Name: Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprende a generar organoides cerebrales humanos derivados de iPSC para modelar trastornos del neurodesarrollo temprano como la microcefalia. Este método robusto permite obtener resultados reproducibles en 23 días.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Estamos muy agradecidos a la instalación de la incrustación de tejidos y la facilidad de la base del microscopio de CMMC. Estamos muy agradecidos por las discusiones y soporte técnico proporcionados por los miembros del Laboratorio de Biología del centrosoma y el citoesqueleto. Agradecemos a Li Ming Gooi para la corrección del manuscrito.

1. Generación de cerebro organoides (23 días) <ol><li> Iniciación de neuroectodermo (5 días) NOTA: Los siguientes puntos deben ser considerados antes del comienzo de la diferenciación. El método de reprogramación (etc. lentiviral-, basado en microRNA sendai-a virus, episomas, o) para obtener iPSCs humanos idealmente debería ser la misma para todos los pacientes y controlar las líneas de IPSC. Varios kits de reprogramación y las instrucciones en base a protocolos publicados están disponibles 15, 16, 17, 18. La calidad de las líneas de IPSC humanos es la clave para lograr una diferenciación óptima. Monitor de colonia y la morfología celular con un microscopio y validar pluripotencia mediante pruebas de la expresión de marcadores tales como Oct3 / 4, Nanog, o TRA-1-60. <ol><li> iPSCs Cultura humanos bajo condiciones libres de alimentador en medio A en un plato recubierto con Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matriz. NOTA: Grow iPSCs humanos-alimentador libre y para mantener una condición de cultivo definido y para evitar una etapa adicional para la eliminación de células alimentadoras de embriones de ratón (MEFs) antes del inicio de la diferenciación libre de suero. El número óptimo de paso para iPSCs humanos para iniciar rangos de diferenciación de paso 15 a la reprogramación de paso 70 en total. Cuando pases, separar colonias hiPSC como células agregadas utilizando una solución de desprendimiento celular apropiado con un bajo estrés mecánico y una pipeta serológica de 2 ml para transferir agregados a un nuevo plato. Evitar la disociación de células individuales, ya que esto podría inducir la diferenciación y la apoptosis en la mayoría de las líneas de IPSC. Se informó de que a largo plazo, pases de una sola célula podría aumentar alteraciones genómicas en iPSCs humano 19, 20. Evitar procedimientos desprendimiento de células, que requieren una etapa de centrifugación para eliminar la solución desprendimiento, ya que esto reduce la viabilidad general de iPSCs. Pruebatodas las culturas de contaminaciones microbianas, particularmente micoplasma, sobre una base regular, porque esto podría alterar la calidad de los iPSCs y su capacidad de diferenciación. <ol><li> Escudo una placa de cultivo de tejidos de 60 mm con matriz EHS según las instrucciones del fabricante. </li><li> Descongelar una alícuota de 1 x 10 6 iPSCs humanos. Sembrar el iPSCs en una placa de cultivo tisular de 60 mm recubierto en la matriz EHS y que contiene 5 ml de medio A (véase la Tabla de Materiales). Cambiar el medio a diario y el paso después de 5 a 7 días cuando las células alcanzan ~ 80% de confluencia. NOTA: Passage las iPSCs descongelaron a 80% de confluencia usando métodos estándar, tales como el desprendimiento libre de enzimas de las colonias de 21, al menos una vez antes de iniciar la diferenciación. En breve, se elimina el medio iPSC, lavar las células una vez con pre-calentado 37 del ° C Dulbecco Medio de Eagle Modificado: Nutriente F12 de mezcla (DMEM / F12), e incubar los iPSCs siguiente al del fabricanteinstrucciones usando reactivo A (ver la Tabla de Materiales). No exceda el tiempo de incubación recomendado para evitar la disociación de células individuales. iPS humanas deben ser separados y flotando en forma de agregados, las células no como individuales. A continuación, pueden ser transferidos a nuevos platos de matriz recubierto EHS; por ejemplo, iPSC agregados de una placa de 60-mm se puede distribuir a 4 nuevos platos de 60 mm. </li><li> Compruebe si hay micoplasma con un kit de detección de micoplasma de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilizar células iPS sólo libre de micoplasmas, como micoplasma puede alterar la capacidad de diferenciación de las células iPS. </li></ol></li><li> Disociar iPSCs (80% confluentes) y preparar una suspensión de una sola célula usando el reactivo B. <ol><li> Lavar las iPSCs una vez con pre-calentado (37 ° C) DMEM / F12. </li><li> Añadir el reactivo B pre-calentado (por ejemplo, 1 ml en una placa de 60 mm) y se incuban las iPSCs durante 5 min a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Flick 20 veces con un dedo en el lado y parte inferior deel plato para separar las células iPS. Comprobar la separación de las células bajo el microscopio. </li><li> Pipeta de la suspensión de células arriba y abajo en el plato 5 veces con una micropipeta de 1 ml. </li><li> Añadir 3 ml de medio A para diluir 1 ml de reactivo B y recoger la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 15 mL. </li><li> girar suavemente la iPSCs (500 xg) durante 4 min a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio B y contar el número de células con un hemocitómetro. NOTA: Tenga en cuenta de usar sólo el medio B para la