Extracciones secuenciales de sal para el análisis de la cromatina a granel enlace propiedades de cromatina, complejos de modificar
October 2nd, 2017
Extracción de la sal secuencial de las proteínas de la cromatina obligada es una herramienta útil para la determinación de las propiedades de enlace de los complejos grandes. Este método puede ser empleado para evaluar la función de individuales subunidades o dominios en la total afinidad de una proteína compleja a la cromatina.
El objetivo general del procedimiento de extracción secuencial de sal es caracterizar los perfiles de unión de proteínas a la cromatina a granel y evaluar cómo se altera la unión cuando se manipula la proteína, o su entorno. Este método mide la afinidad relativa de los reguladores epigenéticos con la cromatina y se puede utilizar para evaluar cómo cambian esas interacciones tras la manipulación genética, química y ambiental. La principal ventaja de esta técnica es que es una forma rápida y económica de evaluar los perfiles de unión de las proteínas de unión a la cromatina.
Las personas nuevas en el campo de la cromatina a menudo luchan con la inmunoprecipitación de cromatina, o ChIP. La extracción secuencial de sal es una técnica antigua que incluso los científicos sin experiencia pueden utilizar para responder a muchas de las mismas preguntas. Para comenzar el procedimiento, coseche 8.000.000 de células de cada línea celular de interés.
Lave cada muestra de célula con cinco mililitros de PBS helado dos veces. Resuspender cada muestra y un mililitro de un tampón hipotónico con inhibidores de la proteasa. Transfiera las suspensiones celulares a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Gire las suspensiones, de arriba hacia abajo, durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y luego centrifugue la suspensión durante cinco minutos a esta misma temperatura a 6.000 G. Deseche el sobrenadante. Equipe una micropipeta con una punta de un mililitro.
Añadir al pellet 200 microlitros de tampón ripa modificado sin sal con inhibidores de la proteasa. Golpee la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo de microcentrífuga para introducir el pellet en la punta. Pipetea el pellet hacia arriba y hacia abajo 15 veces.
La muestra debe volverse espesa y pegajosa a medida que el gránulo se rompe. Homogeneizar cada muestra de esta manera e incubar las muestras en hielo durante tres minutos. A continuación, centrifugar las muestras a 6500 g a cuatro grados centígrados durante tres minutos.
Transfiera los sobrenadantes a los tubos de microcentrífuga limpios de 1,5 mililitros. A cada pellet, añadir 200 mililitros de tampón ripa modificado con cloruro sódico 100 milimolar y con inhibidores de la proteasa. Pipetea el pellet hacia arriba y hacia abajo 15 veces.
Si al principio es difícil introducir el gránulo en la punta de la pipeta, golpee la punta en la parte inferior del tubo. Repita este proceso para cada muestra e incube las muestras en hielo durante tres minutos. Centrifugar las muestras a 6500 g a cuatro grados centígrados durante tres minutos.
Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Continúe extrayendo muestras en soluciones tampón de ripa modificadas con concentraciones crecientes de cloruro de sodio. Cuando el pellet ya no permanezca en el fondo del tubo, coloque el pellet en la tapa del tubo de centrífuga antes de decantar el sobrenadante.
Después de la extracción en serie de sal, para cada muestra, agregue 70 mililitros de colorante de cuatro veces carga de proteína a cada una de las cinco fracciones sobrenadantes. Cargue 30 microlitros de cada fracción en un gel de acrilamida SDS. Realice un Western blot estándar transfiriendo las proteínas a una membrana y tiñéndolas con los anticuerpos primarios adecuados.
Incubar la transferencia en anticuerpos secundarios marcados con un tinte infrarrojo y obtener una imagen de la transferencia. Utilice un software de análisis de imágenes para calcular la intensidad de banda de cada concentración de sal. Represente la intensidad de la banda frente a la concentración de sal para determinar el patrón de elución de la proteína de interés.
La extracción secuencial de sales de las proteínas ARID1a y Polybromo 1 mostró una elución consistente con concentraciones de sal de 200 y 300 milimolares, respectivamente. La extracción no secuencial de sales de las mismas proteínas mostró resultados menos consistentes. El tiempo de incubación debe optimizarse para cada proteína que se examine.
Por lo tanto, se utilizó SSE para examinar los perfiles de elución después de diferentes duraciones de incubación. Un activador transcripcional, Polybromo 1, mostró perfiles de elución similares cuando se incubó durante tres minutos y 10 minutos. El represor transcripcional, Polycomb Represive Complex 1, indicado por BMI1, necesitó más de tres minutos para ser liberado de la cromatina.
Las interacciones proteína-proteína se investigaron examinando el cambio en los perfiles de elución. En presencia de un inhibidor, el bromoprincipal que contenía la proteína cuatro aludió a concentraciones de sal más bajas que sin el inhibidor. Se observaron diferencias en los patrones de histonas cuando las células fueron tratadas con un inhibidor de la histona desacetilasa, alterando el paisaje de la cromatina.
Los cambios en la unión de proteínas cuando las células experimentaron estrés genómico también se reflejaron en los perfiles de elución. En este caso, el aumento de la concentración de sal necesaria para la elución sugiere que el Polybromo 1 se une más estrechamente a la cromatina tras el daño en el ADN con la doxorrubicina. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, recuerde ser lo más consistente posible con el tratamiento de cada muestra. Este procedimiento se puede utilizar en los pasos iniciales de un estudio para dilucidar el mecanismo y la regulación de una proteína de unión a la cromatina. Esto ahorra tiempo y dinero en estudios innecesarios de todo el genoma.
