Culturas de rebanada Hippocampal Organotypic como un modelo para estudio neuroprotección e invasividad de las células tumorales
August 27th, 2017
Las culturas Organotypic rebanada hippocampal (OHSC) representan un modelo en vitro que simula muy bien la situación en vivo . Aquí describimos un vibratome base mejorado rebanar protocolo para obtener rodajas de alta calidad para uso en la evaluación del potencial neuroprotector de nuevas sustancias o el comportamiento biológico de las células tumorales.
Preparación y corte con vibrátomo. Se necesitan tres bloques de agar para estabilizar el cerebro durante el procedimiento de corte. Para evitar la contaminación, utilice un conjunto de instrumentos de autoclave.
Retira el agar. Debe secarse en el papel de filtro antes de pegarlo en la placa de metal con pegamento médico de cianoacrilato. Por medio de una espátula, retire el cerebro y colóquelo con cuidado en la placa de Petri llena de medio de preparación.
A continuación, seca brevemente el cerebro en el papel de filtro. Cubra la placa de metal con pegamento médico de cianoacrilato. Utilice las pinzas y la espátula para colocar el cerebro en el portamuestras.
Utilice las dos piezas de agar previamente preparadas para asegurar la estabilidad mecánica desde ambos lados. En este punto, el cerebro debe colocarse junto al bloque de agar y estabilizarse con dos bloques más para evitar daños durante el corte. Coloque la placa de metal en el vibratomo y cubra el tejido con medio de preparación frío.
A continuación, diseccione el tejido horizontalmente en OHSC de 350 micrómetros de espesor utilizando un vibrátomo deslizante. Transfiera las rodajas a la placa de Petri, utilizando el dorso de una pipeta Pasteur rota para recoger las rodajas. Mantenga las rodajas de cerebro en un medio de preparación frío.
Evalúe las rodajas ópticamente con un microscopio binocular. Separa la región del hipocampo y entra en la corteza interna con un bisturí con una hoja redonda de tamaño 15. Es importante tomar solo aquellos cortes dentro de la citoarquitectura intacta aislados de la parte media del hipocampo entre el hipocampo dorsal y ventral.
Las OHSC de baja calidad deben desecharse inmediatamente. Transfiera dos o tres de las rodajas obtenidas a un inserto de cultivo celular con un tamaño de poro de 0,4 micrómetros. Aspire un medio de preparación desde la parte superior del inserto de cultivo celular con una pipeta Pasteur.
Coloque el inserto en un plato de cultivo de seis pocillos que contenga un milímetro de medio de cultivo por pocillo. Incubar las placas de seis pocillos a 35 grados centígrados en una atmósfera totalmente humidificada con 5% de CO2 y cambiar el medio de cultivo celular cada dos días. Después de seis días en cultivo para tejido de rata, o 14 días para tejido murino, las reacciones inflamatorias asociadas con el procedimiento de corte en sí han desaparecido.
Ahora se pueden realizar experimentos. Resultados representativos para estudios de neuroprotección. La parte A de la imagen muestra el OHSC no lesionado mantenido en medio de cultivo durante nueve días in vitro sin que ningún tratamiento sirva como cortes de control.
Como lo confirmó la microscopía de barrido con láseres confocal, el OHSC de control mostró una buena preservación neuronal. Las células microgliales positivas para isolectina B4 se localizaron principalmente en las capas molecular y plexiforme y exhibieron un fenotipo ramificado. En la capa celular granular de la circunvolución dentada, solo se encontraron unas pocas células microgliales positivas para isolectina B4 y prácticamente ningún núcleo positivo para yoduro de propidio.
Otro conjunto de OHSC, que se muestra en la parte B de la imagen, se mantuvo en medio de cultivo durante seis días, lesionados con NMDA de 50 micromolares durante cuatro horas. Y se mantuvo en medio de cultivo durante otros tres días. Después de la lesión NMDA, una acumulación masiva de células microgliales positivas para la isolectina B4 activada se adhirió al sitio de la lesión neuronal, a lo largo de todas las capas del giro dentado.
El análisis cuantitativo reveló que en la capa de células granulares del giro dentado, el número de células microgliales positivas para isolectina B4 fue mayor en el OHSC lesionado en comparación con las condiciones de control. De manera similar, el número de neuronas degeneradoras positivas para yoduro de propidio aumentó fuertemente en la capa de células granulares de los cortes lesionados por NMDA. Resultados de muestras para estudios de invasión tumoral.
Todas las imágenes muestran los resultados de la invasión tumoral SS con OHSC que se visualizaron con un microscopio de barrido láser confocal. El color rojo identifica la citoarquitectura de la OHSC y las células tumorales verdes. La imagen A muestra un patrón de invasión típico para las células de glioblastoma U138 a las que se les permitió invadir durante cuatro días.
Se pueden observar tumores claros, esféricos y distinguidos, y la estructura del OHSC parece estar intacta, con un giro dentado claramente visible y Cornu Ammonis. La imagen B muestra un patrón de invasión diferente, generado por las células de glioblastoma LN229 después de cuatro días. En este caso, los tumores individuales no se pueden distinguir claramente debido a la red formada que cubre la mayor parte del OHSC, aunque la citoarquitectura permanece intacta con un giro dentado no deformado y Cornu Ammonis.