resuspensión. Evitar el uso de medio A, ya que contiene una demasiado alta concentración de bFGF, lo que podría inhibir la diferenciación. </li></ol></li><li> Diluir la suspensión de células a 4,5 x 10 5 células por ml en medio B suplementado con asociado-rho 10 mM inhibidor de la proteína quinasa (Y-27632). </li><li> Añadir 100! L por pocillo en una placa de 96 pocillos no adherente, de fondo en v,. NOTA: Asegúrese de que las células se distribuyen por igual en el SUSpensión agitando el tubo cada vez antes de sacar porciones de 100 mL. Es importante que cada pocillo debe contener un número de células equivalente con el fin de obtener neuroesferas homogéneas en tamaño y forma (redonda, superficies definidas). </li><li> Girar suavemente la placa con las células a 500 xg y temperatura ambiente durante 3 min y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Cambiar el medio a diario por la eliminación de 50 l y la adición de 50 l de medio fresco B en cada pocillo para los próximos 5 días. </li></ol></li></ol> 2. Incorporación de neuroesferas en EHS Matrix (4 días) <ol><li> Preparar medio neurosphere mezclando lo siguiente: 1: 1 mezcla de (v / v), 1 DMEM / F12 y C medio: 200 (v / v) Suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento 2 sin (w / o) la vitamina A, 1: 100 L-glutamina, 0,05 mM de aminoácidos no esenciales (MEM), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, y 0,05 mM β-mercaptoetanol. </li><li> Recoger el ingenio neuroesferasja 200 micropipeta l usando una punta de ~ 2 mm cortada previamente con tijeras estériles. </li><li> Colocar las neuroesferas aproximadamente 5 mm de distancia entre sí en la película de parafina (3 x 3 cm 2) en un vacío plato 100 mm y retirar con cuidado la mayor cantidad de medio restante como sea posible. </li><li> Añadir una gota (7 l) de la matriz EHS sobre cada sola neurosphere. </li><li> Incubar la matriz EHS gotas con las neuroesferas durante 15 minutos en una incubadora. </li><li> Lavar las neuroesferas cuidadosamente de la película de parafina mediante el lavado con medio de neuroesferas. Para lavar, utilice un ml micropipeta 1 y un nuevo 100 mm placa de Petri que contiene 10 ml de medio de neuroesferas. </li><li> Incubar las neuroesferas en los próximos 4 días y añadir 2 ml de medio de neuroesferas fresco en días 2. NOTA: Asegúrese de que los estantes en la incubadora son planas para que las neuroesferas embebidos en matriz de EHS no van a aglutinarse en un lado del plato. </li></ol> 3. organoides en una suspensión RotaryCultura (14 días) <ol><li> Preparar cerebro medio organoide mezclando lo siguiente: 1: 1 mezcla de DMEM / F12 y C medio (v / v), 1: 200 (v / v) Suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento 2 w / o la vitamina A, 1: 100 L-glutamina, MEM 0,05 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, 0,5 M dorsomorphin, 5? M SB431542, y 0,05 mM β-mercaptoetanol. </li><li> Añadir 100 ml de cerebro organoide medio a cada matraz spinner a través de sus brazos laterales y colocarlos en una incubadora de pre-calentamiento durante al menos 20 min. </li><li> Establecer un programa de agitación a 25 rpm, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: Antes de transferir las neuroesferas embebidos en matriz de EHS en matraces de agitación, asegúrese de que todos ellos están separados. Si dos o más están conectados a través de la matriz EHS, separarlos mediante la reducción de la matriz de conexión con un bisturí. </li><li> transferir cuidadosamente las neuroesferas embebidos en matriz de EHS en matraces de agitación que contenían 100 ml de medio organoide nosotrosing una pipeta serológica 2 mL. Usa los brazos laterales del matraz spinner para transferir las neuroesferas en el matraz. </li><li> Colocar los matraces de agitación en una plataforma de agitación magnética en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2; este es el día 0 de la cultura organoid. </li><li> Cambiar el medio una vez por semana (o más a menudo cuando hay un cambio de color) mediante la eliminación de la mitad del medio y añadiendo la misma cantidad de medio fresco. NOTA: Al tomar los matraces de agitación de la incubadora, esperar 3-5 minutos para permitir que los organoides se hunden hasta el fondo del matraz. Eliminar el medio mediante la colocación de la punta de pipeta de vidrio (conectado a una bomba) en la superficie del líquido; aspirar el medio cuidadosamente a través de una abertura lateral / brazo del matraz. Estas manipulaciones deben realizarse bajo el capó laminar. </li></ol> 4. Análisis de organoides cerebrales <ol><li> La fijación de organoides <ol><li> Recoge los organoides en el día 14 del wi cultivo en matraz spinnerth un corte 1 ml micropipeta (corte ~ 5 mm). Ponga todos ellos en una placa de 60 mm y lavarlos una vez con 5 ml de DMEM caliente / F12 durante 3 min. </li><li> Preparar un tubo de 1,5 ml con 500 l de tibia 4% de paraformaldehído (PFA). Precaución: Use protección para los ojos y la piel y el trabajo bajo una campana de seguridad al manejar PFA fijador. </li><li> Colocar cada organoides por separado en cada tubo y fijar durante al menos 30 min a temperatura ambiente. No fijar los organoides durante más de 60 minutos. Para mover los organoides, utilizar un bucle de inoculación o cualquier otro legado que es conveniente. </li><li> Retire el PFA y lavar los organoides fijos dos veces durante 10 min cada una con 1 ml de