Extracciones secuenciales de sal para el análisis de la cromatina a granel enlace propiedades de cromatina, complejos de modificar
2 de octubre de 2017
Extracción de la sal secuencial de las proteínas de la cromatina obligada es una herramienta útil para la determinación de las propiedades de enlace de los complejos grandes. Este método puede ser empleado para evaluar la función de individuales subunidades o dominios en la total afinidad de una proteína compleja a la cromatina.
El objetivo general del procedimiento de extracción secuencial de sal es caracterizar los perfiles de unión de proteínas a la cromatina a granel y evaluar cómo se altera la unión cuando se manipula la proteína, o su entorno. Este método mide la afinidad relativa de los reguladores epigenéticos con la cromatina y se puede utilizar para evaluar cómo cambian esas interacciones tras la manipulación genética, química y ambiental. La principal ventaja de esta técnica es que es una forma rápida y económica de evaluar los perfiles de unión de las proteínas de unión a la cromatina.
Las personas nuevas en el campo de la cromatina a menudo luchan con la inmunoprecipitación de cromatina, o ChIP. La extracción secuencial de sal es una técnica antigua que incluso los científicos sin experiencia pueden utilizar para responder a muchas de las mismas preguntas. Para comenzar el procedimiento, coseche 8.000.000 de células de cada línea celular de interés.
Lave cada muestra de célula con cinco mililitros de PBS helado dos veces. Resuspender cada muestra y un mililitro de un tampón hipotónico con inhibidores de la proteasa. Transfiera las suspensiones celulares a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Gire las suspensiones, de arriba hacia abajo, durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y luego centrifugue la suspensión durante cinco minutos a esta misma temperatura a 6.000 G. Deseche el sobrenadante. Equipe una micropipeta con una punta de un mililitro.
Añadir al pellet 200 microlitros de tampón ripa modificado sin sal con inhibidores de la proteasa. Golpee la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo de microcentrífuga para introducir el pellet en la punta. Pipetea el pellet hacia arriba y hacia abajo 15 veces.
La muestra debe volverse espesa y pegajosa a medida que el gránulo se rompe. Homogeneizar cada muestra de esta manera e incubar las muestras en hielo durante tres minutos. A continuación, centrifugar las muestras a 6500 g a cuatro grados centígrados durante tres minutos.
Transfiera los sobrenadantes a los tubos de microcentrífuga limpios de 1,5 mililitros. A cada pellet, añadir 200 mililitros de tampón ripa modificado con cloruro sódico 100 milimolar y con inhibidores de la proteasa. Pipetea el pellet hacia arriba y hacia abajo 15 veces.
Si al principio es difícil introducir el gránulo en la punta de la pipeta, golpee la punta en la parte inferior del tubo. Repita este proceso para cada muestra e incube las muestras en hielo durante tres minutos. Centrifugar las muestras a 6500 g a cuatro grados centígrados durante tres minutos.
Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Continúe extrayendo muestras en soluciones tampón de ripa modificadas con concentraciones crecientes de cloruro de sodio. Cuando el pellet ya no permanezca en el fondo del tubo, coloque el pellet en la tapa del tubo de centrífuga antes de decantar el sobrenadante.
Después de la extracción en serie de sal, para cada muestra, agregue 70 mililitros de colorante de cuatro veces carga de proteína a cada una de las cinco fracciones sobrenadantes. Cargue 30 microlitros de cada fracción en un gel de acrilamida SDS. Realice un Western blot estándar transfiriendo las proteínas a una membrana y tiñéndolas con los anticuerpos primarios adecuados.
Incubar la transferencia en anticuerpos secundarios marcados con un tinte infrarrojo y obtener una imagen de la transferencia. Utilice un software de análisis de imágenes para calcular la intensidad de banda de cada concentración de sal. Represente la intensidad de la banda frente a la concentración de sal para determinar el patrón de elución de la proteína de interés.
La extracción secuencial de sales de las proteínas ARID1a y Polybromo 1 mostró una elución consistente con concentraciones de sal de 200 y 300 milimolares, respectivamente. La extracción no secuencial de sales de las mismas proteínas mostró resultados menos consistentes. El tiempo de incubación debe optimizarse para cada proteína que se examine.
