Culturas de rebanada Hippocampal Organotypic como un modelo para estudio neuroprotección e invasividad de las células tumorales

Preparación y corte con un vibrátomo. Se necesitan tres bloques de agar para estabilizar el cerebro durante el procedimiento de corte. Para evitar contaminación, utilice un juego de instrumentos autoclavado.

Retire el agar. Debe secarse sobre papel de filtro antes de pegarlo en la placa de metal con pegamento médico de cianoacrilato. Mediante una espátula, retire el cerebro y colóquelo cuidadosamente en la placa de Petri llena con medio de preparación.

A continuación, seque brevemente el cerebro sobre papel de filtro. Cubra la placa metálica con pegamento médico de cianoacrilato. Utilice la pinza y la espátula para colocar el cerebro en el soporte de la muestra.

Utilice los dos trozos de agar preparados previamente para garantizar la estabilidad mecánica desde ambos lados. En este punto, el cerebro debe colocarse junto al bloque de agar y estabilizarse con dos bloques adicionales para prevenir daños durante el corte. Coloque la placa metálica en el vibratomo y cubra el tejido con medio de preparación frío.

Posteriormente, seccione el tejido horizontalmente en OHSC de 350 micrómetros de grosor utilizando un vibrátomo deslizante. Transfiera las secciones a la placa de Petri, utilizando la parte posterior de una pipeta Pasteur rota para recogerlas. Mantenga las secciones cerebrales en medio de preparación frío.

Evalúe los cortes ópticamente con un microscopio binocular. Separe la región del hipocampo y entre en la corteza interna utilizando un escalpelo con una hoja redonda de tamaño 15. Es importante tomar solo aquellos cortes con citoarquitectura intacta, aislados de la parte media del hipocampo entre el hipocampo dorsal y el ventral.

Los OHSC de baja calidad deben descartarse inmediatamente. Transfiera dos o tres de las laminillas obtenidas a un inserto de cultivo celular con un tamaño de poro de 0,4 micrómetros. Aspire el medio de preparación desde la parte superior del inserto de cultivo celular utilizando una pipeta de Pasteur.

Coloque el inserto en una placa de cultivo de seis pocillos que contenga un milímetro de medio de cultivo por pocillo. Incube las placas de seis pocillos a 35 grados Celsius en una atmósfera completamente humedecida con 5%CO2 y cambie el medio de cultivo celular cada segundo día. Después de seis días en cultivo para tejido de rata, o 14 días para tejido murino, las reacciones inflamatorias asociadas con el procedimiento de corte se han desvanecido.

Ahora pueden realizarse los experimentos. Resultados representativos para estudios de neuroprotección. La imagen de la parte A muestra OHSC sin lesión mantenidos en medio de cultivo durante nueve días in vitro sin ningún tratamiento, que sirven como cortes control.

Según se confirmó mediante microscopía confocal de barrido con láser, los OHSC de control mostraron una buena preservación neuronal. Las células microgliales positivas para la Isolectina B4 se localizaron principalmente en las capas molecular y plexiforme y exhibieron un fenotipo ramificado. En la capa de células granulares del giro dentado, solo se encontraron muy pocas células microgliales positivas para la Isolectina B4 y prácticamente ningún núcleo positivo para el yoduro de propidio.

Otro conjunto de CHOS, mostrado en la parte B de la imagen, se mantuvo en medio de cultivo durante seis días, y se lesionó con NMDA 50 micromolar durante cuatro horas. Luego se mantuvieron en medio de cultivo durante otros tres días. Tras la lesión con NMDA, se observó una acumulación masiva de microglía activada positiva para Isolectina B4 adherida al sitio de la lesión neuronal, en todas las capas del giro dentado.

El análisis cuantitativo reveló que en la capa de células granulares del giro dentado, el número de microglía positiva para Isolectina B4 era mayor en los CHSO lesio­nados en comparación con las condiciones de control. De manera similar, el número de neuronas degenerativas positivas para yoduro de propidio aumentó considerablemente en la capa de células granulares de los cortes lesio­nados con NMDA. Resultados representativos de estudios sobre invasión tumoral.

Todas las imágenes muestran los resultados de la invasión tumoral SS utilizando OHSC, tomadas con un microscopio confocal de barrido láser. El color rojo marca la arquitectura citológica del OHSC y las células tumorales en verde. La imagen A muestra un patrón de invasión típico para células de glioblastoma U138 que se permitieron invadir durante cuatro días.

Se pueden observar tumores claros, esféricos y bien definidos, y la estructura del CHSO parece estar intacta con un giro dentado y un Cornu Ammonis claramente visibles. La imagen B muestra un patrón de invasión diferente, generado por células de glioblastoma LN229 después de cuatro días. En este caso, los tumores individuales no pueden distinguirse claramente debido a la red formada que cubre la mayor parte del CHSO, aunque la citopatología permanece intacta con un giro dentado y un Cornu Ammonis sin deformar.

Además, se puede concluir que las células LN229 son más invasivas que las células U138. Las imágenes C y D muestran el mismo resultado de invasión tumoral para las células LN229 después de cuatro días de invasión. En el lado izquierdo, se puede observar que la masa tumoral está cubriendo casi todo el campo de visión.

La imagen D muestra la tinción correspondiente con yodo de propidio. En este corte, la citarquitectura ya no está intacta, ya que el cornu ammonis ya no es visible y el giro dentado también está distorsionado. Una posible causa de este resultado podría ser un cultivo de corteza hipocampal orgánica (OHSC) que no estaba completamente intacto al inicio del experimento, un número excesivo de células tumorales aplicadas o un tiempo de invasión demasiado prolongado, lo que provocó la pérdida estructural observada.

Por lo tanto, este tipo de resultados de invasión deben descartarse. Los cultivos organotípicos de cortes de hipocampo representan un muy buen modelo in vitro que refleja la fisiología del cerebro con conexiones neuronales intactas. Dado que a partir de un único modelo se pueden obtener varios cultivos de cortes, es posible probar múltiples condiciones en tejido procedente de un solo animal, y los resultados son altamente reproducibles.

Debido al alto grado de accesibilidad, los cultivos de cortes hipocampales organotípicos son especialmente adecuados para una gran variedad de tipos experimentales. Esto incluye estudios electrofisiológicos y de neurogénesis, pero también experimentos sobre neuroprotección, invasión tumoral e interacciones de células tumorales con tejido cerebral sano.