PBS. </li><li> Almacenar los organoides en 1 ml de PBS a 4 ° C durante hasta 7 días, hasta su uso posterior. </li></ol></li><li> Incorporación de los organoides para cryosectioning <ol><li> Retire el PBS y añadir 1 ml de 30% de sacarosa en solución de agua destilada por tubo para deshidratar los organoides antes cryofreezing ellos; después de añadir Sucrosolución en sí, los organoides debe estar flotando en la superficie. Almacenar los organoides durante la noche en solución de sacarosa a 4 ° C; por el día siguiente, los organoides deberían haber hundido hasta el fondo del tubo. NOTA: organoides se pueden almacenar para un máximo de 3-5 días a 4 ° C en solución de sacarosa, si es necesario. </li><li> Llenar un molde espécimen de vinilo con 400! L de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y el uso de un bucle de inoculación para colocar un organoide en el centro del molde. Etiquetar el borde del molde con el nombre de la muestra. </li><li> Congelar el molde que contiene organoide a -80 ° C hasta cryosectioning. </li><li> cryoslides de vidrio de capa con 0,1% de solución de lisina poli-l-(PLL) en PBS durante 5 min a temperatura ambiente y dejar que los portaobjetos se secan durante 3 h. Almacenar las diapositivas a 4 ° C y calentarlos a templado ambiente antes de su uso. NOTA: PLL-recubrimiento es un paso importante, ya que evitará que las rodajas de organoides se vaya flotando. Recoger y almacenar solución de PLL a 4 ° C durante un máximo de 3meses. Antes de la reutilización, filtrarla con una jeringa 0,22-micras y dejar que se caliente a temperatura ambiente. </li><li> Organoides Sección cryofrozen en 20-50 rebanadas m de espesor sobre vidrio recubierto con PLL cryoslides 22. Deje que los portaobjetos con las secciones se secan durante 1 hora a temperatura ambiente. Almacenar las secciones a -80 ° C hasta su posterior procesamiento. </li></ol></li></ol> 5. Inmunofluorescencia tinción de secciones organoides NOTA: Para la caracterización general de organoides, la tinción con nestina, un marcador progenitoras neurales, y Tuj1, un marcador pan-neuronal, se recomienda. Como ejemplos adicionales, la tinción de inmunofluorescencia con fosfo-vimentina (p-Vim), que las etiquetas de las células gliales radiales apicales mitóticas, y Arl13b, por cilio, se describen. Para probar la apoptosis, utilice el ensayo desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) dUTP Nick Fin Etiquetado (TUNEL). Colocar los portaobjetos en una caja de plástico durante las incubaciones a protegerlos del polvo, luz,y la desecación. <ol><li> Descongelar los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con 200? L de PBS-glicina (0,225 g de glicina en PBS) durante 3 min para inactivar la autofluorescencia inducida por PFA. </li><li> Permeabilizar las secciones con 200! L de 0,5% de Triton X100 / 0,1% de Tween en solución de PBS durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar dos veces con 200 l de solución de PBS-glicina durante 3 min. </li><li> Incubar con 200! L de 0,5% de gelatina de pescado / 0,1% de Triton X100 en PBS durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C para bloquear antígeno inespecífico de unión. NOTA: Si se requiere un ensayo de TUNEL, lleve a cabo el ensayo según el protocolo del fabricante. Comience con el ensayo TUNEL antes de realizar la inmunotinción, ya que podría interferir con anticuerpos secundarios y saciar fluoróforos cuando se utiliza después. </li><li> Diluir los anticuerpos en solución a las concentraciones siguientes de bloqueo: nestina, 1: 200; p-Vim, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 01:20; y anticuerpos secundarios, 1: 1.000. </li><li> Incubar con 200 l de la primera anticuerpo primario (por ejemplo, nestina) para 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo. </li><li> Diluir la primera (anti-ratón 488) anticuerpo secundario 1: 1000 en solución de bloqueo y se incuba el portaobjetos en 200 l durante 1-2 h a temperatura ambiente. A partir de ahora, siempre proteger a las diapositivas de la luz. </li><li> Lavar 3 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo. </li><li> Incubar con 200 l de la siguiente anticuerpo primario (por ejemplo, Tuj1) durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo. </li><li> Añadir 200? L de la siguiente anticuerpo secundario (anti-conejo 647) durante 1-2 h a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 x 3 min. con 200 l de solución de bloqueo. </li><li> Añadir 200! L de 4&#39; , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a una nM conc 30entration en PBS durante 15 min a temperatura ambiente para la tinción nuclear. </li><li> Lavar 2 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo. </li><li> Lavar 1 x 1 min con 200 l de agua destilada y dejar que las secciones se sequen durante 10-20 min, hasta que no gota de agua obvia es visible más. </li><li> Montar las secciones con el medio de inclusión. Almacenarlos protegidos de la luz a 4 ° C hasta por varias semanas. </li><li> Proceder con el análisis microscópico de imagen una visión general de la zona organoide, ventricular, placa cortical primitivo, y otras áreas de interés. </li><li> Utilice un microscopio confocal con un aceite 63X filtros objetivas y fluorescentes, elegido de acuerdo con los anticuerpos secundarios de tinte-etiquetados fluorescentes utilizados 1, 10. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

