Name: El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende el aislamiento magnético de microglía CD11b con alta pureza y rendimiento en solo 30 minutos. Este método optimizado permite estudios versátiles de neuroinflamación in vitro.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Subvenciones: NS088206 y ES026892. La W. Eugene y Linda Cátedra Lloyd a AGK y decanos Cátedra de AK también son reconocidas.

El uso de los animales y los procedimientos de protocolo fue aprobado y supervisado por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad Estatal de Iowa (Ames, IA, EE.UU.) 1. Cultivo de mixtos gliales culturas <ol><li> Decapitar 1- 2 días de edad, los cachorros rápidamente con unas tijeras que operan 5,5 pulgadas, y colocar las cabezas inmediatamente en un tubo de 50 ml en hielo. Tenga en cuenta que este es el modo de la decapitación de la eutanasia. </li><li> En una campana de flujo de aire laminar, hacer una pequeña incisión en el cráneo y las meninges utilizando 4,5 pulgadas tijeras de disección micro rectas. Iniciar el corte desde el extremo caudal al extremo rostral (nariz). Obtener debajo de la piel mediante el uso de la abertura formada por la decapitación. <ol><li> Después de la incisión, la cáscara de uno de los hemisferios a un lado. A continuación, utilice un par de pinzas curvadas o en forma de gancho para eliminar todo el cerebro. </li></ol></li><li> Sumergir el cerebro (s) en un nuevo tubo de 50 ml que contiene 0,25% de tripsina-ethylenediaminetetraacetácido (EDTA) durante 15 min comió en un baño de agua C 37 °. Utilice 2 ml de tripsina-EDTA por cerebro. </li><li> Lavar el cerebro (s) con medio fresco de crecimiento (10% de FBS, DMEM / F12, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, piruvato de sodio al 1%, y 1% de aminoácidos no esenciales) mediante la adición y la eliminación de la medios de comunicación. Repita este 4x. </li><li> Para cada cerebro, la placa de dos T-75 matraces que contienen medio de crecimiento. Por lo tanto, añadir 2 ml de medio de crecimiento por cerebro al tubo. Por lo tanto, será un equivalente de 1 ml de cerebro se homogeneizó con 8-9 ml de medio de crecimiento por matraz T-75. </li><li> Homogeneizar triturando el cerebro (s) con pipetas de diferentes tamaños de apertura, en orden de mayor a menor. Cuando se ve que el tejido cerebral no se hace más pequeño, la transición a la siguiente pipeta. Al final de la trituración, la suspensión debe ser clara, sin trozos visibles. <ol><li> Utilice una pipeta de 25 ml, 5 ml de la pipeta, y entonces un ml pipeta secuencialmente 10. </li></ol></li><li> Pase cada homogsuspensión de cerebro enous a través de un filtro de células de 70 m para que sea en un único cultivo celular. </li><li> Para cada cerebro se homogeneizó, placa dos matraces T-75 que contiene medio de crecimiento, como se describe en el paso 1.5 (1 ml de cerebro se homogeneizó con 8-9 ml de medio de crecimiento por matraz T-75). </li><li> Cambio de medio de crecimiento después de 6 d y crecer hasta que el aislamiento de los 16 días. </li></ol> 2. Aislamiento de las células microgliales <ol><li> Después de 16 días, eliminar el medio de crecimiento del matraz y colocarlo en un tubo fresco 50 