Synucleins α-β y γ recombinante estimulan actividad proteína fosfatasa 2A subunidad catalítica en ensayos libres de la célula
13 de agosto de 2017
Esta publicación presenta un protocolo que muestra cómo medir la actividad de la subunidad catalítica de una 2A de fosfatasa proteína recombinante (PP2Ac) en respuesta a recombinante α-sinucleína, β-sinucleína o γ-sinucleína proteínas usando un simple análisis colorimétrico. Mostramos resultados con respecto a α-sinucleína especificidad hacia PP2Ac en cerebro de ratón.
Las sinucleínas alfa, beta y gamma recombinantes estimulan la actividad de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 2A en ensayos libres de células. Hola, mi nombre es Sovanarak Lek. Soy estudiante de medicina en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Texas Tech, El Paso, Escuela de Medicina Paul L. Foster.
En este video, demostraré un ensayo colorimétrico de dos vías de fosfatasa de proteínas utilizando proteínas de sinucleína recombinantes. Preparación de tampones y reactivos. Preparación del tampón de fosfato de p-Nitrofenol.
Para preparar 50 mililitros de tampón pNPP, disuelva la base de Trizma en 25 mililitros de agua desionizada ultrapura en un vaso de precipitados. Añada una barra de agitación limpia y coloque sobre un agitador magnético. Una vez que la Trizma se disuelva, añada cloruro de calcio con agitación continua.
Ajuste el pH a 7,0. Transfiera la solución a un cilindro graduado. Lleve el volumen total final a 50 mils con agua desionizada ultrapura.
Preparación de la solución de verde de malaquita. La solución de verde de malaquita requiere tres soluciones, partes A, B y C. La solución A es ácido clorhídrico cuatro molar. La solución B es una combinación de molibdato de amonio más la solución A. La solución C es oxalato de verde de malaquita al 0,045 %.
Para preparar la solución D, mezcle una parte de B con tres partes de C, en una proporción de uno a tres. Agite durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, filtre la solución D a través de una membrana de 22 micrums y almacénela a cuatro grados Celsius.
Proteger de la luz. Preparación del activador. El activador es una solución al uno por ciento de Tween 20.
Pipetee 10 microlitros de Tween 20 en 990 microlitros de agua desionizada ultrapura. Vortex hasta que el Tween 20 se disuelva completamente. Preparación de la solución de trabajo de verde de malaquita más Tween 20.
Añada el activador a la solución D en una proporción de uno a 100. Preparación del fosfopéptido de treonina. Para preparar una solución stock de pT de 2 mM, agregue 550 microlitros de agua desionizada ultrapura a un miligramo de pT.
Vortex hasta que el fosfopeptido se disuelva completamente. Coloque en hielo para usarlo inmediatamente. Almacene las alícuotas adicionales de pT a menos 20 grados Celsius.
Preparación de la sinucleína. Re_suspenda un miligramo de sinucleína en un mililitro de agua ultrapura desionizada a una concentración final de un miligramo por mililitro. Agite suavemente en vórtex para disolver.
Usar inmediatamente y almacenar las alícuotas no utilizadas a menos 80 grados Celsius. Preparación de patrones de fosfato. Paso uno de la preparación de patrones de fosfato.
Para preparar una solución stock de fosfato 1 mM, disuelva fosfato de potasio en agua desionizada ultrapura en un vaso de precipitados con una barra de agitación. Transfiera a un cilindro graduado y aforé hasta un volumen final de 100 mils. Esta es una solución 10 mM.
Filtre toda la solución a través de un filtro de 22 micras utilizando una jeringa grande. Diluya esto de 1 a 100 para obtener una solución de fosfato de 1 mM que se utilizará como estándar en el ensayo. Fosfato, estándares, paso dos.
Agregue la cantidad adecuada de fosfato más agua desionizada ultrapura a tubos de 1,5 ml según la tabla. Esto producirá tubos con 150, 300, 600, 1 200 y 2 400 pmol de fosfato. Almacene las alícuotas a menos 20 grados Celsius.
Ensayo de actividad de PP2A. Prepare el ensayo de PP2A en tubos de 1,5 ml sobre hielo. Añada 43 microlitros de tampón pNPP.
Añada un microlitro de PP2Ac recombinante humano. Añada sinucleína e incube PP2A más sinucleína durante 30 minutos en un Nutator a cuatro grados Celsius. A continuación, añada 16 microlitros de pT 2 mM.
