inyección. </li><li> Centrifugar (5 min a 1.500 g) y lavar la suspensión celular dos veces con PBS. </li><li> Resuspender las células en BMM a una concentración de 5 x 10 6 células / mL y mantenerlos en hielo. </li></ol></li><li> Preparación de los organoides NOTA: Todos los cultivos organoide 3D se cultivan en condiciones de cultivo estándar (37ºC, 5% CO 2 ). Ya se han publicado protocolos detallados para el cultivo de organoides. 18 , 19 , 20 Similar a las líneas celulares convencionales, se recomienda un volumen de 20 μL de BMM con 100.000 células por inyección. Los organoides se preparan el día de la cirugía como sigue: <ol><li> Preparar el siguiente medio (en los siguientesA DMEM / F12 +++): Medio de Eagle modificado de Dulbecco avanzado (DMEM) / F12 + 1% de HEPES (1M) + 1% de glutamina (200 mM) + 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Pre-llenar tubos de 15 mL con 1 mL de DMEM / F12 +++. </li><li> Aspirar cuidadosamente los organoides de la superficie de la placa de cultivo y transferir el contenido de 3 a 5 pocillos en un tubo de 15 ml. </li><li> Cuidadosamente romper las organoides en trozos más pequeños por pipetearlos arriba y abajo con una pipeta de vidrio extendida. </li><li> Añadir 5 mL de DMEM / F12 +++ al tubo, seguido de centrifugación a 1.000 xg durante 5 min. </li><li> Después de la centrifugación, se retira el sobrenadante, se resuspende el sedimento en 600 μl de tampón de disociación enzimática y se transfiere la suspensión a un pocillo de una placa de 6 pocillos. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 1-5 minutos y luego cuidadosamente pipetear la suspensión hacia arriba y hacia abajo con el fin de disolver los organoides. NOTA: Verificar la digestión a través del microscopio; Se completa cuando todos los clusters de células se han disociadoD a las células individuales. </li><li> Tras la digestión exitosa, agregar 1,4 ml de DMEM / F12 +++ para detener la digestión. Luego transferir todos los pocillos de organoides digeridos a un tubo de 50 ml. </li><li> Cuente las células y calcule la cantidad requerida para todas las inyecciones. </li><li> Prepare de 3 a 5 veces el volumen realmente necesario para tener en cuenta las pérdidas de pipeteado y el volumen muerto de la jeringa de inyección </li><li> Centrifugar (5 min a 1.500 xg) y lavar la suspensión celular dos veces con PBS. </li><li> Se resuspendieron las células en BMM a una concentración de 5 x 106 células / mL y se mantuvieron en hielo. </li></ol></li></ol> 2. Modelo de ratón ortotópico <ol><li> Preparación de los animales receptores para la cirugía NOTA: Utilice como destinatarios a los ratones NOD.Cg-Prkdc scid de 6 a 8 semanas de edad como ratones II2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG). 21 NSG están entre los ratones más inmunocomprometidos, carecen de células maduras B, T y NK junto con otros múltiples inmunes.Los efectos. 21 Ellos crecen de forma fiable los tumores incluso si se inyectan bajo número de células y son muy propensos a la metástasis a distancia. Los ratones NSG son excelentes reproductores y pueden mantenerse en unidades convencionales libres de patógenos específicos (SPF). <ol><li> Antes de la primera incisión, inyectar 0,05 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea. </li><li> Utilice sevoflurano al 3-3.5% en volumen para anestesia general. Una pérdida del reflejo de pinza del dedo del pie indica suficiente anestesia. </li><li> Cubrir los ojos de los ratones anestesiados con pomada oftálmica para evitar la desecación de la córnea. </li><li> Detenga los ratones en posición supina sobre una mesa pequeña. </li><li> Afeitar el abdomen con una máquina de afeitar eléctrica (la crema depilatoria se puede utilizar alternativamente) y desinfectar con al menos 3 veces clorhexidine / yodo y alcohol del 70% alternativamente. </li><li> Cubrir el campo quirúrgico con cortinas estériles. NOTA: El uso de antibióticos perioperatorios es opcional y está sujeto a las pautas institucionales. </li></ol></li><li> Laparotomía de la línea media y la exposición del ciego <ol><li> Use tijeras (los bisturíes se pueden usar alternativamente) para hacer una pequeña incisión de la línea media (3 - 5 mm) de la piel en el bajo abdomen. Recoger la musculatura de la pared abdominal con fórceps y cuidadosamente incise con tijeras, abriendo así la cavidad abdominal. </li><li> Identificar y cuidadosamente exteriorizar el ciego con pinzas atraumáticas. Coloque la bolsa de terminación ciega del ciego en el abdomen apuntando cranealmente. </li><li> Una vez exteriorizado, mantenga el ceco húmedo utilizando hisopos salinos tibios en todo momento. </li></ol></li><li> Inyección ortotópica, cierre del abdomen y recuperación postoperatoria <ol><li> Para inyección intracecal, use una jeringa estándar de 1 ml con una cánula de 30 G. Monte esta jeringa en una bomba de microinyección, que a su vez se monta en un micromanipulador. </li><li> Cuidadosamente agarre la punta del ciego con fórceps atraumático y suavemente suavizarlo acariciándolo downwarD con un segundo conjunto de fórceps humedecido con solución salina caliente. </li><li> Coloque