Además, se puede concluir que las células LN229 son más invasivas que las células U138. Las imágenes C y D muestran el mismo resultado de invasión tumoral para las células LN229 después de cuatro días de invasión. En el lado izquierdo, se puede observar que la masa tumoral cubre casi todo el campo de visión.
La imagen D muestra el teñido correspondiente con yoduro de propidio. En esta diapositiva, la citoarquitectura ya no está intacta, ya que el Cornu Ammonis ya no es visible y el giro dentado también está distorsionado. Una posible razón para tal resultado podría ser un OHSC que no estaba completamente intacto al comienzo de ese experimento, un número demasiado alto de células tumorales aplicadas o un tiempo de invasión demasiado largo que resultó en la pérdida de estructura observada.
Por lo tanto, este tipo de resultados de invasión deben descartarse. Los cultivos organotípicos de cortes de hipocampo representan un muy buen modelo in vitro que refleja la fisiología del cerebro con conexiones neuronales intactas. A partir de un modelo, se pueden obtener varios cultivos de cortes, lo que permite probar múltiples condiciones en el tejido de un animal y los resultados son altamente reproducibles.
Debido al alto grado de accesibilidad, los cultivos organotípicos de cortes de hipocampo son excelentemente adecuados para una multitud de tipos experimentales. Esto incluye estudios electrofisiológicos y de neurogénesis, pero también experimentos sobre neuroprotección, invasión tumoral e interacciones de las células tumorales con tejido cerebral sano.
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Visión general
Los cultivos de cortes de hipocampo organotípicos (OHSC) son un modelo in vitro eficaz que imita de cerca las condiciones in vivo. Este artículo detalla un protocolo basado en vibratoma para producir cortes de alta calidad, que pueden utilizarse para evaluar los efectos neuroprotectores de nuevos compuestos o el comportamiento de células tumorales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Farmacología
Antecedentes
- Los cultivos organotípicos proporcionan un modelo relevante para el estudio del tejido cerebral.
- La preparación de cortes de alta calidad es crucial para la precisión experimental.
- El corte con vibratoma permite secciones de tejido precisas y consistentes.
- Estos cortes pueden utilizarse para evaluar varios fenómenos biológicos.
Propósito del estudio
- Refinar la técnica de corte para una mejor calidad del tejido.
- Facilitar la investigación en neuroprotección y biología tumoral.
- Proporcionar un método confiable para obtener cortes organotípicos.
Métodos utilizados
- Preparación de bloques de agar para la estabilización del cerebro.
- Uso de instrumentos autoclavados para prevenir la contaminación.
- Remoción y colocación cuidadosa del cerebro en medio de preparación.
- Aplicación de pegamento de cianoacrilato médico para asegurar las rebanadas.
Principales resultados
- La técnica de corte mejorada produce cortes organotípicos de alta calidad.
- El protocolo minimiza los riesgos de contaminación durante la preparación.
- Facilita la evaluación de sustancias neuroprotectoras.
- Mejora la comprensión del comportamiento de las células tumorales en el tejido cerebral.
Conclusiones
- El protocolo basado en vibratoma es efectivo para la preparación de cortes.
- Los OHSC pueden utilizarse de manera confiable para varias aplicaciones experimentales.
- Estudios futuros pueden construir sobre este método para explorar la neuroprotección y la biología tumoral.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) provide a physiologically relevant in vitro model for evaluating neuroprotective compounds and tumor cell invasiveness while preserving native hippocampal architecture and neuronal connectivity. This model enables mechanistic de-risking of therapeutic candidates by allowing direct observation of drug effects on neuron-glia interactions and tumor-brain tissue dynamics under controlled conditions. The ability to generate multiple slices from a single animal supports reproducible, multi-condition screening that informs early go/no-go decisions in CNS drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by monitoring neuroprotection and tumor invasion in intact neuronal networks.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative readouts such as microglial activation and neuronal degeneration markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening with preserved cytoarchitecture and electrophysiological activity.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent slice thickness and culture conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant hippocampal microstructure to model CNS pathophysiology and therapeutic response.
- Operational Value: Facilitates translational continuity by enabling longitudinal monitoring of neuroprotective and anti-invasive effects.
Pipeline & Workflow Integration
OHSC bridge early discovery and preclinical evaluation by providing a scalable platform for assessing neuroprotective efficacy and anti-invasive properties of tumor-targeting agents prior to in vivo studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroprotective and anti-tumor mechanisms in a physiologically contextualized system.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts for compound comparison across multiple experimental conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of microglial activation, neuronal survival, and tumor infiltration patterns to inform structure-activity relationships.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by modeling human-relevant brain tissue interactions and barrier integrity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for iterative testing of diverse therapeutic modalities across discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neuroprotection and tumor invasion studies.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through reproducible slice generation and culture protocols.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling multi-condition testing per animal and reducing reliance on in vivo models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS and oncology candidates based on target engagement and phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, vibratome sectioning, and sterile culture techniques.
- Depends on access to a vibratome, sterile instrumentation, and controlled incubation environments (35°C, 5% CO2).
- Necessitates cross-team standardization of slice quality assessment and imaging protocols for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different species (rat vs. mouse) or tumor cell lines with varying invasiveness.
- Limited by the absence of vascular and immune components, which may affect modeling of neuroinflammatory processes dependent on peripheral immune cell recruitment.