MCPH es un trastorno del desarrollo neurológico humano complejo que no puede ser recapitulado en modelos animales in vivo o in sencilla cultivo de células humanas se acerca in vitro. La manifestación clínica de MCPH comienza a aparecer durante el primer trimestre, cuando comienza temprano neurogénesis. Por lo tanto, organoides cerebrales 3D representan un sistema experimental fiable para modelar el desarrollo MCPH. Además, 3D organoides cerebro humano son un enfoque ideal ya que i) que permiten la adap...

trastornos del neurodesarrollo humanos, como microcefalia, sólo pueden ser poco estudiados en modelos animales debido al hecho de que los cerebros humanos tienen una superficie cortical extendida, una característica única que difiere de los animales no humanos. Este aspecto hace que el desarrollo del cerebro humano un proceso complejo que no puede ser suficientemente estudiada en un 2D, en el sistema de cultivo celular in vitro. Emergentes técnicas de cultivo 3D permiten la generación de organoides similar a un tejido a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). La diferenciación in vitro de células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión en 3D permite la formación de diversos tipos de células de una manera oportuna y específica de la región, dando lugar a una manera organizada, tejido estratificado 1, 2, 3. Gracias a los laboratorios que fueron pioneras en tecnologías de cultivo 3D y desmitificado la complejidad de la formación de órganos, a partir de células madre,hemos desarrollado un método robusto de generar organoides cerebrales para delinear los eventos tempranos de desarrollo del cerebro humano y para modelar microcefalia in vitro 1, 2, 3. Es de destacar que se adaptó el método original desarrollado por Lancaster et al. para generar organoides cerebrales 1. Este método fue modificado de acuerdo a nuestras necesidades experimentales. El objetivo de un estudio de Gabriel et al. fue analizar los mecanismos celulares y moleculares de mantenimiento de células madre neuronales durante el desarrollo del cerebro. Con el fin de hacer esto, un estudio mecanicista se realizó mediante el análisis de las células progenitoras neurales (CPN) en organoides cerebrales 3D derivados de un paciente microcefalia 4. Este paciente lleva una mutación en CPAP, una proteína centrosomal conservado necesario para la biogénesis de centrosoma 5. Un hipo ampliamente aceptadotesis es que microcefalia es el resultado de un agotamiento de la reserva de la APN, y esto podría ser debido o bien a la muerte celular o a la diferenciación prematura 1, 6, 7, 8, 9. Mediante el análisis de las zonas ventriculares (VZS) de organoides cerebrales microcefalia, se ha demostrado que un número significativo de NPC someterse a la división celular asimétrica, a diferencia de organoides cerebrales derivadas de un donante sano 4. Extensos análisis microscópicos y bioquímicos de organoides cerebrales microcefálicos revelan un papel inesperado para la CPAP en el desmontaje cilios oportuna 4. Específicamente, CPAP mutado se asocia con el desmontaje cilio retardado y ciclo celular re-entrada retardada, lo que lleva a la diferenciación prematura de NPC 4. Estos resultados sugieren un papel de los cilios en la microcefalia y THEIR participación durante la neurogénesis y el tamaño del cerebro de control 10. La primera parte de este protocolo es una descripción de un método de tres pasos para generar organoides cerebrales homogéneos. Como se mencionó antes, el protocolo Lancaster original fue adaptado y modificado para adaptarse a nuestro propósito 1. En primer lugar, iPSCs humanos se cultivan en un estado libre de alimentador definido en matriz de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Este paso evita las variaciones de cultivos de células madre pluripotentes alimentadoras-dependiente. En este protocolo, la inducción de la diferenciación neural para formar epitelio neural comienza directamente desde iPSCs. Al saltarse la etapa de formación del cuerpo embrioides (EB), la diferenciación procede neural en una manera más controlada y dirigida. Este enfoque limita la formación espontánea y no dirigida de otras capas de células germinales, tales como el mesodermo y endodermo. Mediante la aplicación de este protocolo, neuroesferas contienen rosetas neurales pueden ser cosechadas en el día 5 para EHS incrustación matriz y cultivo en suspensión estacionaria. El medio organoide utilizado para el tercer paso de nuestro protocolo se complementa con dorsomorphin y SB431542. Dorsomorphin es un inhibidor de molécula pequeña de la proteína morfogénica ósea (BMP), y SB431542 inhibe la ruta de TGF- / activina / nodal de señalización. La combinación de estos factores podría promover la diferenciación neural de manera más eficiente que el ácido retinoico solo 11, 12, 13, 14. En conjunto, estas modificaciones permiten la generación reproducible de organoides cerebrales, con variaciones mínimas a través de organoides. Es importante destacar que, se aplicó este método para generar robustamente organoides cerebrales microcefálicos de iPSCs paciente, que llevan mutaciones en los genes que afectan a los centrosomas y la dinámica del ciclo celular. La segunda parte de este protocolo da instrucciones para preparar brain organoides para el análisis y la interpretación de los defectos celulares en microcefalia. Esto incluye la fijación, cryosectioning, la tinción de inmunofluorescencia y análisis microscópico confocal. Este protocolo proporcionará al lector una descripción detallada de los resultados esperados y con la orientación para la interpretación.

