Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

El objetivo general de esta técnica microquirúrgica es inyectar células tumorales colorrectales en la pared cecal para inducir tumores colorrectales reproducibles y metastásicos en ratones. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la biología de células tumorales circulantes, sus principales ventajas son los tumores altamente reproducibles y uniformes, lo que permite una predicción confiable de la etapa y la predicción de células tumorales circulantes. Comience usando fórceps atraumáticos para exteriorizar cuidadosamente el ciego de un ratón inmunodeprimido de seis a ocho semanas de edad.

Colocar el extremo ciego del ciego en el abdomen de modo que la bolsa apunte cranealmente. Para la inyección intracecal, monte una jeringa estándar de un mililitro equipada con una canella de calibre 30 y cárguela con las células tumorales en una bomba de microinyección que está montada en un micromanipulador. A continuación, utilice las pinzas atraumáticas para agarrar con cuidado la punta del ciego y utilice una segunda pinza, humedecida con solución salina tibia para alisar suavemente el ciego con movimientos descendentes.

Ahora mueva al animal bajo un microscopio quirúrgico binocular y con la canella directamente paralela y por encima del ciego, use dos pinzas atraumáticas para estirar cuidadosamente el tejido en ambos extremos del extremo exteriorizado del ciego. Tire lentamente del ciego sobre la canella, teniendo cuidado de no perforar todo el cinturón de la pared o la serosa más allá del punto inicial de penetración y coloque la canella por encima de los vasos sanguíneos y debajo de la delgada membrana translúcida dentro del cinturón de la pared. Cuando la canella esté en su lugar, use un interruptor de pie para inyectar 20 microlitros de células durante un período de 20 segundos.

Entre el fino revestimiento translúcido de serosa, por encima de los vasos sanguíneos intramurales y la musculatura. Cuando se hayan inyectado todas las células, retire con cuidado la canella y coloque un intercambio seco debajo del ciego. Para evitar la diseminación peritoneal artificial, lisar las células filtradas con un enjuague abundante con agua destilada y devolver suavemente el ciego a la cavidad abdominal.

Cierre la pared abdominal con suturas de rápida absorción, en la piel con clips quirúrgicos para heridas. A continuación, coloque el ratón sobre una alfombrilla calefactora ajustada a 38 grados centígrados con supervisión hasta la decúbito completo. Para aislar las células tumorales circulantes, en el punto final experimental apropiado, llene tubos cónicos de 15 mililitros con cinco mililitros de medio de gradiente de densidad por tubo y transfiera cuidadosamente muestras de sangre completa recolectadas de animales portadores de tumores a las capas de gradiente de densidad.

Separe las células por centrifugación y recupere cuidadosamente la interfaz que contiene las células mononucleares. Pipetee las células mononucleares en un nuevo tubo de 15 mililitros para una segunda centrifugación. Seguido de lavados de tubos en PBS.

Después del segundo lavado, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de PBS, suplementado con EDTA y agregue cuatro microlitros de anticuerpo anti amp camp a cada muestra, para una incubación de 20 minutos en hielo en la oscuridad. A continuación, utilice un bolígrafo de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo de aproximadamente un centímetro en una placa de Petri estéril de seis centímetros por muestra y añada 700 microlitros de tampón de recogida a cada círculo, seguidos de 50 microlitros de suspensión celular. Use un microscopio para verificar la densidad de las células y deje que las muestras se asienten durante unos cinco minutos.

A continuación, examine la gota de células para comprobar la positividad del campo de amperaje y utilice el micromanipulador para transferir las células de interés a 15 microlitros del tampón adecuado para el análisis posterior previsto. El uso de células colorrectales en este modelo, da como resultado confiables ratones más abundantes dentro de los 35 días posteriores a la inyección de células tumorales, con los tumores primarios midiendo alrededor de 10 milímetros de tamaño, y con metástasis hepáticas, pulmonares y células tumorales circulantes, casi invariablemente presentes. Además, las células tumorales circulantes se pueden aislar fácilmente para su análisis posterior.

Una vez dominada y si se realiza correctamente, esta técnica se puede realizar en 10 minutos, facilitando la formación de tumores uniformes y metastásicos que pueden ser utilizados tanto para estudios terapéuticos como moleculares. Las limitaciones del modelo incluyen su dependencia de la lisis celular, que tiene sus propias limitaciones, así como la inmunodeficiencia de los ratones, las cuales pueden superarse mediante el uso de células mutantes de cáncer colorrectal. Debido a su simplicidad, este modelo puede ser un valioso apéndice a los modelos actualmente disponibles de cáncer colorrectal.