la cánula directamente sobre el ciego. </li><li> Realice los siguientes pasos bajo control visual con un microscopio quirúrgico binocular. </li><li> Coger con cuidado el ciego con dos pinzas atraumáticas en ambos extremos de la parte exteriorizada del ciego, estirarlo ligeramente y luego tirar lentamente sobre la cánula que se coloca paralelo y directamente encima. Es crucial no perforar toda la pared intestinal (inyectando así las células en el lumen), así como no perforar la serosa más allá del punto inicial de penetración, ya que esto conduciría a la fuga ya la diseminación peritoneal. <ol><li> Mueva el intestino hacia la cánula, no la cánula hacia el intestino. Sostenga y estire el intestino entre dos fórceps. Las manos del cirujano deben descansar sobre una superficie para reducir el temblor. </li></ol></li><li> Inyectar las células entre la serosa (visto como un revestimiento muy fino y translúcidoE intramurales) y la muscular. Por lo tanto, la cánula debe colocarse visualmente por encima de los vasos sanguíneos y por debajo de la delgada membrana translúcida. </li><li> Utilice un interruptor de pie para iniciar la inyección con el fin de reducir el temblor mientras la cánula está dentro de la pared intestinal. </li><li> Una vez que la cánula está en posición, iniciar la inyección. Utilice una duración de 20 s, resultando en un ajuste de 1 μl / s en la unidad de control de la bomba. NOTA: La inyección en o cerca de un vaso sanguíneo dañado conduce a diseminación intravascular directa ya metástasis a distancia y por lo tanto debe evitarse. </li><li> Después de completar la inyección, retire cuidadosamente la cánula tirando hacia atrás. </li><li> Coloque un hisopo seco debajo del ciego, y luego enjuague completamente el ciego con agua destilada con el fin de lisar las células filtradas y evitar así la difusión peritoneal artificial. </li></ol></li><li> Cierre del abdomen y recuperación postoperatoria <ol><li> Después de rInsing, devolver suavemente el ciego a la cavidad abdominal. </li><li> Cierre la pared abdominal con suturas corrientes de absorción rápida de 6-0. </li><li> Cierre la piel con clips para heridas quirúrgicas. </li><li> Coloque el ratón en un mapa de calefacción establecido a 38 ° C hasta que se ha recuperado completamente de la anestesia. </li><li> Observar de cerca el estado postoperatorio de los ratones durante las siguientes 48 h. En caso de malestar, tratar con 0,05 mg / kg de buprenorfina cada 12 h. </li><li> Vigilar a los ratones al menos una vez al día para detectar signos de angustia debido al crecimiento del tumor. </li></ol></li></ol> 3. Aislamiento de células tumorales circulantes de muestras de sangre entera NOTA: Obtenga sangre por punción cardiaca transcutánea en ratones anestesiados, seguida de eutanasia. Idealmente, se inyectan 1.000 μl de sangre en una jeringa precargada con 100 μl de un anticoagulante (ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o heparina). Utilizar un anti-humano-EpCAM (adhesión de células epitelialesMolécula) para identificar los CTC. Esto funciona muy bien si se usan líneas de células epiteliales humanas en el modelo de ratón. Para otros aparatos, pueden ser necesarios diferentes anticuerpos. <ol><li> Enriquecimiento de CTC: <ol><li> Pre-llene los tubos de 15 mL con 5 mL de medio de gradiente de densidad y transfiera cuidadosamente la sangre al tubo de 15 mL. </li><li> Centrifugar (30 min a 300 xg sin freno) y retirar cuidadosamente el sobrenadante superior. </li><li> Verter el resto en un nuevo tubo de 15 ml y centrifugar (15 min, 300 xg con freno). </li><li> Recuperar la interfase que contiene las células mononucleares (descarte el resto) y lavar las células dos veces con PBS. </li><li> Resuspender el sedimento en 200 μL de PBS / 1% de EDTA y añadir 4 μl de anticuerpo EpCAM. Incubar 20 min en hielo en la oscuridad. </li></ol></li><li> Tamizaje y selección <ol><li> Preparar el siguiente tampón (en lo siguiente denominado tampón de recogida): PBS + 10% de suero de ternera fetal (FCS) + 1% de penicilina / STreptomicina (1%) + 0,8% de EDTA. </li><li> Utilice un lápiz PAP para dibujar un círculo de ~ 1 cm en una placa de Petri estéril de 6 cm (evita que el líquido se disperse en el plato) y pipetee 700 μl de tampón de recogida en este círculo. </li><li> Añadir 50 μl de suspensión celular al tampón de recogida de 700 μl dentro del círculo. Compruebe la densidad de las células con el microscopio. Dividir la muestra en platos diferentes si es demasiado densa. </li><li> Espere a que las células se establezcan (~ 5 min). </li><li> Muestre la gota de la suspensión celular para las células teñidas (= EpCAM-positivas). </li><li> Una vez que se encuentra una célula, recoger la célula con el micromanipulador y ponerlo en 50 μ l de buffer dependiendo de la intención de análisis aguas abajo ( por ejemplo , RNA extracción de amortiguación o medio de cultivo). </li><li> Dependiendo de los análisis de aguas abajo, aislar las células EpCAM negativas y / o el medio como controles negativos. </li><li> Proceder con análisis de aguas abajo ( por ejemplo , cultivo celular, PCR). </li></ol></li></ol>