<table><tbody><tr><td>Anti-ratón 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-conejo 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B anticuerpo policlonal de conejo&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema CELLSPIN</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU</td>. <td>32670</td><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato; múltiples proveedores</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, EE. UU</td>. <td>31331093</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mezcla de nutrientes F-12&nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU</td>. <td>P5499</td><td>Compuesto C; múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Medio de inclusión</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; medio de incrustación; múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Matriz Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel Matriz calificada para hESC; importante: Gelatina de pescado calificada para hESC</td><td></td></tr><tr><td>;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatina de piel de pescado de agua fría; múltiples proveedores; autoclave después de agregar a PBS para disolver y esterilizar, almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine para biología molecular; múltiples proveedores&nbsp;</td></tr><tr><td>Asa de inoculación con aguja, desechable (1 y micro; L)</td> <td>Sigma Aldrich, EE. UU</td>. <td>BR452201-1000EA múltiples</td><td>proveedores&nbsp;</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>I3536-100MG</td><td>múltiples proveedores</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco, EE. UU.</td><td>25030081</td><td>L-glutamina (200 mM)</td></tr><tr><td>Medio A</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (medio hiPSC)</td></tr><tr><td>Medio B</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>#05835</td><td>Medio de inducción neural (NIM); medio de diferenciación neuronal</td></tr><tr><td>Medio C</td><td>Gibco, EE. UU.</td><td>21103049</td><td>Medio basal neural</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, EE. UU.</td><td>11140035</td><td>Solución de aminoácidos no esenciales MEM (100x)</td></tr><tr><td>Kit de detección de micoplasma MycoAlert</td><td>Lonza, Suiza</td><td>#LT07-218</td><td>Kit de detección de micoplasma; múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón Nestin (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% en PBS, solución de almacenamiento a -20 &deg; C; PRECAUCIÓN: Use protección para la piel y los ojos y trabaje debajo del capó&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS tabletas</td><td>Gibco, EE. UU</td>. <td>18912014</td><td>Ver fabricante&agudo; s instrucciones; múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, EE. UU.</td><td>15140122</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU</td>. <td>P8920-100ML</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Fosfo-Vimentina (Ser55)</td></tr><tr><td>Reactivo de AcM A&nbsp;</td><td>Tecnologías de células madre</td><td># 05872</td><td>Nota al Protocolo 1.1.1.2; ReLSR (reactivo de selección y paso de células ES e iPS humanas libres de enzimas); Por favor, siga a Manufactorer&acute; S protocolo; productos alternativos de varios proveedores disponibles</td></tr><tr><td>Reactivo B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>A6964-100ML</td><td>La solución Accutase es una solución enzimática para la disociación de una sola célula; múltiples proveedores; protocolo 1.1.2 "solución de disociación enzimática de células" &nbsp;</td></tr><tr><td>Criostato de investigación Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Matraz giratorio 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost ultra plus</td><td>Thermo scientific, EE. UU.</td><td>J3800AMNZ</td><td>Los portaobjetos deben estar etiquetados con un "+" y cargados positivamente</td></tr><tr><td>Suplemento 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>Suplemento N-2 (100x)</td></tr><tr><td>Suplemento 2 sin vitamina A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 suplemento (50x), menos vitamina A; múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Compuesto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&beta;-Tubulina III (policlonal de conejo)</td></tr><tr><td>Ensayo TUNEL</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Sistema fluorométrico TUNEL; múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Tween 20 para biología molecular</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Lámina impermeable de múltiples proveedores</td></tr><tr><td></td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm " M&rdquo;; múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibidor (Y-27632 2HCL); múltiples proveedores</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco, EE. UU.</td><td></td><td>31350010 2-mercaptoetanol (50 mM); múltiples proveedores</td></tr></tbody></table>

