Name: Synucleins α-β y γ recombinante estimulan actividad proteína fosfatasa 2A subunidad catalítica en ensayos libres de la célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende a medir la actividad de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 2A (PP2Ac) mediante un ensayo colorimétrico utilizando sinucleínas recombinantes α, β y γ. Este método permite evaluar la especificidad de α-sinucleína hacia PP2Ac en cerebro de ratón.

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Los autores agradecemos los esfuerzos de los miembros del laboratorio previo Kendra Mackett, Sandra Slusher y Jie Chen que han trabajado para optimizar el método. Los autores también agradecen los institutos nacionales de salud, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University salud Ciencias centro El Paso estudiante actividad investigación proyecto (SARP), Lizanell y Colbert Coldwell Fundación, coalición de atrofia de sistema múltiple, Investigación de familia hoy y Anna Mae Doyle regalo fondos de apoyo financiero de esta investigación.

1. preparación de tampones y reactivos
<ol><li>
Preparación del tampón de fosfato (pNFF) del p-NITROFENILO
	<ol>
<li>Preparar 50 mL de tampón de pNFF como sigue.</li>
		<li>Peso base de Tris 0,30285 g (véase la Tabla de materiales) y disolver en 25 mL de agua desionizada ultrapura.<ol>
<li>Añadir 41,6 μl de 120 mM CaCl2. Ajustar a pH 7,0 con 1 M de HCl y el volumen de solución final a 50 mL con agua desionizada ultrapura.</li>
			<li>Asegúrese de que la concentración final es de 50 mM Tris-HCl 100 mM CaCl2, pH 7.0.</li>
			<li>Almacenar el buffer de pNFF en 4 o.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluciones de verde de Malaquita, para preparar el siguiente.
	<ol>
<li>Preparar Solución A agregando 32,8 mL de HCl concentrado a 67,2 mL de agua desionizada ultrapura para crear una solución de HCl de 4 M. Nota: Malaquita solución está preparada en una campana de humos utilizando guantes desechables, mascarilla y gafas de seguridad.</li>
		<li>Preparar la solución B pesa 4,2 g de molibdato de amonio y agregando a 95,8 mL de solución A.</li>
		<li>Preparar la Solución C peso de 0,045 g sal de oxalato de verde de Malaquita y añadiendo agua desionizada ultrapura para llevar el volumen final a 100 mL.</li>
		<li>Preparar Solución D mezcla las soluciones B y C en proporción de 1:3 (v/v), revuelva durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Filtrar la Solución D con una 0,22 μm poro nitrocelulosa membrana filtro unidad de tamaño utilizando una jeringa de 50 mL.</li>
		<li>Almacene la solución preparada de Malaquita a 4 oC protegido de la luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de activador
	<ol>
<li>Para preparar un 1% solución de tween 20, pipetee 10 μl de tween 20 en 990 μl de ultrapura desionizada (v/v) entonces vortex hasta el tween 20 se disuelva por completo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de solución de trabajo de Tween 20 (MGT) de verde de Malaquita.
	<ol>
<li>Mezcle el activador (paso 1.3) con la solución de verde malaquita (solución D, paso 1.2.5) en una proporción de 1: 100 (por ejemplo 1 activador de μl solución de verde de Malaquita de 99 μL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de fosfopéptidos de treonina (KRpTIRR) (pT) sustrato.
	<ol>
<li>Para preparar un lugar común, de 2 mM un frasco de fosfopéptidos de 1 mg en el hielo, añadir 550 μl de agua desionizada ultrapura y agitar suavemente para disolver.<ol>
<li>Hacer ~ 10 alícuotas y almacenar pT a-20oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de sinucleína
	<ol>
<li>Preparar synucleins en una campana de humos utilizando guantes desechables, mascarilla y gafas de seguridad.</li>
		<li>Resuspender 1 mg de sinucleína recombinante en 1 mL de agua desionizada ultrapura para una concentración final de 1 mg/mL.</li>
		<li>Vórtice suavemente para disolver y coloque en hielo.</li>
		<li>Preparar 50 alícuotas de μl y almacenar a-80 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elaboración de normas de fosfato
	<ol>
<li>Preparar la solución madre de fosfatos de 0.1 mM como sigue.<ol>
<li>Peso g 0,1361 KH2PO4 y coloque en un vaso de precipitados con 80 mL de agua desionizada ultrapura. Agregar una barra de agitación y mezcla para disolver. Transferencia de la solución a un cilindro graduado y llevar el volumen final a 100 mL con agua desionizada ultrapura.</li>
			<li>Filtrar la solución completa a través de una 0,22 μm poro nitrocelulosa membrana filtro unidad de tamaño utilizando una jeringa de 50 mL; la concentración final es de 10 mM.</li>
			<li>Diluir la solución (10 mM) 1: 100; la concentración final será fosfato 0,1 mM (PO4) para normas de ensayo.</li>
			<li>Almacenar la solución madre de fosfato a 4 oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vea la tabla 1 para limitar las diluciones que se utilizan para hacer estándares de4 PO con un volumen total final de 1250 μl cada una. Añadir la cantidad apropiada de fosfato y agua desionizada ultrapura a tubos de 1,5 mL según la tabla 1.<ol>
<li>Tienda preparado normas de4 PO-20 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">Normas de fosfato</td>
		</tr>
<tr>
<td>solución de 0.1m m PO4 (mL)</td>
			<td>0</td>
			<td>75</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1.200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua desionizada ultrapura (mL)</td>
			<td>1.250</td>
			<td>1.175</td>
			<td>1.100</td>
			<td>950</td>
			<td>650</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentración final de PO4 [pmol]</td>
			<td>0</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1.200</td>
			<td>2.400</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Estándares de fosfato.
2. PP2A ensayo en respuesta a Synucleins recombinante
Nota: El volumen total final de cada reacción será 60 μL, por lo que el experimentador debe ajustar el volumen inicial de pNFF tampón adecuado para acomodar el volumen de synucleins utilizado para cada muestra. En la mayoría de los casos, el volumen de tampón pNFF será entre 40 y 44 μl.
<ol><li>
Preparar cada reacción de PP2Ac como sigue.
	<ol>
<li>En un tubo de 1,5 mL, añadir 39 μl de tampón de pNFF y lugar en el hielo.</li>
		<li>Añadir 1 μl (105 ng/μl o 0.0007 U/μL) de PP2Ac recombinante humano (rPP2Ac).</li>
		<li>Añadir 4 μL de 0, 1.5, 7.5, 15 o 30 μm synucleins a rPP2Ac en tampón pNFF durante concentraciones finales de 0, 0.1, 0.5, 1.0 y 2.0 μm e incube a 4 ° C por 30 min en una unidad de rotación; el volumen final será 60 μL.</li>
		<li>Después de 30 min, mover las muestras de hielo y agregar 16 μl de sustrato de 2 mM pT.</li>
		<li>Incubar cada mezcla de ensayo de PP2A por 10 min a 30 ° C en un baño de agua con agitación intermitente.</li>
		<li>A una placa de 96 pozos de fondo plano, añadir 25 μl de cada PO4 estándar (0, 150, 300, 600, 1.200 y 2.400 pmol) en pozos duplicados de bajo a alto.</li>
		<li>A continuación añada 25 μl de cada muestra experimental (PP2A ensayo ± sinucleína), preparada en pasos 2.1.1 a 2.1.6, duplicación de pozos en la misma placa de 96 pocillos.</li>
		<li>A continuación, añadir 75 μl de solución de trabajo de la administración a que también contienen estándares y muestras.</li>
		<li>Dejar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
		<li>Observar el cambio en las muestras con diferencias medibles en los niveles de fosfato de un color.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fotométricas análisis
<ol><li>Análisis de la placa de 96 pocillos que contienen estándares y muestras mediante un lector espectrofotométrico con la longitud de onda a 630 nm29.</li>
	<li>Trazar la curva de absorbancia producida (muestras leer a 630 nm) y tenga en cuenta que sigue siendo lineal hasta 2.400 concentración pmol de PO4.</li>
</ol>