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<li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A pesar de su actividad preclínicamente probada en los modelos de ratones subcutáneos, la gran mayoría de los nuevos compuestos fallan en ensayos clínicos y nunca llegan a la clínica. 11 Esta insuficiencia evidente de modelos subcutáneos de ratón para simular con precisión los patrones de la biología y de crecimiento de los tumores ha conducido al desarrollo de modelos ortotópicos ratón basa en la inyección de las células tumorales directamente en el órgano original. ...

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en los países occidentales. 1 Mientras que el tumor primario a menudo puede ser resecado, la aparición de metástasis distantes empeora drásticamente el pronóstico y a menudo conduce a la muerte. 2 , 3 El correlato biológico de la metástasis son las células tumorales circulantes (CTC), que se separan del tumor, sobreviven en la circulación, se adhieren al epitelio en el órgano diana, invaden el órgano y en última instancia, crecen a nuevas lesiones. 4 Aunque se sabe que los CTC son de relevancia pronóstica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 su biología sólo se entiende en parte como resultado de su extrema rareza en la CRC. 10 Los modelos de ratón son un poderoso tOol para estudiar diversos aspectos de la biología del cáncer. Los modelos clásicos de tumores subcutáneos se producen mediante inyección subcutánea de células tumorales en ratones receptores, que pueden ser inmunocompetentes (si se utilizan células tumorales murinas singénicas) o inmunodeficientes. Los modelos de tumor subcutáneo son baratos y producen datos rápidamente; Su crecimiento tumoral de punto final puede ser medido fácilmente y no invasivamente. Sin embargo, el 88% de los nuevos compuestos que han demostrado actividad antitumoral en estos modelos fallan en ensayos clínicos. 11 Esto es en parte debido a las diferencias entre especies entre humanos y ratones; Sin embargo, una gran parte de este fracaso se debe al bajo valor predictivo de los modelos de ratones subcutáneos. Los modelos de ratones ortotópicos, en los que las células tumorales se inyectan en el órgano de origen y, por tanto, crecen en su microambiente original, se utilizan cada vez más en la investigación del cáncer. 11 , 12 , </sUp&gt; 13 , 14 Los modelos ortotópicos no sólo simulan las condiciones locales de crecimiento tumoral; Como resultado del sitio anatómicamente correcto del crecimiento tumoral, los modelos de ratón ortotópico también permiten la simulación realista de la metástasis y por lo tanto se usan para estudiar la biología del CTC 8 , 15 , 16 o su respuesta a diferentes tratamientos en la CRC. 13 , 17 Una de las principales desventajas de los modelos de ratones ortotópicos es su complejidad técnica. Dependiendo del órgano en el que se van a inyectar las células, la curva de aprendizaje hasta que el experimentador es capaz de inducir tumores reproducibles es bastante larga. Esto se aplica especialmente a los modelos de cáncer colorrectal, ya que las células tumorales necesitan ser inyectadas en la pared intestinal, lo que a menudo produce perforación, pérdida de células tumorales o pérdida endoluminal de células tumorales. Esto unEl objetivo de este artículo es describir el método de preparación celular a partir de muestras de tejido primario, líneas celulares 2D y cultivo organoide 3D y su inyección en el ciego de ratones. La técnica descrita aquí conduce a tumores muy uniformes y, dependiendo de la biología tumoral de la línea celular utilizada para inyección, la formación reproducible de metástasis a distancia y CTC en los ratones receptores. 15