Incubar durante 10 minutos a 30 grados Celsius en baño de agua. En una placa de 96 pocillos de fondo plano, añadir 25 microlitros de cada estándar de fosfato en duplicado, desde bajo hasta alto. Pipetear 24 microlitros de cada ensayo de PP2A en duplicado sobre la misma placa de 96 pocillos junto con los estándares.
Pipetee 75 microlitros de la solución D que contiene Tween 20 a cada muestra y patrón. Tras la adición de MGT, observará un cambio de color en los pocillos cuando estén presentes fosfatos libres. Análisis fotométrico.
Analice en un espectrofotómetro ajustado a 630 nanómetros. Resultados representativos. Aquí se muestra un ensayo representativo de PP2A y la gráfica que demuestra la curva patrón.
A la izquierda se encuentran los patrones de fosfato. Cuanto más fosfato contengan los pocillos, más oscuro será el tono de verde. A la derecha tenemos PP2A que se incubó con alfa, beta o gamma sinucleínas a diferentes concentraciones molares.
Concentraciones más altas fueron más efectivas para estimular la actividad de la subunidad catalítica de PP2A. Aquí se muestra la representación gráfica de la actividad de PP2A en respuesta a concentraciones variables de alfa-sinucleína, beta-sinucleína y gamma-sinucleína. La alfa-sinucleína, la beta-sinucleína y la gamma-sinucleína fueron todas estimuladoras significativas de la actividad de PP2A a una concentración de uno a dos micromoles.
Solo la alfa-sinucleína y la beta-sinucleína fueron estimuladores significativos de la actividad de PP2A a una concentración de 0,5 micromolar. La figura tres muestra la interacción de PP2Ac con sinucleínas endógenas en el cerebro de ratón. En A, se muestran alfa, beta y gamma sinucleínas recombinantes como controles positivos.
En B, se realizó una co-inmunoprecipitación utilizando el anticuerpo específico para PP2Ac 1D6, que precipitó PP2Ac y también precipitó una cantidad considerable de alfa-sinucleína interaccionante, pero casi ninguna beta-sinucleína. Ninguna gamma-sinucleína se precipitó junto con PP2Ac en la co-inmunoprecipitación. Estos datos de co-inmunoprecipitación sugieren que la alfa-sinucleína es el modulador endógeno de PP2Ac in vivo.
Queremos agradecer a todos los que nos ayudaron en la realización de este video. Por lo tanto, en conclusión, esta es Ruth Pérez. Sonavarak Lek.
Javier Vargas. Le deseo mucho éxito. Adiós y buena suerte.
Resumen
Esta publicación presenta un protocolo para medir la actividad de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 2A recombinante (PP2Ac) en respuesta a las proteínas recombinantes α-sinucleína, β-sinucleína o γ-sinucleína mediante un ensayo colorimétrico. Los resultados indican la especificidad de la α-sinucleína hacia la PP2Ac en el cerebro de ratón.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Biología celular
Antecedentes
- La proteína fosfatasa 2A (PP2A) es una enzima fundamental implicada en diversos procesos celulares.
- Las sinucleínas son una familia de proteínas implicadas en enfermedades neurodegenerativas.
- Comprender la interacción entre las sinucleínas y la PP2A puede proporcionar información sobre sus funciones en la actividad neuronal.
- Los ensayos colorimétricos son eficaces para medir la actividad enzimática in vitro.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para evaluar la actividad de PP2Ac en presencia de sinucleínas.
- Evaluar la especificidad de la α-sinucleína frente a PP2Ac.
- Proporcionar una metodología detallada para investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Preparación de tampones y reactivos para el ensayo colorimétrico.
- Incubación de PP2Ac con concentraciones variables de sinucleínas.
- Medición de la actividad enzimática utilizando un espectrofotómetro.
- Inmunoprecipitación colectiva para evaluar interacciones en muestras de cerebro de ratón.
Resultados principales
- Las tres sinucleínas (α, β, γ) estimularon la actividad de PP2Ac en concentraciones específicas.
- La α-sinucleína mostró la mayor especificidad e interacción con PP2Ac.
- La coinmunoprecipitación indicó que la α-sinucleína es el modulador endógeno principal de PP2Ac.
- Los cambios colorimétricos se correlacionaron con los niveles de fosfato en el ensayo.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado es efectivo para estudiar la actividad de PP2Ac.
- La α-sinucleína es un modulador significativo de PP2Ac in vivo.