<ol><li>Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+alpha-%2C+beta-+and+gamma-synucleins+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS.</a> Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).</li>
<li>Iwai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+precursor+protein+of+non-A+beta+component+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+is+a+presynaptic+protein+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system.</a> Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).</li>
<li>Irizarry, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+precursor+protein+of+the+non-A+beta+component+of+senile+plaques+%28NACP%29+in+the+human+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).</li>
<li>Shibayama-Imazu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+distribution+and+developmental+change+of+neuron+specific+14+kDa+protein+%28phosphoneuroprotein+14%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14).</a> Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).</li>
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<li>George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+protein+regulated+during+the+critical+period+for+song+learning+in+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch.</a> Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).</li>
<li>Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+localization+of+synelfin+%28synuclein%2C+NACP%29+to+presynaptic+terminals+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons.</a> Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).</li>
<li>Greten-Harrison, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphabetagamma-Synuclein+triple+knockout+mice+reveal+age-dependent+neuronal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).</li>
<li>Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+alpha+synuclein+to+neuronal+survival+and+function+-+Implications+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease.</a> J Neurochem. , (2016).</li>
<li>Perez, R. G., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Could+a+loss+of+alpha-synuclein+function+put+dopaminergic+neurons+at+risk%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk?</a> J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).</li>
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<li>Guardia-Laguarta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+Is+Localized+to+Mitochondria-Associated+ER+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes.</a> J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).</li>
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<li>Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).</li>
<li>Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Lewy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">100 years of Lewy pathology.</a> Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Alerte, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+aggregation+alters+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+and+immunoreactivity%3A+lessons+from+viral+transduction+of+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice.</a> Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).</li>
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<li>Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwingle%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).</li>
</ol>

Dr. Pérez fue miembro de la Facultad en el Departamento de Neurología de la Facultad de medicina de la Universidad de Pittsburgh desde 1999 – 2011.