generación de derivados de ipsc organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

La disponibilidad restringida de modelos in vitro adecuados que puedan representar de manera confiable el desarrollo complejo del cerebro humano es un cuello de botella significativo que limita la traducción de la investigación básica del cerebro a la aplicación clínica. Si bien las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han reemplazado a las células madre embrionarias humanas éticamente cuestionables, los estudios de diferenciación neuronal basados en iPSC siguen siendo descriptivos a nivel celular, pero no proporcionan adecuadamente los detalles que podrían derivarse de un tejido cerebral humano complejo en 3D. 
Este vacío ahora se llena mediante la aplicación de organoides cerebrales 3D derivados de iPSC, "Cerebros en un plato", que modelan muchas características del complejo desarrollo del cerebro humano. Aquí, se describe un método para generar organoides cerebrales 3D derivados de iPSC. Los organoides pueden ayudar a modelar la microcefalia primaria autosómica recesiva (MCPH), un raro trastorno del neurodesarrollo humano. Una explicación ampliamente aceptada para la malformación cerebral en la MCPH es un agotamiento de la reserva de células madre neurales durante las primeras etapas del desarrollo del cerebro humano, un defecto del desarrollo que es difícil de recrear o probar in vitro. 
Para estudiar la MCPH, generamos iPSCs a partir de fibroblastos derivados de pacientes portadores de una mutación en la proteína centrosomal CPAP. Mediante el análisis de la zona ventricular de los organoides cerebrales 3D de microcefalia, demostramos la diferenciación prematura de los progenitores neuronales. Estos organoides cerebrales 3D son un poderoso sistema in vitro que será fundamental para modelar trastornos cerebrales congénitos inducidos por productos químicos neurotóxicos, infecciones virales neurotróficas o mutaciones genéticas heredadas.

La generación de organoides cerebrales requiere al menos tres semanas de cultivo continuo (Figura 1A). Para lograr resultados reproducibles, se recomienda que el investigador documenta cada paso y, sobre todo, evita cualquier alteración con respecto a los componentes del medio, los puntos de tiempo, y la manipulación de células. A continuación, damos un resumen de cómo evaluar si se alcanzan los hitos críticos con el fin de obtener organoides de calidad suficiente al fin...

