Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

El objetivo general de este protocolo para la generación de organoides cerebrales humanos derivados de iPSC es modelar trastornos neurodesarrolladores humanos tempranos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo cerebral humano, como el papel de los sintesomas y los cilios en la neurogénesis novedosa y en la microcefalia primaria. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un modelo robusto y rápido para obtener resultados reproducibles a partir de organoides cerebrales derivados de iPSC de pacientes.

La procedura será demostrada por Elke Gabriel, una posdoctoranda de mi laboratorio en el Centro de Medicina Molecular de Colonia. Para comenzar este procedimiento, recolecte los neuroesferas con una micropipeta de 200 microlitros utilizando una punta de dos milímetros previamente cortada con tijeras estériles. A continuación, coloque los neuroesferas aproximadamente a cinco milímetros de distancia entre sí sobre una película de parafina en un recipiente de 100 mililitros.

Y retire cuidadosamente la mayor cantidad posible del medio restante. A continuación, agregue una gota de matriz EHS sobre cada neuroesfera individual. Incube las gotas de matriz EHS con las neuroesferas durante 15 minutos a 37 grados celsius.

Después de eso, lave cuidadosamente las neuroesferas de la película de parafina lavándolas con medio para neuroesferas. Posteriormente, incube las neuroesferas durante los próximos cuatro días y agregue dos milímetros de medio fresco para neuroesferas el día dos. En este procedimiento, agregue 100 mililitros de medio para organoides cerebrales a cada matraz giratorio a través de sus brazos laterales.

Y precaliente el medio en el incubador a 37 grados Celsius durante al menos 20 minutos. Luego, asegúrese de que las neuroesferas estén completamente separadas. Si dos o más están conectadas a través de la matriz EHS, sepárelas cortando la matriz de conexión con un escalpelo.

Configure un programa de agitación a 25 RPM. Transfiera cuidadosamente las neuroesferas embebidas en la matriz EHS a los matraces giratorios que contienen 100 mililitros de medio para organoides. A continuación, coloque los matraces giratorios sobre una plataforma de agitación magnética en el incubador durante 14 días a 37 grados celsius.

Este es el día cero del cultivo de organoides. Cambie el medio una vez por semana retirando la mitad del medio y agregando la misma cantidad de medio fresco. En este paso, recolecte los organoides del cultivo en matraz agitador el día 14 con una micropipeta de un mililitro precortada.

Coloque todos en una placa de 60 milímetros y lávelos una vez con cinco mililitros de DMEM F12 tibio durante tres minutos. Posteriormente, prepare un tubo de 1,5 mililitros con 500 microlitros de PFA al 4 % tibio. Coloque cada organoide por separado en cada tubo y fíjelos durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente, utilice un asa de inoculación para retirar los organoides. Luego, elimine el PFA y lave los organoides fijados dos veces durante 10 minutos cada vez con un mililitro de PBS. A continuación, almacene los organoides en un mililitro de PBS a cuatro grados centígrados durante hasta 7 días para su uso posterior.

Para incrustar los organoides para corte por criomicrotomía, retire el PBS y agregue 1 mililitro de solución de sacarosa al 30 % en cada tubo para deshidratar los organoides antes de congelarlos por criogenia. Después de agregar la solución de sacarosa, los organoides deben flotar en la superficie. Almacene los organoides durante la noche en la solución de sacarosa a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, los organoides deberían haber descendido hasta el fondo del tubo. A continuación, llene un molde de muestra de vinilo con 400 mililitros de compuesto OCT. Y utilice un asa de inoculación para colocar un organoide en el centro del molde.

Etiquete el borde del molde con el nombre de la muestra. Luego, congele el molde que contiene los organoides a menos 80 grados celsius hasta el criocorte. Posteriormente, recubra las portaobjetos de vidrio para criocorte con PLL al 0,1 % y PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Luego, deje secar las laminillas durante tres horas. Almacene las laminillas a cuatro grados centígrados y caliéntelas a temperatura ambiente antes de su uso. A continuación, seccione los organoides congelados en cortes de 20 a 50 micrómetros de grosor sobre laminillas de vidrio recubiertas con PLL.

Deje secar las secciones durante una hora a temperatura ambiente y almacénelas a menos 80 grados celsius hasta su posterior procesamiento. Imagen inmunofluorescente de organoides seccionados por criomicrotomía que muestran una zona ventricular típica y una placa cortical primitiva. La zona ventricular se extiende desde el lado apical hasta el lado basal.

Téngase en cuenta que las células dentro de la zona ventricular (VZ) muestran núcleos dispuestos en forma de palisade, lo que sugiere que son células gliales radiales. El panel derecho muestra la tinción de inmunofluorescencia de NPCs positivas para nestina dentro de la zona ventricular y neuronas positivas para TUJ1 en la placa cortical primitiva. Aquí se muestran dos ejemplos de zonas ventriculares teñidas con PVIM y ARL 13B.

Las regiones marcadas con cuadrados blancos están ampliadas. Las células gliales radiales apicales que se dividen en el lado apical de la ZV son positivas para PVIM. El plano de división de una célula en anafase es horizontal respecto a la línea de la superficie del lumen, que está marcada por la tinción de ARL 13B.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 23 días si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar revisiones periódicas de calidad y controles de microplasma en los cultivos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo en neurobiología exploraran los mecanismos del neurodesarrollo en organoides cerebrales humanos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar organoides cerebrales humanos a partir de diversas líneas celulares iPSC, incluidas líneas celulares de pacientes con funciones celulares comprometidas.