Por lo tanto, se utilizó SSE para examinar los perfiles de elución después de diferentes duraciones de incubación. Un activador transcripcional, Polybromo 1, mostró perfiles de elución similares cuando se incubó durante tres minutos y 10 minutos. El represor transcripcional, Polycomb Represive Complex 1, indicado por BMI1, necesitó más de tres minutos para ser liberado de la cromatina.
Las interacciones proteína-proteína se investigaron examinando el cambio en los perfiles de elución. En presencia de un inhibidor, el bromoprincipal que contenía la proteína cuatro aludió a concentraciones de sal más bajas que sin el inhibidor. Se observaron diferencias en los patrones de histonas cuando las células fueron tratadas con un inhibidor de la histona desacetilasa, alterando el paisaje de la cromatina.
Los cambios en la unión de proteínas cuando las células experimentaron estrés genómico también se reflejaron en los perfiles de elución. En este caso, el aumento de la concentración de sal necesaria para la elución sugiere que el Polybromo 1 se une más estrechamente a la cromatina tras el daño en el ADN con la doxorrubicina. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, recuerde ser lo más consistente posible con el tratamiento de cada muestra. Este procedimiento se puede utilizar en los pasos iniciales de un estudio para dilucidar el mecanismo y la regulación de una proteína de unión a la cromatina. Esto ahorra tiempo y dinero en estudios innecesarios de todo el genoma.
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Descripción general
El procedimiento de extracción secuencial con sal está diseñado para caracterizar los perfiles de unión de proteínas a la cromatina total y evaluar cómo estas uniones se alteran mediante diversas manipulaciones. Este método es particularmente útil para evaluar la afinidad de los reguladores epigenéticos por la cromatina.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de la cromatina
- Interacciones proteicas
- Epigenética
Antecedentes
- La extracción secuencial con sal es una técnica para estudiar las proteínas que se unen a la cromatina.
- Ofrece una alternativa rápida y rentable a la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP).
- Este método es accesible incluso para científicos inexpertos.
- Permite evaluar cómo cambian las interacciones proteicas frente a factores genéticos, químicos y ambientales.
Objetivo del estudio
- Caracterizar los perfiles de unión de las proteínas que se unen a la cromatina.
- Evaluar los efectos de diversas manipulaciones sobre la unión de proteínas.
- Proporcionar un método sencillo para investigadores en el campo de la cromatina.
Métodos Utilizados
- Recolección de 8.000.000 de células de cada línea celular de interés.
- Extracción secuencial con sal para aislar proteínas unidas a la cromatina.
- Evaluación de la afinidad de unión de proteínas a la cromatina.
- Evaluación de los cambios en los perfiles de unión bajo diferentes condiciones.
Resultados principales
- El método caracteriza eficazmente los perfiles de unión de proteínas.
- Demuestra cómo las afinidades de unión pueden ser alteradas por factores ambientales.
- Los resultados indican la utilidad de esta técnica tanto para investigadores experimentados como novatos.
- Proporciona información sobre las interacciones de los reguladores epigenéticos con la cromatina.
Conclusiones
- La extracción secuencial con sal es una herramienta valiosa para estudiar las interacciones de la cromatina.
- El método es eficiente y accesible para diversas aplicaciones de investigación.
- Mejora la comprensión de la dinámica de unión de proteínas en la biología de la cromatina.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La extracción secuencial con sal (SSE) proporciona un método rápido y rentable para evaluar la afinidad de las proteínas que se unen a la cromatina, permitiendo la validación temprana de objetivos en el descubrimiento de fármacos enfocados en epigenética. Al cuantificar cómo las perturbaciones genéticas, químicas o ambientales alteran las interacciones proteína-cromatina, SSE apoya la reducción mecanicista de riesgos en complejos que modifican la cromatina antes de recurrir a ensayos intensivos en recursos. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos activos al distinguir los efectos de unión directa de las respuestas celulares indirectas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Mide los cambios relativos en la afinidad de unión cuando se pierden subunidades del complejo o se inactivan dominios, aclarando las contribuciones funcionales de proteínas individuales en la interacción con la cromatina.