El modelado del desarrollo del cerebro humano se ha visto obstaculizado debido a la complejidad sin precedentes del tejido epitelial neural. Aquí, se describe un método para la generación robusta de organoides cerebrales para delinear eventos tempranos del desarrollo del cerebro humano y para modelar la microcefalia in vitro.

Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

El objetivo general de este protocolo para la generación de organoides cerebrales humanos derivados de iPSC es modelar trastornos neurodesarrolladores humanos tempranos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo cerebral humano, como el papel de los sintesomas y los cilios en la neurogénesis novedosa y en la microcefalia primaria. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un modelo robusto y rápido para obtener resultados reproducibles a partir de organoides cerebrales derivados de iPSC de pacientes.La procedura será demostrada por Elke Gabriel, una posdoctoranda de mi laboratorio en el Centro de Medicina Molecular de Colonia. Para comenzar este procedimiento, recolecte los neuroesferas con una micropipeta de 200 microlitros utilizando una punta de dos milímetros previamente cortada con tijeras estériles. A continuación, coloque los neuroesferas aproximadamente a cinco milímetros de distancia entre sí sobre una película de parafina en un recipiente de 100 mililitros.Y retire cuidadosamente la mayor cantidad posible del medio restante. A continuación, agregue una gota de matriz EHS sobre cada neuroesfera individual. Incube las gotas de matriz EHS con las neuroesferas durante 15 minutos a 37 grados celsius.Después de eso, lave cuidadosamente las neuroesferas de la película de parafina lavándolas con medio para neuroesferas. Posteriormente, incube las neuroesferas durante los próximos cuatro días y agregue dos milímetros de medio fresco para neuroesferas el día dos. En este procedimiento, agregue 100 mililitros de medio para organoides cerebrales a cada matraz giratorio a través de sus brazos laterales.Y precaliente el medio en el incubador a 37 grados Celsius durante al menos 20 minutos. Luego, asegúrese de que las neuroesferas estén completamente separadas. Si dos o más están conectadas a través de la matriz EHS, sepárelas cortando la matriz de conexión con un escalpelo.Configure un programa de agitación a 25 RPM. Transfiera cuidadosamente las neuroesferas embebidas en la matriz EHS a los matraces giratorios que contienen 100 mililitros de medio para organoides. A continuación, coloque los matraces giratorios sobre una plataforma de agitación magnética en el incubador durante 14 días a 37 grados celsius.Este es el día cero del cultivo de organoides. Cambie el medio una vez por semana retirando la mitad del medio y agregando la misma cantidad de medio fresco. En este paso, recolecte los organoides del cultivo en matraz agitador el día 14 con una micropipeta de un mililitro precortada.Coloque todos en una placa de 60 milímetros y lávelos una vez con cinco mililitros de DMEM F12 tibio durante tres minutos. Posteriormente, prepare un tubo de 1,5 mililitros con 500 microlitros de PFA al 4 % tibio. Coloque cada organoide por separado en cada tubo y fíjelos durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.Posteriormente, utilice un asa de inoculación para retirar los organoides. Luego, elimine el PFA y lave los organoides fijados dos veces durante 10 minutos cada vez con un mililitro de PBS. A continuación, almacene los organoides en un mililitro de PBS a cuatro grados centígrados durante hasta 7 días para su uso posterior.Para incrustar los organoides para corte por criomicrotomía, retire el PBS y agregue 1 mililitro de solución de sacarosa al 30 % en cada tubo para deshidratar los organoides antes de congelarlos por criogenia. Después de agregar la solución de sacarosa, los organoides deben flotar en la superficie. Almacene los organoides durante la noche en la solución de sacarosa a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, los organoides deberían haber descendido hasta el fondo del tubo. A continuación, llene un molde de muestra de vinilo con 400 mililitros de compuesto OCT. Y utilice un asa de inoculación para colocar un organoide en el centro del molde.Etiquete el borde del molde con el nombre de la muestra. Luego, congele el molde que contiene los organoides a menos 80 grados celsius hasta el criocorte. Posteriormente, recubra las portaobjetos de vidrio para criocorte con PLL al 0,1 % y PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, deje secar las laminillas durante tres horas. Almacene las laminillas a cuatro grados centígrados y caliéntelas a temperatura ambiente antes de su uso. A continuación, seccione los organoides congelados en cortes de 20 a 50 micrómetros de grosor sobre laminillas de vidrio recubiertas con PLL.Deje secar las secciones durante una hora a temperatura ambiente y almacénelas a menos 80 grados celsius hasta su posterior procesamiento. Imagen inmunofluorescente de organoides seccionados por criomicrotomía que muestran una zona ventricular típica y una placa cortical primitiva. La zona ventricular se extiende desde el lado apical hasta el lado basal.Téngase en cuenta que las células dentro de la zona ventricular (VZ) muestran núcleos dispuestos en forma de palisade, lo que sugiere que son células gliales radiales. El panel derecho muestra la tinción de inmunofluorescencia de NPCs positivas para nestina dentro de la zona ventricular y neuronas positivas para TUJ1 en la placa cortical primitiva. Aquí se muestran dos ejemplos de zonas ventriculares teñidas con PVIM y ARL 13B.Las regiones marcadas con cuadrados blancos están ampliadas. Las células gliales radiales apicales que se dividen en el lado apical de la ZV son positivas para PVIM. El plano de división de una célula en anafase es horizontal respecto a la línea de la superficie del lumen, que está marcada por la tinción de ARL 13B.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 23 días si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar revisiones periódicas de calidad y controles de microplasma en los cultivos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo en neurobiología exploraran los mecanismos del neurodesarrollo en organoides cerebrales humanos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar organoides cerebrales humanos a partir de diversas líneas celulares iPSC, incluidas líneas celulares de pacientes con funciones celulares comprometidas.