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Visión general
El procedimiento de Extracción Salinal Secuencial está diseñado para caracterizar los perfiles de unión de proteínas a la cromatina en masa y evaluar cómo estas uniones se alteran mediante varias manipulaciones. Este método es particularmente útil para evaluar la afinidad de los reguladores epigenéticos a la cromatina.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología de la cromatina
- Interacciones de proteínas
- Epigenética
Antecedentes
- La Extracción Salinal Secuencial es una técnica para estudiar las proteínas de unión a la cromatina.
- Ofrece una alternativa rápida y rentable a la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP).
- Este método es accesible incluso para científicos inexpertos.
- Permite evaluar cómo las interacciones de proteínas cambian con factores genéticos, químicos y ambientales.
Propósito del estudio
- Caracterizar los perfiles de unión de las proteínas de unión a la cromatina.
- Evaluar los efectos de varias manipulaciones en la unión de proteínas.
- Proporcionar un método sencillo para los investigadores en el campo de la cromatina.
Métodos utilizados
- Cosecha de 8,000,000 células de cada línea celular de interés.
- Extracción salinal secuencial para aislar proteínas unidas a la cromatina.
- Evaluación de la afinidad de unión de proteínas a la cromatina.
- Evaluación de cambios en los perfiles de unión bajo diferentes condiciones.
Resultados principales
- El método caracteriza eficazmente los perfiles de unión de proteínas.
- Demuestra cómo las afinidades de unión pueden alterarse por factores ambientales.
- Los resultados indican la utilidad de esta técnica tanto para investigadores experimentados como novatos.
- Proporciona información sobre las interacciones de los reguladores epigenéticos con la cromatina.
Conclusiones
- La Extracción Salinal Secuencial es una herramienta valiosa para estudiar las interacciones de la cromatina.
- El método es eficiente y accesible para varias aplicaciones de investigación.
- Mejora la comprensión de la dinámica de unión de proteínas en la biología de la cromatina.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Sequential Salt Extraction (SSE) provides a rapid, cost-effective method to evaluate chromatin-binding protein affinity, enabling early-stage target validation in epigenetics-focused drug discovery. By quantifying how genetic, chemical, or environmental perturbations alter protein-chromatin interactions, SSE supports mechanistic de-risking of chromatin-modifying complexes before committing to resource-intensive assays. This approach improves predictive confidence in lead identification by distinguishing direct binding effects from indirect cellular responses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures relative binding affinity changes when complex subunits are lost or domains inactivated, clarifying functional contributions of individual proteins to chromatin engagement.
- Scientific Value: Profiles elution patterns under increasing salt concentrations to differentiate specific chromatin binding from nonspecific associations, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Enables non-experts to generate quantitative binding data without specialized ChIP expertise, accelerating early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible elution profiles that serve as quantitative readouts for screening compound effects on chromatin landscape alterations.
- Operational Value: Uses standard western blot infrastructure and image analysis, facilitating assay standardization across laboratories and reducing technical variability.
- Operational Value: Requires only basic centrifugation and electrophoresis equipment, lowering barriers to adoption in screening cascades for epigenetic modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links alterations in chromatin environment (e.g., via HDAC inhibitors) to changes in protein binding, supporting biomarker-aligned mechanistic studies in disease-relevant systems.
- Scientific Value: Evaluates binding shifts under genomic stress (e.g., doxorubicin-induced DNA damage), informing predictive models of target engagement under pathophysiological conditions.
- Operational Value: Complements cellular and biochemical assays by providing orthogonal validation of chromatin interaction continuity from discovery to preclinical stages.
Pipeline & Workflow Integration
SSE fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, offering a mechanistic bridge between biochemical binding assays and cellular phenotypic readouts in epigenetics programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how complex alterations affect chromatin binding, enabling pathway clarification and biological de-risking of epigenetic targets.
- Screening: Delivers salt-dependent elution profiles as quantitative outputs for comparing compound-induced chromatin state changes across screening campaigns.
- Analytics: Generates band intensity data plotted against salt concentration, providing calculable binding affinity shifts that inform structure-activity relationship discussions.
- Translational Research: Connects in vitro binding changes to cellular chromatin landscape modifications, supporting translational biomarker alignment when coupled with functional readouts.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, low-cost capability applicable across multiple chromatin targets, promoting platform reuse in epigenetic drug discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by distinguishing direct chromatin binding from indirect cellular effects through controlled salt elution.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative binding profiles using widely available laboratory equipment, enhancing cross-team standardization.
- Strategic Value: Reduces reliance on low-throughput ChIP for initial binding assessments, improving capital efficiency in early epigenetics projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chromatin-modifying complex targets based on quantitative binding resilience to environmental perturbations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biochemistry and western blot quantification to ensure accurate elution profile interpretation.
- Depends on access to refrigerated centrifuges, microcentrifuge tubes, and standard SDS-PAGE/western blot instrumentation.
- Necessitates standardized cell harvesting and lysis protocols to minimize variability between samples and ensure comparable salt extraction results.
- Involves optimization of incubation times for each target protein, as binding release kinetics vary across chromatin-modifying complexes.
- Limited to relative affinity comparisons; absolute binding constants require orthogonal biophysical methods for validation.