Este ensayo de verde de Malaquita con pT se utilizó para medir la actividad de PP2Ac porque es más fácil de realizar que el método clásico que utiliza substratos marcado con P 32. Otra ventaja de este ensayo sobre los ensayos radiactivos es que radioisótopos suponen cierto riesgo y pueden ser costosos, especialmente 32P etiquetados las moléculas que tienen una vida media corta, que limita el número de ensayos se puede realizar antes de vencen de reactivos. Utilizar verde de Malaquita en lugar de radiactividad también elimina la necesidad de disponer de 32residuos P. Ensayos de verde de Malaquita son también muy sensibles al medir la actividad de fosfatasas de serina/treonina en comparación con un ensayo colorimétrico que utiliza el sustrato p-nitrophenylphosphate (pNFF), que es no selectivo, como puede ser defosforilaciones por un amplio número de enzimas32.
Kits comerciales verde de Malaquita para medir actividad de PP2A han estado disponibles por algún tiempo y fueron utilizados previamente en el laboratorio. Sin embargo, al hacer muchos ensayos de verde de Malaquita, estos kits se convirtió en prohibitivos. Además, kits comerciales para la actividad de PP2A son estables solamente por un año, mientras que tener disponible en los reactivos en polvo forma y con almacenamiento adecuado, proporcionan los componentes del ensayo disponibles que son estructuralmente estables durante largos períodos de tiempo.
Antes de la prueba bSyn y gSyn, vinagre fue utilizado como control positivo para estimular la actividad de PP2Ac y para determinar la cantidad de PP2Ac requeridos para los ensayos y también para confirmar que siendo datos resultantes de la escala con la curva estándar (150-2400 pmol de PO4 ). Es de destacar que si el vinagre estimula la PP2Ac demasiado fuertemente, aunque la reacción es típicamente lineal, datos se apagarán la escala y precipitan sustancias químicas en la solución MGT, haciendo imposible medir cantidades precisas de lanzado PO libre4 con una placa de lector.
Dado que el vinagre contribuye a PP2Ac actividad en vivo y en vitro12,19,21,23,25y que todos synucleins tienen homología considerable, había sido la hipótesis de que todos los miembros de familia de sinucleína pueden ser capaces de estimular la PP2Ac en ensayos libres de la célula. Mediante el ensayo colorimétrico descrito aquí, se encontró que de hecho, todas tres synucleins recombinantes (vinagre, bSyn, gSyn) estimula la actividad de PP2Ac, levantando la posibilidad que todos tres synucleins puede llevar a cabo funciones similares en el sistema nervioso. Sin embargo, cerebro de la enfermedad de Parkinson o demencia con cuerpos de Lewy casos tienen menos actividad de PP2Ac en los tejidos que contienen altamente agregado vinagre23. Tejidos de ratón albergar Lewy cuerpo-como patología también exhiben reducen PP2Ac actividad25. Esto, y nuevos datos en la figura 3 , así como datos previos de aSyn nocaut ratones12, sugiere que ni bSyn ni gSyn típicamente puede compensar por la pérdida de aSyn soluble en cerebro, o alternativomente que los homólogos de sinucleína pueden no asociado con PP2Ac tan fuertemente como aSyn como se muestra (figura 3). El Atlas Allen del cerebro muestra colocalización de todos tres mRNAs de sinucleína en muchas áreas del cerebro, y aunque ratones knockout de sinucleína triple ha generado9,33, PP2Ac actividad no ha sido evaluada en ese modelo. Curiosamente, vinagre que es fosforilado en Ser129 por el Polo-como quinasa 2, es menos capaz de activar PP2Ac12, pero se muestra aquí para bSyn las pruebas indican que la fosforilación bSyn es poco probable que impacto actividad PP2Ac, como bSyn muy poco se vino con PP2Ac en cerebro de ratón (figura 3). Tomados en conjunto, los datos sugieren que endógeno PP2Ac moduladores de la actividad, como vinagre, probablemente contribuyen a bienestar y enfermedad.
El protocolo descrito aquí es una simple pero poderosa técnica para determinar la capacidad de PP2Ac al dephosphorylate un sustrato de fosfopéptidos en respuesta a diversos tratamientos. Por ejemplo, puede utilizarse esta misma metodología a prueba otros activadores de PP2Ac, como ceramidas y potencial terapéutica novela34, o para evaluar el impacto de los inhibidores de la PP2Ac en vitro. También es importante señalar que análisis similares pueden medir la actividad del PP2Ac que ha sido aislado por 1 6 inmunoprecipitación de extractos celulares o tejidos del cuerpo, como se ha descrito por los autores12,19, 25. aplicaciones de futuro para el ensayo de malaquita verde existen más allá de la medición de la actividad PP2Ac, como actividad de ATP también puede ser determinado mediante un ensayo de tal.
Tenga en cuenta que se debe generar una curva estándar cada vez para cada ensayo independiente del PP2Ac. Es obligatorio para garantizar que todos los reactivos utilizados son fosfato libre, como libres fosfatos artificialmente aumentan la señal de fondo y producen resultados erróneos. En el día de la prueba es esencial preparar suficiente solución MGT fresca para todas las muestras a ensayarse. También, MGT es solamente buena el día en que se hace y tiende a precipitar después de unas horas. PP2Ac de adquirir de un vendedor deben ser alicuotados y almacenado congelado poco después de que se recibe para evitar ciclos de descongelación de congelación que reducen su actividad. Como otras fosfatasas pueden dephosphorylate el sustrato de pT (e.g. PP1 y PP535), al analizar los extractos de célula o tejido en el que PP2Ac no ha sido aislado por inmunoprecipitación, muestras deben pasarse sobre las columnas para eliminar fosfatos libres y específicos inhibidores de fosfatasas deben utilizarse para confirmar la especificidad de la fosfatasa, como se describió anteriormente18.

