El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

El objetivo general del aislamiento de microglía magnética CD11b es lograr un rendimiento final de alta pureza de la microglía postnatal en un período de tiempo relativamente corto con el fin de realizar una experimentación in vitro versátil. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como los mecanismos de señalización pertinentes a la inflamación neuronal. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos disponibles actualmente es que el aislamiento dura aproximadamente 30 minutos, sin sacrificar la pureza, el rendimiento o la viabilidad.

Comience transfiriendo las cabezas recién decapitadas de cachorros de ratón de uno a dos días de edad a una campana de flujo de aire laminar. Luego, use unas tijeras rectas de microdisección de 4.5 pulgadas para hacer una pequeña incisión en el cráneo y las meninges insertando las puntas en la abertura formada por la decapitación y cortando caudal a rostral. Después de hacer la incisión, pela una de las hebras hacia un lado.

Luego, use un par de pinzas curvas o en forma de gancho para extraer todo el cerebro. Transfiera el cerebro a un tubo de 50 mililitros que contenga dos mililitros de 0,25% de tripsina EDTA e incube durante 15 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Lave el cerebro con medio de crecimiento fresco agregando y quitando el medio.

Una vez finalizados los lavados, agregue dos mililitros de medio de crecimiento por cerebro y homogeneice triturando el cerebro. Cuando el tejido cerebral no se reduzca, haga la transición a una pipeta con una apertura más pequeña. Al final de la trituración, cuando la suspensión esté clara y sin trozos visibles, pase la suspensión a través de un colador de células de 70 micras para crear un cultivo de una sola célula.

A continuación, pipetee de ocho a nueve mililitros de medio de crecimiento en matraces T75, dos matraces por cerebro, y añada un mililitro de homogeneizado de cerebro a cada matraz. Cultivar las células hasta el aislamiento a los dieciséis días. Después de dieciséis días, transfiera el medio de crecimiento del matraz a un tubo nuevo de 50 mililitros.

Añadir tres mililitros de EDTA al 0,25% de tripsina a cada matraz T75. A continuación, agite los matraces durante cinco minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital. Centrifugar el medio de crecimiento a 0,4 veces g durante cinco minutos.

Después de agitar durante cinco minutos, agregue un mínimo de cuatro mililitros del medio de cultivo centrifugado para detener la reacción de tripsina EDTA y triture para asegurarse de que todas las células se hayan desprendido. A continuación, pase las células a través de un filtro de células de 70 micromolares para crear un cultivo de una sola célula. Realice un recuento de células y luego gire hacia abajo a 0,4 veces g durante cinco minutos.

A continuación, tome un tubo de poliestireno de cinco mililitros, agregue un mililitro del medio recomendado y marque el menisco. Agregue el medio recomendado hasta 2,5 mililitros y marque también este menisco. Luego, retire el medio y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros del medio recomendado.

Transfiera esta mezcla a un tubo de poliestireno de cinco mililitros y luego diluya hasta la marca de un mililitro. Luego agregue 50 microlitros de suero de rata por cada mililitro de células suspendidas e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, preparar el cóctel de selección mezclando 25 microlitros del componente A y 25 microlitros del componente B. Una vez transcurridos los cinco minutos, añadir 50 microlitros del cóctel de selección a las celdas, e incubar durante otros cinco minutos a temperatura ambiente.

Agita las microesferas durante 45 segundos. A continuación, añada 80 microlitros de microesferas por mililitro de muestra, e incube durante tres minutos a temperatura ambiente. A continuación, añade el medio recomendado hasta la marca de 2,5 mililitros en el tubo de poliestireno.

Coloque el tubo en el soporte magnético durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, vierta lentamente el medio en un tubo de poliestireno de 15 mililitros que aún esté en el imán. Repita la separación magnética tres veces más, cada vez agregando el medio recomendado hasta la marca de 2,5 mililitros.

Después de la última separación magnética, agregue tres mililitros de medio de crecimiento y cuente el número de células usando un contador de células. Coloque las células en placas recubiertas de poli-D-lisina para los tratamientos. Coloque la fracción negativa del tubo de 15 mililitros, que contiene principalmente astrocitos, en matraces T75.

Después de al menos seis horas de incubación en una incubadora a 37 grados centígrados, reemplace todo el medio de crecimiento en los matraces que contengan la fracción negativa antes de regresar a la incubadora. Esta imagen muestra la inmunocitoquímica de un cultivo microglial aislado sondeado para IBA, un marcador de microglía en el canal verde, y GFAP, un marcador de astrocitos, en el canal rojo. La tinción de Hoechst revela la presencia de núcleos celulares.

La ausencia de células GFAP positivas demuestra que la microglía aislada con el kit de selección positiva CD11b también tiene una alta pureza. Estas proteínas inmunotransferidas de un cultivo microglial aislado se sondearon para GFAP, que aparece como una banda de aproximadamente 51 kilodalton, e IBA1, que aparece como una banda de aproximadamente 15 kilodalton. La beta-actina se utilizó como control de carga y aparece aproximadamente a 42 kilodaltons.

Un problema con el antiguo kit de aislamiento era que la fluorescencia de PE se podía observar en el canal rojo como se ve aquí. El procedimiento modificado no produce ninguna autofluorescencia de las perlas magnéticas, como se ve en el canal rojo aquí. La microglía aislada mediante este procedimiento se puede utilizar para estudios de señalización.

El análisis de Western blot muestra que Fyn y phospho-src tirosina Y416 se pueden detectar a partir de microglía aislada con nuestro método recientemente refinado. La fracción negativa de la separación microglial contiene astrocitos que pueden utilizarse para estudios de señalización. La Western blot muestra que la fracción negativa contiene células GFAP positivas.

El análisis de Western blot muestra que Fyn y phospho-src tirosina Y416 se pueden detectar en las células GFAP positivas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de fluorescencia multicanal, la Western blot y la PCR cuantitativa, para responder preguntas sobre la expresión génica y la señalización de proteínas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar esta técnica de aislamiento rápido con fines de experimentación microglial.