generation-ipsc-derived-human-brain-organoids-to-model-early

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El video muestra un método para generar organoides cerebrales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas. Muestra cómo la neurosfera forma una capa neuroectodérmica, que suprime la formación de otras capas germinales. Las neuroesferas están incrustadas en una matriz de gel 3D y forman brotes neuroepiteliales. Cuando se incuban con medios organoides, estas yemas neuroepiteliales se diferencian en regiones específicas del cerebro, lo que da lugar a la formación de organoides...

Un método in vitro para generar organoides cerebrales humanos

Este video muestra un ensayo para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Las iPSC humanas son inducidas a formar cuerpos embrioides (EB). Las EB se cultivan sobre un andamio de polímero utilizando un medio de inducción, lo que promueve la diferenciación en células madre neurales, células progenitoras y neuronas inmaduras. Finalmente, los EB se incrustan en una matriz y se transfieren a un medio de mantenimiento para la formación de organoides...

Generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas

Organoides cerebrales representan un nuevo sistema modelo para investigar el cerebro humano desarrollo temprano en vitro. Este artículo proporciona la metodología detallada para generar eficientemente organitas prosencéfalo-tipo dorsal homogéneo de células pluripotentes inducidas humanas incluyendo pasos críticos de la caracterización y validación.

Generación de organoides Cerebral prosencéfalo-tipo estandarizadas y reproducibles de humanos inducida por células madre pluripotentes

Este protocolo se generó como un medio para producir organoides cerebrales de una manera simplificada y de bajo costo sin factores de crecimiento exógenos o matriz de membrana de sótano sin dejar de mantener la diversidad de tipos de células cerebrales y muchas características de la organización celular.

Un método autodirigido estático para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Describimos un protocolo detallado para la generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos y su uso en el modelado de enfermedades mitocondriales.

Generación de organoides cerebrales humanos para el modelado de enfermedades mitocondriales

Aquí describimos un protocolo para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Para obtener organoides cerebrales en grandes cantidades y de alta calidad, utilizamos mini biorreactores caseros.

Generación de organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas en mini biorreactores caseros

En este estudio, proporcionamos una técnica detallada para un sistema de cultivo de organoides corticales simple pero robusto utilizando cultivos hPSC estándar sin alimentador. Este es un protocolo rápido, eficiente y reproducible para generar organoides que modelan aspectos de la senescencia cerebral in vitro.

Generación robusta y altamente reproducible de organoides cerebrales corticales para modelar la senescencia neuronal cerebral in vitro

Presentamos un protocolo para generar un organoide cerebral humano con microglía residente mediante la incorporación de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en el desarrollo de organoides.

Derivación de un organoide cerebral humano con desarrollo de microglía

Desarrollo neurológico procesos como proliferación, migración y consecuencia del neurite son a menudo perturbados en enfermedades neuropsiquiátricas. Así, presentamos protocolos evaluar rápida y reproducible estos procesos del neurodesarrollo en NPCs humanos derivado de iPSC. Estos protocolos permiten la evaluación de los efectos relevantes factores de crecimiento y terapias en desarrollo de NPC.

Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)

Aprende a generar organoides cerebrales humanos derivados de iPSC para modelar trastornos del neurodesarrollo temprano como la microcefalia. Este método robusto permite obtener resultados reproducibles en 23 días.

Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

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