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Erratum: Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

Estudios definir la distribución de synucleins en cerebro y médula espinal que todos tres synucleins están enriquecidos en los tejidos neuronales, aunque diferentes patrones de localización se han reportado1. Por ejemplo, vinagre es más abundante en los sitios presinápticos en la corteza cerebral y ganglios basales2,3, bSyn tiene una distribución más uniforme en el cerebro y la médula espinal4,5y gSyn es más abundante en la médula espinal y los ganglios periféricos6. Aunque puede ocurrir alguna expresión embrionaria de todos synucleins, los tres homólogos se convierten en más abundantes durante el período neonatal4,5,6,7,8. Sorprendentemente, los datos de sinucleína triple nocaut ratones, indican que la pérdida de todos los tres synucleins causas edad Inicio disfunción neuronal9, sinucleína importantes funciones de apoyo en el sistema nervioso central (SNC)10, 11. no se sabe todavía si sinucleína triple nocaut ratones muestran cambios en la distribución de PP2Ac o actividad. Datos de ratones knockout de sinucleína solo revelan que la pérdida de vinagre solo es capaz de reducir significativamente la actividad de PP2Ac en cerebro12. Además del CNS, synucleins todos localizar a otros tejidos en el cuerpo13,14,15.
Debido a sus vínculos genéticos bien establecidos con neurodegeneración16,17, aSyn es uno de los mejores estudiado de las tres synucleins. El laboratorio Perez ha trabajado mucho tiempo para definir las actividades funcionales normales del vinagre, especialmente en el CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 y más recientemente en los tejidos periféricos24,25. Entre éstos, fue el descubrimiento que vinagre juega un papel regulador clave en el estimulante PP2Ac actividad19. PP2A actividad contribuye ampliamente a la función normal del cerebro, incluyendo la regulación de la producción de dopamina26. El holoenzyme PP2A consta de tres subunidades independientes, la subunidad catalítica de la C, PP2Ac, una subunidad de andamios A y uno de varios regulador/dirigido a B subunidades diferentes que ayudan a localizar PP2A a microdominios subcelulares específicos, proporcionando así PP2A diversidad funcional27. Evidencia muestra que las interacciones de vinagre con PP2Ac contribuyen significativamente a su fosfatasa actividad in vitro e in vivo12,19,21,23, 25. Cuando el vinagre se acumula en los agregados de proteína, como lo hace cuando Lewy cuerpos forma dentro de las neuronas de la enfermedad de Parkinson y demencia con cuerpos de Lewy (DLB), tejidos con vinagre agregado han disminuido PP2Ac actividad23,25, cuando niveles de aSyn soluble disminuyen. Dado que todos tres synucleins tienen homología significativa28 (aSyn comparte identidad de 66% con bSyn y el 56% con gSyn) y ese vinagre contribuye a la activación de PP2Ac, fue presumido que todos los miembros de la familia de proteínas de sinucleína pueden ser capaces aumentar la actividad de PP2Ac, al menos en vitro. Para evaluar esto, PP2Ac la actividad fue medida en respuesta a recombinante aSyn, bSyn y gSyn usando un simple análisis colorimétrico, modelado después del método de Fathi et al. 29. este método y los nuevos hallazgos se detallan en este documento.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T15003</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (cloruro de calcio)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp; &nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>9535-33</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td></td></tr><tr><td>Sal de oxalato verde de malaquita</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6880</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Fosfopéptido de treonina (KRpTIRR)</td><td>Péptido de Nueva Inglaterra LLC</td><td>BP12-011</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 ( fosfato de potasio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Subunidad PP2A C humana recombinante</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td></td><td></td>10011237</tr><tr><td>S-sinucleína humana recombinante</td><td>rPéptido</td><td>S-1001-2</td><td></td></tr><tr><td>Íptido de &beta;-sinucleína humana recombinante</td><td>S-1003-2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPéptido</td><td>de &gamma;-sinucleína humana recombinante</td><td>S-1007-2</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac 1D6 Anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>05-421</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac Novus</td><td>Biologicals</td><td>NB100-92217</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo aSyn C-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo bSyn EP1537Y</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-79903</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo gSyn E-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10698</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de desalinización de espín Zeba, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo/SoftwareLector de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>placas de espectro multiskan</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>Medidor de</td></tr><tr><td>pH 51118650</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-636-AB15P</td><td></td></tr></tbody></table>