<table><tbody><tr><td><fuerte>Medios y componentes de cultivo celular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanzado DMEM F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ medio</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++</td></tr><tr><td>medio Glutamax-I Suplemento (200 mM)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++</td></tr><tr><td>medio Penicilina/ Estreptomicina (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++</td></tr><tr><td>medio DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>medio básico de líneas celulares 2D (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>medio básico de líneas celulares 2D (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Tampón de disociación enzimática TrypLE Express</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Matrigel (BMM, sin rojo de fenol)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (0,25%, fenol-rojo)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6/48 pocillos con tapa</td><td>CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>matraz de cultivo celular 75 cm&sup2;, matraz de cultivo celular de 250 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>150 cm&sup2;, 600 mL</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>tubos Eppendorf 1,5 mL / 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL, 50 mL</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Portaobjetos de recuento (para máquina de recuento TC20)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>pipetas Pasteur (vidrio, 150 mm)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>finamente extraído con un mechero Bunsen</td></tr><tr><td>gentleMACS Disociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>para la preparación de tejido tumoral primario</td></tr><tr><td>MACSmix Rotador de tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>para la preparación de tejido tumoral primario</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>para la preparación de tejido tumoral</td></tr><tr><td>primario kit de disociación de tumores humanos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>para la preparación</td></tr> <tr><td>de tejido tumoral primarioHalcón 70 y micro; m Filtro de células</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>352350</td><td>para la preparación de tejido tumoral primario</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>strongEquipo quirúrgico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Oxígeno</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>medicinal</td><td>Air Liquide Medical</td><td></td> GmbH-Buprenorfina <td></td></tr><tr><td></td><td>Temgesic-Bepanthen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- ungüento oftálmico</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina normal 0,9% (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Braun 235144</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL (sin volumen muerto) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>aguja de inyección de 30 G</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>hisopos de celulosa</td><td>Lohmann & Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Micro-Adson</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijera Iris - ToughCut</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Portaagujas</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Kit</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (quirúrgico sutura)</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H Máquina</td><td></td></tr> de <tr><td>anestesia de investigación de sobremesa con descarga de O2 y vaporizador de sevoflurano</td><td>Parkland Scientific V3000PS</td><td>/PK</td><td></td></tr><tr><td>Bomba UltraMicro con controlador Micro4 Equipo</td><td>UMP3-4</td> de <td>World Precision Instruments</td><td>para inyección ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Interruptor de pedal para controlador SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments</td><td>15867</td><td>Equipo para inyección ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Micromanipulador manual de tres ejes</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td>Equipo para inyección ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Soporte magnético para micromanipulador</td><td>World Precision Instruments Equipo</td><td>M10</td><td>para inyección ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Placa base de acero para soporte magnético M10</td><td>World Precision Instruments</td><td>5479</td><td>Equipo para inyección ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Placa caliente 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Afeitadora de pelo</td><td>AESCULAP -</td><td></td> Microscopio quirúrgico binocular Braun <td></td></tr><tr><td></td><td>Parkland Scientific</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>CTC aislamiento</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente de densidad medio &ndash; Ficoll</td><td>StemCell - Lymphoprep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-humano CD326 (EpCAM) clon de anticuerpos 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-ratón CD326 (EpCAM) clon de anticuerpos G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, &oslash; 60 x 15 mm, 21 cm&sup2;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de cultivo celular de fluorescencia</td><td>Micromanipulador Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td> Bomba de aspiración <td>Eppendorf</td><td></td><td>conectada al micromanipulador</td></tr><tr><td>Dmz Extractor de microelectrodos universal</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>necesario para la fabricación de microcapilares para la aspiración de una sola célula</td></tr><tr><td>Prisma Capilares de vidrio</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo PAP</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>tampón de recogida</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>tampón de recogida</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>tampón de recogida</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>búfer de selección</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-human CD326 (EpCAM) clon 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM inmunohistoquímica (cf. fig. 2C)</td></tr><tr><td>HRP conejo anti-ratón IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM inmunohistoquímica (cf, fig. 2C)</td></tr></tbody></table>

aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

A pesar de las ventajas de la fácil aplicabilidad y rentabilidad, los modelos de ratón subcutáneo tienen limitaciones severas y no simulan con precisión la biología tumoral y la diseminación de células tumorales. Se han introducido modelos de ratones ortotópicos para superar estas limitaciones; Sin embargo, estos modelos son técnicamente exigentes, especialmente en órganos huecos como el intestino grueso. Con el fin de producir tumores uniformes que crecen de forma fiable y metástasis, las técnicas estandarizadas de preparación e inyección de células tumorales son críticas. Hemos desarrollado un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal (CRC) que desarrolla tumores muy uniformes y puede ser utilizado para estudios de biología de tumores, así como ensayos terapéuticos. Se inyectan células tumorales de tumores primarios, líneas de células bidimensionales (2D) o organoides tridimensionales (3D) en el ciego y, dependiendo del potencial metastásico de las células tumorales inyectadas, forman tumores altamente metastáticos. En adición,Los CTC se pueden encontrar regularmente. Aquí describimos la técnica de preparación de células tumorales tanto de líneas celulares 2D como de organoides 3D, así como el tejido tumoral primario, las técnicas quirúrgicas y de inyección, así como el aislamiento de CTCs de los ratones portadores de tumores y los consejos actuales para la resolución de problemas.

La generación exitosa y reproducible de tumores colorrectales en este modelo depende en gran medida de una inyección precisa de las células sin derrames o fugas. Si esto se consigue, este modelo es extremadamente fiable y rara vez da lugar a la diseminación peritoneal artificial. La cinética de crecimiento de los tumores, así como sus patrones de diseminación dependen de la biología de los organoides y células utilizados. 15 Mientras que las células HCT116 metasta...

Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

El objetivo general de esta técnica microquirúrgica consiste en inyectar células tumorales colorrectales en la pared cecal para inducir tumores colorrectales reproducibles y metastásicos en ratones. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la biología de células tumorales circulantes; sus principales ventajas son los tumores altamente reproducibles y uniformes, lo que permite una predicción confiable del estadio tumoral y de las células tumorales circulantes. Comience utilizando pinzas no traumáticas para exteriorizar cuidadosamente el ciego de un ratón inmunocomprometido de seis a ocho semanas de edad.Colocar el extremo ciego del ciego sobre el abdomen de manera que la bolsa apunte cranealmente. Para la inyección intra-cólica, montar una jeringa estándar de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 y cargarla con las células tumorales en una bomba de microinyección que esté montada sobre un micromanipulador. A continuación, usar fórceps atraumáticos para sujetar cuidadosamente la punta del ciego y emplear un segundo fórceps, humedecido con solución salina tibia, para alisar suavemente el ciego con movimientos descendentes.Ahora mueva el animal bajo un mic