ml. Añadir 3 ml 0,25% de tripsina-EDTA a cada matraz T-75. Agitar los frascos durante 5 min a TA en un agitador orbital. <ol><li> Centrifugar el medio de crecimiento se eliminó a 0,4 xg durante 5 min y utilizar para detener la reacción con tripsina-EDTA en la etapa subsiguiente. </li></ol></li><li> Después de agitar durante 5 min, añadir un mínimo de 4 ml de medio de crecimiento (fresco o los medios de comunicación utilizado a partir de 2.1.1) para detener la reacción con tripsina-EDTA. </li><li> Se tritura para asegurar que toda la cells se hayan separado. </li><li> Después de la trituración, pasar las células a través de un filtro de células de 70 m para que sea en un único cultivo celular, realizar un recuento de células, y después de girar las células a 0,4 x g durante 5 min. </li><li> Para cada 100 x 10 6 células (aproximadamente 15 x matraces T-75), utilizar 1 ml de medio recomendado (2% de FBS, DPBS (calcio y magnesio libre de cloruro), EDTA 1 mM) para resuspender el sedimento celular. NOTA: Todos los pasos siguientes se adaptan para una separación de 1 ml. </li><li> Tomar un tubo de poliestireno de 5 ml, añadir 1 ml de medio recomendado, y marcar el menisco. Añadir recomendado del papel hasta 2,5 ml y marcar esto también. Desechar los medios recomendados y transferir las células resuspendidas al tubo de poliestireno de 5 ml. </li><li> Añadir 50 l de suero de rata para cada 1 ml de células suspendidas. Incubar durante 5 min a TA. </li><li> Preparar cóctel selección mezclando 25! L de componente A y 25 l de componente B. Estos componentes son propietarios. </li><li> Añadir 501; L del cóctel de selección a las células. Incubar durante 5 min a TA. NOTA: Para los cultivos puros, repita el paso 2.9 (recomendable pero no obligatorio). </li><li> microesferas de vórtice durante 45 s. Añadir 80 l de microesferas por 1 ml de muestra. Incubar durante 3 min a TA. </li><li> Llevar el volumen a 2,5 ml en el tubo de poliestireno mediante la adición de los medios recomendados. </li><li> Poner el tubo en el imán durante 3 minutos a temperatura ambiente. Ajuste de la incubación para aumentar la pureza. Verter lentamente a cabo los soportes recomendados en un tubo de 15 ml con el imán todavía en el tubo de poliestireno. </li><li> Repita el paso 2.12 tres veces más. incubaciones magnético adicional se puede realizar para aumentar la pureza. </li><li> Añadir 3 ml de medio de crecimiento y contar el número de células utilizando un contador de células. </li><li> células de la placa en consecuencia en el poli-D-lisina (PDL) placas recubiertas para tratamientos. Tratar las células 48 h después de sembrar placas recubiertas con inPDL. Esto permite que las células se recuperen de la tensión de la separación. NOTA: Check la pureza del cultivo utilizando inmunocitoquímica como se ha descrito previamente 15. </li><li> Placa de la fracción negativa (recogido en un tubo de 15 ml), que en su mayoría contiene astrocitos, en matraces T-75 en el medio de crecimiento. </li><li> Después de al menos 6 h de incubación en 37 ° C incubadora, cambiar el medio y se deja crecer O / N. Dividir los astrocitos al día siguiente para tratamientos. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