synucleins α-β y γ recombinante estimulan actividad proteína fosfatasa 2a subunidad catalítica en ensayos libres de la célula

Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

(Vinagre) de α-sinucleína, β-sinucleína (bSyn) y γ-sinucleína (gSyn) son miembros de una familia conservada de proteínas chaperonas-como que son altamente expresada en los tejidos neuronales vertebrados. De las tres synucleins, sólo vinagre se ha implicado fuertemente en trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y atrofia del sistema múltiple. En el estudio de función de vinagre normal, los datos indican que vinagre estimula la actividad de la subunidad catalítica de una enzima dephosphorylating abundantemente expresado, PP2Ac in vitro e in vivo. Datos anteriores muestran que aSyn agregación en cerebro humano reduce PP2Ac actividad en regiones con patología del cuerpo de Lewy, donde aSyn soluble se ha convertido en insoluble. Sin embargo, porque todos tres synucleins tienen considerable homología en las secuencias del aminoácido, experimentos fueron diseñados para probar si todo puede modular la actividad de PP2Ac. Usando synucleins recombinantes y proteínas recombinantes de la PP2Ac, actividad se evaluó por análisis colorimétrico de verde de Malaquita. Los datos revelaron que todos tres synucleins recombinantes estimula la actividad de PP2Ac en los ensayos libres de células, levantando la posibilidad que la homología conservada entre synucleins puede dotar todos tres homólogos con la capacidad de atar a y activar el PP2Ac. Sin embargo, los datos de co-inmunoprecipitación, sugieren que PP2Ac modulación probablemente ocurre mediante interacciones endógenas entre vinagre y PP2Ac en vivo.

