La maduración de madre humanas cardiomiocitos derivado de células en Biowires uso de la estimulación eléctrica

El objetivo general de este procedimiento es utilizar métodos controlados de cultivo de células tridimensionales en estimulación eléctrica para promover la maduración de cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias e pluripotentes inducidas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos cardíacos, incluida la forma en que los diferentes parámetros de estimulación eléctrica o la duración del tiempo afectan la función de las células cardíacas y el estado de maduración. Los resultados finales son tejidos cardíacos humanos modificados con una madurez mejorada.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia aplicaciones de diagnóstico, como las pruebas de seguridad y eficacia de nuevos fármacos, ya que es más probable que los cardiomiocitos con características maduras, como el progreso eléctrico, sirvan como modelos más precisos de células cardíacas humanas en estudios de detección de fármacos. Combine el monómero PDMS y el agente de curado en una proporción de 10:1 y mezcle bien. Déjalo reposar durante cinco minutos para que se desgasifique.

A continuación, cargue una placa de Petri que contenga el maestro para la plantilla de biocable con la mezcla PDMS. Trate de minimizar la formación de burbujas de aire. A continuación, cure el PDMS a 70 grados centígrados durante dos horas.

Luego, recupere el molde solidificado usando primero una cuchilla afilada alrededor de los bordes y luego despegándolo. A continuación, recorte el exceso de PDMS y recoja todas las plantillas en una bolsa de esterilización. Vaporice las plantillas en autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos.

Y luego cargue cada plantilla en una placa de Petri estéril bajo la ventilación de un gabinete de bioseguridad. Ahora, para cada plantilla, use pinzas para montar una pieza de sutura de seda 6.0 estéril en la ranura que abarca todo el canal. A continuación, las plantillas están listas para la siembra de células.

La sutura servirá como plantilla para la formación de construcciones 3D que se alinean a lo largo del eje de la sutura, imitando la forma de las fibras cardíacas. Para cada cámara, haz un par de piezas rectangulares de policarbonato para que sirvan de marco para la cámara de estimulación eléctrica. A lo largo de la línea central de cada pieza, perfora dos agujeros de tres milímetros de ancho, separados por dos centímetros.

Para cada cámara prepara dos cañas de carbono de 1,5 centímetros de largo. A unos 3 milímetros del extremo de cada varilla, perfore un agujero de un milímetro de ancho. A continuación, enrosca cada agujero con un alambre de platino y envuelve un extremo del alambre alrededor de la varilla.

A continuación, para cada cámara inserta dos varillas entre dos piezas de policarbonato formando un marco. A continuación, vierta unos dos mililitros de PDMS en un pocillo de una placa de seis pocillos y coloque el marco en el pocillo con PDMS, sumergiendo la parte inferior de los marcos. Cura el PDMS a 70 grados centígrados durante dos horas para que el PDMS asegure el marco.

A continuación, retire la cámara completa de la placa con el PDMS conectado. Para probar el funcionamiento de una cámara ensamblada, conecte los cables de platino a una batería y use un voltímetro para verificar que la electricidad pase a través de las varillas. Ahora transfiera las cámaras funcionales a una bolsa de esterilización y use 20 minutos de esterilización por vapor a 121 grados centígrados para prepararlas para el cultivo celular.

Para preparar el gel, preenfríe todos los componentes del gel en hielo antes de mezclarlos en un tubo estéril. Asegúrese de agregar el colágeno y la matriz celular extra al final y mezcle los componentes mediante pipeteo. Las células tienen cardiomiocitos diferenciados de las células madre pluripotentes humanas.

Recoja las células y para cada planta de preparación de biowire prepare 3,5 microlitros de gel de colágeno que contenga medio millón de células. Ahora utilice una punta de pipeta P10 para cargar aproximadamente cuatro mililitros de suspensión en la plantilla de canal de 0,5 centímetros de largo de cada plato. Ajuste la posición de la sutura con pinzas estériles según sea necesario para que quede completamente estirada.