métodos de aislamiento microgliales mayores tienen recuperaciones limitadas que no son apropiados para diversos análisis de proteína por Western blot y análisis de ARN mediante qRT-PCR. La adherencia diferencial y métodos tripsinización leves son dos enfoques comunes con bajos rendimientos microgliales 13, 14, 15. El enfoque CD11b basado en columnas también tiene una baja recuperación, pero consigue una mayor pureza que la adhe...

La microglía son macrófagos residentes Myb-independientes de origen mesodérmico, que diferencian de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores en las islas de sangre del saco vitelino 1, 2. Una vez microglia embriológicas han colonizado el sistema nervioso central (CNS), en su transición desde una ameboide a una forma ramificada 3. Estos microglia adultos se clasifican como surveillant ya que sus ramificaciones dinámicos para sondear el parénquima cerebral saludable para posibles insultos 4. Aunque microglia sólo contribuyen a aproximadamente el 10% de la población de células del SNC, su capacidad de baldosas entre sí asegura el escaneado máxima del parénquima 4, 5. Patrones de peligro asociado-moleculares (amortigua), tales como α-sinucleína 6, 7 y amiloide-β 8, o ppatrones moleculares athogen asociados-(PAMP), tales como el lipopolisacárido (LPS) 9, clásicamente activan microglia para promover una respuesta inflamatoria caracterizada por la reversión al estado activo ameboide y la producción de óxido nítrico, factor de necrosis tumoral-α (TNF), 1β interleucina ligando (IL-1β), IL-6, IL-12, y el motivo de quimioquinas CC 2 9, 10, 11. En condiciones neuroinflamatorios tales como la enfermedad de Parkinson, en los que patógena α-sinucleína ha acumulado, un ciclo neurodegenerativa se crea a partir de la muerte de las neuronas dopaminérgicas, que liberan más agregado α-sinucleína, promover aún más la activación clásica de la microglia 7. Similar a los macrófagos periféricos, microglia también puede tener la capacidad de activar alternativamente en presencia de las citoquinas antiinflamatorias IL-4 e IL-10, dándoles la potenteial de promover la reparación neural y atenuar la inflamación 2, 11. Aparte de sus papeles inmunológicos en el SNC, microglia se han descrito como reguladores vitales de circuitería neuronal mediante la poda sinapsis durante el desarrollo. Por ejemplo, los ratones KO Cx3cr1- tienen microglia menos densas y la reducción de la poda sináptica, lo que conduce a una sobreabundancia de las espinas dendríticas, las sinapsis inmaduras, y los patrones electrofisiológicas de un CNS subdesarrollado 12. La comprensión de estas complejidades fisiológicos y los diversos papeles funcionales de microglia en la homeostasis del SNC es crítica para la búsqueda de agentes terapéuticos dirigidos trastornos neurodegenerativos. En el área de Neuroinmunología, los experimentos in vitro son muy deseables debido a la mayor viabilidad para estudios mecanísticos, los menores costes de mantenimiento, y por ser menos tiempo y mano de obra intensiva. Furthermore, la capacidad de aislar poblaciones de células es crítica para delinear la funcionalidad de aquellas células diana en las condiciones prescritas. Existen numerosos métodos de aislamiento microgliales, pero están limitados por su capacidad para obtener un número relativamente alto y de pureza de amplia experimentación 13, 14, 15. Por ejemplo, un grupo de 11b diferenciación (CD11b) es un marcador de superficie común de los monocitos, macrófagos y microglia 16. Mediante la explotación de CD11b, un método de separación magnética fue descrito primero como un enfoque basado en la columna que produjo ~ 99,5% de pureza y ~ 1,6 x 10 6 microglia por cerebro neonatal 17. Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un método libre de la columna CD11b magnético de separación 15, que se realizó en un tubo de poliestireno mediante el etiquetado de CD11b con un anticuerpo monoclonal conjugado con ficoeritrina (PE). Una seconda biespecíficoanticuerpo ry a PE y complejos de dextrano con la PE. Una vez unido, se introducen partículas magnéticas revestido con dextrano, que se unen al extremo de dextrano del complejo de anticuerpo. Por último, el tubo de poliestireno se coloca en un imán para el aislamiento microglial. Este enfoque se duplicó el rendimiento de ~ 3,2 x 10 6 microglia por cerebral neonatal, pero a costa de reducir la pureza de ~ 97%. En este documento, se demuestra un protocolo de separación rápida y refinado libre de columnas CD11b magnético (Figura 1). Este método mejorado sigue siendo tan factible como nuestro método libre de columna original ya que el precio del kit de separación magnética CD11b es el mismo. El tiempo de terminación se reduce en un medio, que puede ser crucial para maximizar la supervivencia celular y el rendimiento. Notablemente, la pureza logrado a partir de este método es optimizado ~&gt; 99%, una mejora con respecto a la pureza alcanzado desde el método original libre de columnas desarrollado por nuestro laboratorio 15. Lo más importante, CD11b-PEno se utiliza, eliminando la necesidad de incubar lejos de la luz y permitiendo el uso del canal rojo para microscopía de fluorescencia. Por último, como en el método original CD11b, una fracción de los astrocitos de alto rendimiento y pureza se obtiene con este método mejorado. Los astrocitos son las más numerosas células gliales en el sistema nervioso central, dando lugar a la idea de que sus funciones homeostáticas son indispensables en relación con la fisiopatología 18. Estas células gliales juegan un papel en diversas funciones fisiológicas, tales como la formación de la barrera sangre-cerebro, proporcionando soporte de nutrientes, mantenimiento de la homeostasis de neurotransmisores, formando cicatrices gliales en respuesta a una lesión, la neuroprotección, el aprendizaje y la memoria, y la neuroinflamación, ejemplificando su potencial de investigación en glial biología 19. Morfología y funcionalidad de la microglia y astrocitos se han comprobado a través de microscopía confocal, Western Blot, cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR), Gensayo de nitrito Riess, y el ensayo multiplex de citocinas Luminex. El refinamiento proporcionada por este protocolo ofrece una mayor confianza perteneciente a la pureza de la microglia o los astrocitos, una aplicación más amplia de microscopía de fluorescencia con la disponibilidad del canal rojo, y ahorra tiempo, todos los cuales son importantes para la experimentación in vitro.