Actividad y función de la proteína pueden modificarse por modificación post traduccional, como fosforilación. Muchas proteínas pueden ser fosforiladas por una quinasa o defosforilaciones por una fosfatasa. En el caso de la proteína fosfatasa 2A (PP2A), esta fosfatasa multisubunit facilita la desfosforilación de residuos de serina y treonina de un amplio número de fosfoproteínas. Actividad anormal de la PP2A puede conducir a la desregulación de la función de la proteína que se produce en muchas enfermedades, incluyendo la enfermedad de Parkinson donde vinagre puede llegar a ser hiperfosforilada, y en la enfermedad de Alzheimer, donde la proteína tau puede llegar a ser hiperfosforilada. Esto proporcionó la justificación para la optimización de un procedimiento interno para rápidamente evaluar PP2Ac actividad y determinar si anormal actividad PP2Ac puede conducir a la disfunción celular.
Usando este ensayo colorimétrico sin células, la actividad fue medida mediante la cuantificación de la cantidad de libre PO4 PP2Ac troceados del substrato de pT (figura 1A) y en comparación con cantidades conocidas picomolar PO4 en la curva estándar (figura 1B ). PP2Ac actividad se midió también en respuesta a 0.0, 0.1, 0.5, 1.0 y 2,0 μm synucleins (figura 1A), en comparación con la actividad de PP2Ac de base en la ausencia de la sinucleína añadido (en la flecha grande en la figura 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig1.jpg"> Figura 1 : Activación de PP2A de synucleins recombinante, se mide en relación con niveles conocidos de fosfato en los estándares de. En (A) vinagre, bSyn y gSyn fueron evaluados en un rango de 0 - 2 μm concentraciones de proteínas, a comparar con 0 - 2400 pmol PO4 normas. (B) una curva estándar para el ensayo de PP2Ac de verde de Malaquita se generó para proporcionar cantidades conocidas de fosfato que pueden calcularse los valores obtenidos en condiciones experimentales. En todos los casos, cuando aumenta la actividad de PP2Ac, la cantidad de libre PO4 troceados del substrato pT aumenta y produce un color verde más oscuro. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los resultados muestran que además de synucleins a PP2Ac en el paso de incubación inicial podrían aumentar la cantidad de libre PO4 medido, lo que demuestra el aumento de la actividad PP2Ac. El análisis estadístico después de muchas repeticiones que todas tres synucleins recombinantes (vinagre, bSyn, gSyn) aumentar significativamente la actividad de PP2Ac (figura 2). Estos resultados sugieren que cambios en la cantidad de synucleins celulares solubles pueden alterar la actividad de la PP2Ac; y por lo tanto puede afectar la homeostasis celular. No se sabe, sin embargo, si todos tres synucleins contribuyen a la activación de PP2Ac en vivo, aunque los datos en la figura 3 sugieren que probablemente vinagre contribuye a la actividad PP2Ac en vivo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig2.jpg"> Figura 2 : PP2Ac actividad es estimulada por los tres synucleins. Se muestra la representación gráfica de PP2Ac de activación en respuesta a diversas concentraciones de recombinante aSyn, bSyn o gSyn. Todas tres synucleins recombinantes estimula actividad de PP2Ac. Vinagre en la mayoría de los experimentos parece ser ligeramente más potente, aunque ANOVAs realizados utilizando el software estadístico fueron notablemente similares en general. Los datos representan la media ± SEM de 4-9 experimentos independientes. ns, no significativo; p < 0.05; p < 0.01; p < 0.0001. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para determinar qué synuclein(s) puede interactuar con PP2Ac en cerebro, ensayos de co-inmunoprecipitación (Co-IP) se realizaron con cerebro de ratón de tipo salvaje y el PP2Ac--anticuerpo específico, 1 6. Las proteínas entonces se separaron por SDS-PAGE y lacras fueron sondeados para PP2Ac, vinagre, bSyn y gSyn usando métodos establecidos19. Controles de sinucleína recombinantes demuestran aSyn, bSyn y gSyn especificidad de anticuerpo (Figura 3A). Datos Co-IP revelan que los principales sinucleína asociada PP2Ac en cerebro fue vinagre, mucho menos bSyn se vino abajo en el co-PI (figura 3B), ya no gSyn descendió en la Co-IP (datos no mostrados). Esto sugiere un papel distintivo para aSyn endógeno en la regulación de PP2Ac en cerebro. Además, se plantea la posibilidad que la modulación de PP2Ac con bSyn-base-terapias podría tener potencial para restaurar la actividad de PP2A en aquellos con sinucleinopatía, como bSyn es conocido por ser nonamyloidogenic sin embargo, como se muestra aquí puede estimular PP2Ac30, 31.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2.jpg"> Figura 3: Interacción del PP2Ac con synucleins endógeno en cerebro de ratón. (A) recombinante aSyn, bSyn y gSyn fueron sondeados con anticuerpos específicos sinucleína como se describe a continuación. (B) usando el ratón homogeneizado de cerebro Co-IP fue realizada con el anticuerpo 1 6, luego las muestras fueron analizadas en immunoblots. Se muestran datos para bSyn, PP2Ac y vinagre, pero no para gSyn que no Co-IP con PP2Ac. Inicio muestras muestran niveles relativos de PP2Ac (carril 1), vinagre (carril 4) y bSyn (carril 7) en homogenados inicial. Muestras finales muestran los niveles de PP2Ac (carril 2), vinagre (carril 5) y bSyn (carril 8) en homogenados después del 6 1 PP2Ac Co-IP. Niveles significativos de PP2Ac fueron immunoprecipitated utiliza 6 1 anticuerpo (carril 3), que también derribó una amplia cantidad de vinagre (carril 6, en flecha) pero muy poco bSyn (carril 9, sobreexpuesta fuertemente para mostrar bSyn débil señal, en flecha). * Asteriscos y soportes de señales marca la inespecífica en borrones. Ver la Tabla de materiales para obtener más información sobre anticuerpos utilizados. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Esta publicación presenta un protocolo que muestra cómo medir la actividad de la subunidad catalítica de una 2A de fosfatasa proteína recombinante (PP2Ac) en respuesta a recombinante α-sinucleína, β-sinucleína o γ-sinucleína proteínas usando un simple análisis colorimétrico. Mostramos resultados con respecto a α-sinucleína especificidad hacia PP2Ac en cerebro de ratón.