Una vez sembradas las células, asegúrese de volver a suspender siempre la mezcla de células de gel antes de tomar el autoclave para obtener resultados consistentes. Después de cargar los canales, cubra el fondo del plato con PBS estéril asegurándose de no tocar el gel. Esto asegurará que los biocables no se deshidraten durante la polimerización.

Después de incubar los biocables a 37 grados centígrados durante 30 minutos, reemplace el PBS con suficiente medio de cultivo para cubrir las células. 12 mililitros suelen ser suficientes. A continuación, cultive el plato durante una semana, sustituyendo el medio cada dos días.

En un gabinete de bioseguridad, agregue dos mililitros de PBS a cada pocillo de una placa de seis pocillos que albergará una cámara estimuladora eléctrica. Luego, use pinzas estériles para colocar suavemente los dispositivos de autoclave en los pocillos. Una vez en posición, deseche el PBS y reemplácelo con cinco mililitros de medio caliente que debería cubrir completamente las varillas de carbono.

Antes de cultivar las células durante 24 horas, observe la contractilidad de los cardiomiocitos en respuesta a la estimulación eléctrica para asegurarse de que las células están capturando el estímulo eléctrico y respondiendo con contracciones. A continuación, coloque los biocables en la cámara del estimulador eléctrico y oriente los canales perpendicularmente a las varillas de carbono. Extienda los hilos de platino lejos de la placa y luego cubra las placas.

Conecte los cables a un estimulador eléctrico. Configure el estimulador para que entregue pulsos bifásicos de un milisegundo a un hercio y a tres voltios por centímetro. Luego transfiera las preparaciones en el estimulador eléctrico a una incubadora a 37 grados centígrados.

Aumente la tasa de estimulación de forma incremental cada 24 horas desde un hercio en el día cero hasta seis hercios en el día seis. Durante esta semana de cultura, cambia el medio cada dos días. Y observar la contractilidad de los cardiomiocitos a diario.

Después de siete días de precultivo en el bioalambre, las células volvieron a moldear el gel alrededor de la sutura. Las células se ensamblan a lo largo del eje de la sutura para formar tejido cardíaco alineado. Las células que expresaban proteínas contráctiles cardíacas mostraban bandas sarcoméricas en el aparato contráctil y sus miofibrillas estaban alineadas a lo largo del eje de la sutura.

Las células en el biocable exhibieron tasas de proliferación más bajas que las células en cuerpos embrioides. El manejo del calcio mejoró significativamente en los cardiomiocitos cultivados en biocables. El tratamiento con cafeína indujo una liberación brusca de calcio del retículo sacoplásmico.

Tales transitorios se encontraron solo en las células estimuladas. También hubo una frecuencia de estimulación significativamente mayor dependiendo de las amplitudes de liberación de calcio. Además, los cardiomiocitos cultivados en biocables mostraron mejores densidades de hERG y corriente rectificadora interna en comparación con el cultivo en cuerpos embrioides, que mejoró aún más con la estimulación eléctrica.

La mejora de la corriente rectificadora hacia adentro fue consistente con una mayor expresión del canal rectificador hacia adentro de potasio jean, KCN J2. La capacidad de latir espontáneamente fue significativamente mayor en los cardiomiocitos derivados del cuerpo embrioidal en comparación con los biocables controlados. El control mostró una automaticidad comparable a la preparación de biocables sometida al régimen de seis hercios. Una vez dominado, la configuración de los biocables se puede realizar en medio día.

La configuración de la estimulación eléctrica tomará un par de horas y los resultados finales se pueden alcanzar en dos semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los cardiomiocitos diferenciados de diferentes líneas celulares o por diferentes protocolos pueden variar ligeramente en su madurez y pureza. Por lo tanto, puede ser necesario optimizar los parámetros experimentales, como la tasa de estimulación de las células.

Siguiendo este procedimiento, otras condiciones, incluida la variación de la composición celular y la utilización de cardiomiocitos mutantes, se pueden optimizar para responder a una serie de preguntas adicionales.