<table><tbody><tr><td>EasySep CD11b Kit de Separación II</td><td>StemCell Technologies</td><td>18970</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos no esenciales (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>13H469</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento magnético rápida y refinado cd11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia son los respondedores primarios a los insultos del sistema nervioso central; Sin embargo, aún queda mucho por conocer acerca de su papel en la regulación de la neuroinflamación. La microglía son las células del mesodermo que funcionan de manera similar a los macrófagos en topografía estrés inflamatorio. El (M1-tipo) clásico y (de tipo M2) alternativa activaciones de los macrófagos también se han extendido a la microglía en un esfuerzo por entender mejor la interacción subyacente estos fenotipos tienen en condiciones neuroinflammatory como el Parkinson, el Alzheimer y las enfermedades de Huntington. En la experimentación vitro utilizando microglia primaria proporciona resultados rápidos y fiables que pueden ser extendidas al ambiente en vivo. Aunque esta es una clara ventaja sobre la experimentación in vivo, aislar microglia, mientras que el logro de rendimientos adecuados de pureza óptima ha sido un reto. Los métodos comunes actualmente en uso ya sea sufren de baja recuperación, baja pureza, o ambos. Aquí, nos demtrar un refinamiento del método de separación magnética CD11b libre de columnas que logra una recuperación de células de alta y una mayor pureza en la mitad de la cantidad de tiempo. Proponemos este método optimizado como un modelo muy útil de aislamiento primaria microglial a los efectos de estudiar la neuroinflamación y la neurodegeneración.

Microglia aislado utilizando el kit de CD11b selección positiva II tienen alta pureza microglia primarios de ratón se aislaron utilizando el protocolo mencionado anteriormente y se sembraron en cubreobjetos de poli-D-lisina para comprobar la pureza de aislamiento. Diez mil células se sembraron por pocillo y el análisis inmunocitoquímico se realizó usando ionizado molécula adaptadora de unión de calcio-1 (Iba1) como marcador de la...

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

El objetivo general del aislamiento magnético de microglía mediante CD11b es obtener un rendimiento final de microglía posnatal con alta pureza en un período de tiempo relativamente corto, para permitir experimentaciones versátiles in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como los mecanismos de señalización relacionados con la inflamación neural. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos disponibles actualmente es que el aislamiento toma aproximadamente 30 minutos, sin comprometer la pureza, el rendimiento ni la viabilidad.Comience transfiriendo las cabezas recién decapitadas de crías de ratón de uno a dos días de edad a una cabina de flujo laminar. Luego, utilice tijeras microquirúrgicas rectas de 4,5 pulgadas para hacer una pequeña incisión en el cráneo y las meninges insertando las puntas en la abertura formada por la decapitación y cortando de caudal a rostral. Después de realizar la incisión, retire uno de los hemisferios hacia un lado.Luego, utilice un par de pinzas curvas o con gancho para extraer todo el cerebro. Transfiera el cerebro a un tubo de 50 mililitros que contenga dos mililitros de tripsina-EDTA

rapid-refined-cd11b-magnetic-isolation-primary-microglia-with

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este video, describimos un protocolo para aislar células CD11b, incluida la microglía, de cerebros de cachorros de ratón utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente. Los tejidos cerebrales se homogeneizan para obtener suspensiones unicelulares, que se incuban con microesferas recubiertas de anticuerpos anti-CD11b, seguidas de una separación basada en columna magnética para purificar la población de células CD11b+.

Aislamiento magnético de microglía a partir de cerebros de cachorros de ratón

Este video muestra un protocolo para extraer células microgliales de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones utilizando la clasificación magnética de células. El protocolo consiste en diseccionar el tejido cerebral lesionado que contiene células microgliales, tratar el tejido con enzimas específicas para obtener una suspensión unicelular y utilizar perlas magnéticas específicas del receptor microglial para aislar las células microgliales.

Aislamiento de microglía de lesiones desmielinizantes del cerebro de ratón mediante clasificación de células activadas magnéticamente

El video demostró el método de aislar y cultivar células del cerebro de un ratón neonatal. Implicó la disociación enzimática y mecánica del cerebro, seguida de cultivo en medios de crecimiento carentes de factor de crecimiento neuronal para obtener una población glial mixta.

Obtención de un cultivo de células gliales mixtas a partir de un cerebro de ratón neonatal

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente  

Aprende el aislamiento magnético de microglía CD11b con alta pureza y rendimiento en solo 30 minutos. Este método optimizado permite estudios versátiles de neuroinflamación in vitro.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

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