Synucleins α-β y γ recombinante estimulan actividad proteína fosfatasa 2A subunidad catalítica en ensayos libres de la célula

&#945;-Synuclein (aSyn), &#946;-Synuclein (bSyn), and &#947;-Synuclein (gSyn) are members of a conserved family of chaperone-like proteins that are highly ...

Las sinucleínas alfa, beta y gamma recombinantes estimulan la actividad de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 2A en ensayos libres de células. Hola, mi nombre es Sovanarak Lek. Soy estudiante de medicina en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Texas Tech, El Paso, Escuela de Medicina Paul L. Foster.En este video, demostraré un ensayo colorimétrico de dos vías de fosfatasa de proteínas utilizando proteínas de sinucleína recombinantes. Preparación de tampones y reactivos. Preparación del tampón de fosfato de p-Nitrofenol.Para preparar 50 mililitros de tampón pNPP, disuelva la base de Trizma en 25 mililitros de agua desionizada ultrapura en un vaso de precipitados. Añada una barra de agitación limpia y coloque sobre un agitador magnético. Una vez que la Trizma se disuelva, añada cloruro de calcio con agitación continua.Ajuste el pH a 7,0. Transfiera la solución a un cilindro graduado. Lleve el volumen total final a 50 mils con agua desionizada ultrapura.Preparación de la solución de verde de malaquita. La solución de verde de malaquita requiere tres soluciones, partes A, B y C. La solución A es ácido clorhídrico cuatro molar. La solución B es una combinación de molibdato de amonio más la solución A. La solución C es oxalato de verde de malaquita al 0,045 %.Para preparar la solución D, mezcle una parte de B con tres partes de C, en una proporción de uno a tres. Agite durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, filtre la solución D a través de una membrana de 22 micrums y almacénela a cuatro grados Celsius.Proteger de la luz. Preparación del activador. El activador es una solución al uno por ciento de Tween 20.Pipetee 10 microlitros de Tween 20 en 990 microlitros de agua desionizada ultrapura. Vortex hasta que el Tween 20 se disuelva completamente. Preparación de la solución de trabajo de verde de malaquita más Tween 20.Añada el activador a la solución D en una proporción de uno a 100. Preparación del fosfopéptido de treonina. Para preparar una solución stock de pT de 2 mM, agregue 550 microlitros de agua desionizada ultrapura a un miligramo de pT.Vortex hasta que el fosfopeptido se disuelva completamente. Coloque en hielo para usarlo inmediatamente. Almacene las alícuotas adicionales de pT a menos 20 grados Celsius.Preparación de la sinucleína. Re_suspenda un miligramo de sinucleína en un mililitro de agua ultrapura desionizada a una concentración final de un miligramo por mililitro. Agite suavemente en vórtex para disolver.Usar inmediatamente y almacenar las alícuotas no utilizadas a menos 80 grados Celsius. Preparación de patrones de fosfato. Paso uno de la preparación de patrones de fosfato.Para preparar una solución stock de fosfato 1 mM, disuelva fosfato de potasio en agua desionizada ultrapura en un vaso de precipitados con una barra de agitación. Transfiera a un cilindro graduado y aforé hasta un volumen final de 100 mils. Esta es una solución 10 mM.Filtre toda la solución a través de un filtro de 22 micras utilizando una jeringa grande. Diluya esto de 1 a 100 para obtener una solución de fosfato de 1 mM que se utilizará como estándar en el ensayo. Fosfato, estándares, paso dos.Agregue la cantidad adecuada de fosfato más agua desionizada ultrapura a tubos de 1,5 ml según la tabla. Esto producirá tubos con 150, 300, 600, 1 200 y 2 400 pmol de fosfato. Almacene las alícuotas a menos 20 grados Celsius.Ensayo de actividad de PP2A. Prepare el ensayo de PP2A en tubos de 1,5 ml sobre hielo. Añada 43 microlitros de tampón pNPP.Añada un microlitro de PP2Ac recombinante humano. Añada sinucleína e incube PP2A más sinucleína durante 30 minutos en un Nutator a cuatro grados Celsius. A continuación, añada 16 microlitros de pT 2 mM.Incubar durante 10 minutos a 30 grados Celsius en baño de agua. En una placa de 96 pocillos de fondo plano, añadir 25 microlitros de cada estándar de fosfato en duplicado, desde bajo hasta alto. Pipetear 24 microlitros de cada ensayo de PP2A en duplicado sobre la misma placa de 96 pocillos junto con los estándares.Pipetee 75 microlitros de la solución D que contiene Tween 20 a cada muestra y patrón. Tras la adición de MGT, observará un cambio de color en los pocillos cuando estén presentes fosfatos libres. Análisis fotométrico.Analice en un espectrofotómetro ajustado a 630 nanómetros. Resultados representativos. Aquí se muestra un ensayo representativo de PP2A y la gráfica que demuestra la curva patrón.A la izquierda se encuentran los patrones de fosfato. Cuanto más fosfato contengan los pocillos, más oscuro será el tono de verde. A la derecha tenemos PP2A que se incubó con alfa, beta o gamma sinucleínas a diferentes concentraciones molares.Concentraciones más altas fueron más efectivas para estimular la actividad de la subunidad catalítica de PP2A. Aquí se muestra la representación gráfica de la actividad de PP2A en respuesta a concentraciones variables de alfa-sinucleína, beta-sinucleína y gamma-sinucleína. La alfa-sinucleína, la beta-sinucleína y la gamma-sinucleína fueron todas estimuladoras significativas de la actividad de PP2A a una concentración de uno a dos micromoles.Solo la alfa-sinucleína y la beta-sinucleína fueron estimuladores significativos de la actividad de PP2A a una concentración de 0,5 micromolar. La figura tres muestra la interacción de PP2Ac con sinucleínas endógenas en el cerebro de ratón. En A, se muestran alfa, beta y gamma sinucleínas recombinantes como controles positivos.En B, se realizó una co-inmunoprecipitación utilizando el anticuerpo específico para PP2Ac 1D6, que precipitó PP2Ac y también precipitó una cantidad considerable de alfa-sinucleína interaccionante, pero casi ninguna beta-sinucleína. Ninguna gamma-sinucleína se precipitó junto con PP2Ac en la co-inmunoprecipitación. Estos datos de co-inmunoprecipitación sugieren que la alfa-sinucleína es el modulador endógeno de PP2Ac in vivo.Queremos agradecer a todos los que nos ayudaron en la realización de este video. Por lo tanto, en conclusión, esta es Ruth Pérez. Sonavarak Lek.Javier Vargas. Le deseo mucho éxito. Adiós y buena suerte.