- Valor científico: Perfila los patrones de elución bajo concentraciones crecientes de sal para diferenciar la unión específica a la cromatina de asociaciones no específicas, reduciendo los falsos positivos en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Permite a no expertos generar datos cuantitativos de unión sin necesidad de experiencia especializada en ChIP, acelerando la prueba de hipótesis en etapas iniciales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera perfiles de elución reproducibles que sirven como lecturas cuantitativas para evaluar los efectos de compuestos sobre alteraciones en el paisaje de cromatina.
- Valor operacional: Utiliza infraestructura estándar de inmunotransferencia western y análisis de imágenes, facilitando la estandarización del ensayo entre laboratorios y reduciendo la variabilidad técnica.
- Valor operacional: Requiere únicamente equipos básicos de centrifugación y electroforesis, lo que disminuye las barreras para su adopción en cascadas de cribado de moduladores epigenéticos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona alteraciones en el entorno de la cromatina (por ejemplo, mediante inhibidores de la HDAC) con cambios en la unión de proteínas, apoyando estudios mecanicistas alineados con biomarcadores en sistemas relevantes para enfermedades.
- Valor científico: Evalúa los cambios en la unión bajo estrés genómico (por ejemplo, daño en el ADN inducido por doxorrubicina), aportando información para modelos predictivos de la interacción con el blanco en condiciones fisiopatológicas.
- Valor operativo: Complementa los ensayos celulares y bioquímicos al proporcionar una validación ortogonal de la continuidad de las interacciones con la cromatina desde la fase de descubrimiento hasta las etapas preclínicas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
SSE se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, ofreciendo un puente mecanicista entre los ensayos bioquímicos de unión y las lecturas fenotípicas celulares en programas de epigenética.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación del modo en que alteraciones complejas afectan la unión a la cromatina, lo que permite aclarar vías y reducir riesgos biológicos asociados a dianas epigenéticas.
- Cribado: Proporciona perfiles de elución dependientes de la salinidad como salidas cuantitativas para comparar cambios en el estado de la cromatina inducidos por compuestos en campañas de cribado.
- Análisis: Genera datos de intensidad de bandas trazados frente a la concentración de sal, aportando cambios calculables en la afinidad de unión que informan discusiones sobre relaciones estructura-actividad.
- Investigación Traducional: Relaciona cambios en la unión in vitro con modificaciones en el paisaje de cromatina celular, apoyando la alineación de biomarcadores traducibles cuando se combinan con lecturas funcionales.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad estandarizada y de bajo costo aplicable a múltiples dianas de cromatina, promoviendo la reutilización de plataformas en procesos de descubrimiento de fármacos epigenéticos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al distinguir la unión directa a la cromatina de los efectos celulares indirectos mediante elución controlada con sal.
- Valor operativo: Proporciona perfiles de unión reproducibles y cuantitativos utilizando equipos de laboratorio ampliamente disponibles, mejorando la estandarización entre equipos.
- Valor estratégico: Reduce la dependencia de ChIP de bajo rendimiento para evaluaciones iniciales de unión, mejorando la eficiencia del capital en proyectos iniciales de epigenética.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas en complejos modificadores de la cromatina basándose en la resistencia cuantitativa de la unión frente a perturbaciones ambientales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en bioquímica de cromatina y cuantificación mediante inmunotransferencia para garantizar una interpretación precisa del perfil de elución.
- Depende del acceso a centrífugas refrigeradas, tubos de microcentrífuga e instrumentación estándar para electroforesis SDS-PAGE e inmunotransferencia.
- Necesita protocolos estandarizados de recolección y lisis celular para minimizar la variabilidad entre muestras y asegurar resultados comparables en la extracción con sal.
- Implica la optimización de los tiempos de incubación para cada proteína diana, ya que la cinética de liberación del enlace varía entre los complejos que modifican la cromatina.
- Se limita a comparaciones de afinidad relativa; las constantes absolutas de unión requieren métodos biofísicos ortogonales para su validación.