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Dos técnicas se pueden utilizar para establecer este modelo: la inyección de una suspensión de células de cáncer en la pared del ciego o el trasplante de un trozo de tumor subcutáneo en el ciego. Este modelo es útil para el estudio de la evolución natural del cáncer colorrectal y ensayo de nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer colorrectal.

Modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Este video describe el protocolo para establecer un modelo de ratón de metástasis espontánea de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer colorrectal o PDX. Estos modelos de xenoinjertos imitan parcialmente las características de los carcinomas humanos y comprenden los aspectos críticos de las neoplasias malignas humanas, incluidas la invasión y la metástasis.

Modelos de ratón con metástasis espontánea: una plataforma para estudiar el potencial metastásico de las células de cáncer colorrectal inyectadas ortotópicamente

Este video describe el protocolo para generar metástasis por los organoides de CCR derivados de PDX marcados con lentivirus GFP en el bazo de un ratón inmunodeficiente. Las micrometástasis cancerosas que colonizan otros órganos se pueden detectar utilizando un microscopio de fluorescencia para evaluar la expresión de GFP.

Establecimiento de un modelo experimental de metástasis en ratones: implantación de células organoides que expresan GFP en el modelo PDX para detectar micrometástasis

El video describe la técnica de inyección intracónica de células cancerosas para desarrollar un modelo de ratón ortotópico con tumores altamente uniformes. Por lo tanto, el modelo ortotópico de ratón permite una simulación realista de la metástasis, proporcionando una herramienta valiosa para estudiar los cambios fenotípicos durante el crecimiento y la diseminación del tumor.

Inyección de células tumorales trazadas: una técnica para administrar células cancerosas para establecer un modelo de ratón de cáncer colorrectal ortotópico

Este video describe un protocolo detallado para aislar células tumorales circulantes de la muestra de sangre completa de un modelo de ratón con tumor colorrectal eutanasiado. Estos CTC aislados se pueden cultivar y utilizar para el análisis posterior previsto.

Aislamiento de CTC a partir de una muestra de sangre completa: un método para obtener CTC a partir de un modelo murino de cáncer colorrectal

Se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral. En este artículo, se describe un método para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de la sangre total de un modelo tumoral singénico de ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC).

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Un modelo animal es necesario para descifrar el papel de las células del tumor (CTC) en la promoción de la colonización durante la metástasis del cáncer de pulmón en circulación. Aquí, hemos establecido y realizado con éxito un en vivo ensayo a prueba específicamente el requisito de fibronectina poliméricos (polyFN) Asamblea CTC para la colonización del pulmón.

El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación

El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.

Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

La inyección de organoides de cáncer colorrectal (CCR) en la vena porta genera metástasis hepáticas ricas en estroma. Este modelo de ratón de metástasis hepática del CCR representa una herramienta útil para estudiar las interacciones tumor-estroma y desarrollar nuevas terapias dirigidas al estroma, como las terapias génicas mediadas por virus adenoasociadas.

Inyección en la vena porta de organoides de cáncer colorrectal para estudiar la metástasis hepática del estroma

Este protocolo describe la implantación ortotópica de células cancerosas derivadas del paciente en la pared del ciego de ratones inmunodeficientes. El modelo recapitula la enfermedad metastásica del cáncer colorrectal avanzado y permite la evaluación de nuevos fármacos terapéuticos en un escenario clínicamente relevante de metástasis pulmonares y hepáticas.

La implantación ortotópica de células cancerosas derivadas de pacientes en ratones recapitula el cáncer colorrectal avanzado

Aprenda a aislar células tumorales circulantes en un modelo ortotópico de cáncer colorrectal en ratones. Esta técnica microquirúrgica permite generar tumores reproducibles para estudiar metástasis y progresión tumoral.

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

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