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Neurociencia

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Administración exógena de alfa-sinucleína asociada a microsomas agregados a las neuronas primarias como un modelo de celular de gran alcance de la formación de las fibrillas de

Las mutaciones en el gen de la quinasa 2 de la leucina rica causan la enfermedad de Parkinson hereditaria. Hemos desarrollado un método fácil y robusto para evaluar la fosforilación controlada por LRRK2 de Rab10 en neutrófilos de sangre periférica humana. Esto puede ayudar a identificar a las personas con aumento de la actividad de la vía de la quinasa LRRK2.

Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10

Este protocolo está diseñado para cuantificar eficientemente la actividad del sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) en diferentes compartimentos celulares del cerebro de roedores. Los usuarios pueden examinar el funcionamiento de UPS en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en el mismo animal, reduciendo la cantidad de tiempo y número de animales necesarios para realizar estos análisis complejos.

Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudiar la acumulación de sinucleína neuronal en las neuronas primarias de dopamina de ratón. Los agregados de sinucleína fosforilada en las neuronas se inducen con fibrillas preformadas de sinucleína. Las imágenes automatizadas de células etiquetadas inmunofluorescentemente y análisis de imágenes imparciales hacen que este protocolo robusto sea adecuado para el cribado de rendimiento medio-alto de fármacos que inhiben la acumulación de sinucleína.

Estudio de la acumulación preformada de la dopamina fibril-sinucleina en las neuronas de dopamina de cerebro medio del ratón embrionario primario

El extracto traslacional de Leishmania (LTE) es un sistema de expresión de proteínas eucariotas libres de células derivado del parásito unicelular, Leishmania tarentolae. Este protocolo optimizado hace que la fabricación de LTE sea sencilla y rentable. Es adecuado para diversas aplicaciones centradas en la expresión y el estudio multiparalelo de proteínas eucariotas complejas y sus interacciones.

Producción y optimización de LTE, un sistema de expresión de proteínas libres de células derivadas de Leishmania tarentolae para la producción de proteínas recombinantes

Aquí, describimos un sistema de levadura que reconstituye la γ-secretasa humana. Este sistema permite la identificación y el estudio de las mutaciones que afectan a la actividad y el cribado de los inhibidores de la γ-secretasa (GSIs). Utilizando las propiedades de pérdida de función de los mutantes familiares de la enfermedad de Alzheimer, es posible detectar moduladores de la γ-secretasa (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modelos de la enfermedad de Alzheimer para detectar genes, mutaciones y sustancias químicas que afectan la producción de beta amiloide por γ-secretasa

Aprende a medir la actividad de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 2A (PP2Ac) mediante un ensayo colorimétrico utilizando sinucleínas recombinantes α, β y γ. Este método permite evaluar la especificidad de α-sinucleína hacia PP2Ac en cerebro de ratón.

Synucleins α-β y γ recombinante estimulan actividad proteína fosfatasa 2A subunidad catalítica en ensayos libres de la célula

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