- Este estudio mejora la comprensión de las interacciones de la sinucleína en neurobiología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este estudio establece un ensayo libre de células para evaluar la modulación mediada por sinucleína de la actividad de PP2Ac, proporcionando una herramienta mecanicista para la validación de dianas en la investigación de enfermedades neurodegenerativas. Al demostrar que los tres isoformas de sinucleína pueden estimular a PP2Ac in vitro, el método apoya la comprobación de hipótesis sobre la homología funcional conservada y sus implicaciones para la desensibilización de vías. Los datos de coinmunoprecipitación refinan aún más la especificidad de la diana, destacando a la α-sinucleína como el modulador endógeno in vivo, lo cual ayuda a priorizar hipótesis terapéuticas y reducir la ambigüedad mecanicista en las fases iniciales del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas respecto a las interacciones entre sinucleína y PP2Ac en la neurodegeneración.
- Valor científico: Apoya la reducción del riesgo biológico al aclarar si los efectos observados provienen de la modulación directa de la enzima o de vías indirectas.
- Valor científico: Facilita la evaluación de la confianza en el blanco mediante la comparación de la actividad específica por isoforma en un sistema controlado y reproducible.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona una lectura estandarizada y cuantitativa (liberación de fosfato mediante el ensayo con verde de malaquita) para evaluar los efectos de compuestos sobre la actividad de PP2Ac.
- Valor operativo: Utiliza proteínas recombinantes y tampones definidos para garantizar la reproducibilidad del ensayo entre laboratorios y campañas de cribado.
- Valor operativo: Permite la preparación de herramientas biológicas validadas (por ejemplo, curvas de dosis-respuesta) para la evaluación posterior de compuestos y la confirmación de resultados positivos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona hallazgos in vitro con interacciones endógenas observadas en el cerebro de ratón, apoyando la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Valor científico: Ayuda a reducir el riesgo de estrategias de interacción con el blanco al distinguir entre actividad in vitro promiscua y modulación in vivo selectiva.
- Valor operativo: Orienta la selección de modelos preclínicos al indicar qué isoformas de sinucleína probablemente interactúen con PP2Ac en contextos fisiológicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en la fase temprana del descubrimiento, apoyando la validación del blanco y la identificación de compuestos iniciales al proporcionar lecturas cuantitativas basadas en mecanismos que orientan las decisiones de continuar o descartar antes de realizar inversiones significativas en la optimización de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la medición dependiente de la dosis de la activación de PP2Ac por isoformas de sinucleína.
- Tamizaje: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante la preparación estandarizada de reactivos y una señal colorimétrica compatible con formatos basados en placas.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de fosfato que permiten comparar la potencia y eficacia de moduladores en distintas condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se vincula con trabajos preclínicos al validar que los efectos observados in vitro coinciden con interacciones endógenas en tejido cerebral.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar los efectos de moduladores sobre PP2Ac, aplicable más allá de las sinucleínas a otras proteínas reguladoras o moléculas pequeñas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en las afirmaciones sobre la modulación del blanco al proporcionar datos cuantitativos directos sobre la actividad enzimática.
- Valor operativo: Fomenta la estandarización y la reproducibilidad mediante la preparación detallada de reactivos y condiciones de incubación definidas.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de continuar o descartar al reducir la dependencia de biomarcadores indirectos o correlacionados.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en evidencia mecanicista de la participación en la vía.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en bioquímica de proteínas y técnicas de ensayo enzimático, incluyendo el manejo de proteínas recombinantes y la detección de fosforilación.
- Depende del acceso a equipos espectrofotométricos capaces de lecturas de absorbancia a 630 nm y sistemas de incubación con control de temperatura.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de reactivos (por ejemplo, solución de verde de malaquita, tampón pNPP) para garantizar la consistencia del ensayo.
- Implica consideraciones de adaptación al extender el ensayo a sistemas modelo no neuronales o fuentes alternativas de PP2Ac.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de sustratos peptídicos fosforilados frescos y un control estricto de la temperatura durante los pasos de incubación.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:00
Title
0:33
Preparation of Buffers and Reagents
0:38
Preparing p-Nitrophenol Phosphate (pNPP) Buffer
1:21
Preparing Malachite Green Solution
2:21
Preparation of Activator
2:42
Preparing Malachite Green + Tween 20 (MGT) Working Solution
2:58
Preparing Threonine Phosphopeptide (pT)
3:31
Synuclein Preparation
3:59
Preparing Phosphate Standards
4:45
Phosphate Standards Step 2
5:17
PP2A Activity Assay
6:42
Photometric Analysis
6:53
Representative Results
9:01
Conclusion
