Name: Aerodinámico unicelular TCR aislamiento y generación de vectores retrovirales para In Vitro y In Vivo expresión de TCR humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Aprende a aislar TCR de células únicas y generar vectores retrovirales para expresión in vitro e in vivo. Este método de PCR en dos pasos permite analizar repertorios de TCR sin conocimiento previo de secuencias.

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Este estudio fue financiado por la JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, DK079638-05 de la P30 del NIH 5 PJ de piloto y el Robert y Janice McNair Foundation.
Agradecemos a Sandra Peña y Andrene McDonald para el reclutamiento de pacientes, Samuel Blum para asistencia técnica, el Dr. George Makedonas por el regalo de control utilizado para la optimización de la PCR de DNA y anticuerpos.

1. identificar la población de la célula de T de interés.
 Nota: antígeno de proliferación específica en combinación con el tinte de la división celular (como éster de succinimidyl Carboxyfluorescein, CFSE) puede utilizarse para aislar las células de T se basa en su proliferación en respuesta a la estimulación antigénica. Si a partir de PBMCs, una expansión de 7 días en vitro debe ser suficiente para identificar un antígeno específico CFSE población bajo 12.
<ol><li>PBMCs de mezcla 1:1 con las células de alimentador MHC-emparejado y etiqueta con tinte 5 de división de célula de la CFSE del μm.</li>
	<li>Placa 2-2.5 x 10 5 células por pocillo en un fondo redondo 96 pocillos placa en 200 μl 10% FCS completo RPMI medios de la cultura. 
	Nota: RPMI completo contiene l-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 m m, 100 μm MEM aminoácidos no esenciales, 5 mM HEPES, 5,5 × 10 &#8722; 5 unidades de 2-Mercaptoetanol, 100 U mL &#8722; 1 penicilina y 100 μg mL &#8722; 1 estreptomicina.</li>
	<li>Estimular células con antígeno de péptido de 25 μm.</li>
	<li>En el cuarto día de la cultura, retire con cuidado y vuelva a colocar 100 μl de los medios de comunicación. 
	Nota: Un enfoque más óptimo para la identificación de células de T específicas de antígeno es el uso de péptido-HLA tetrámeros 13. La tinción de tetrámero permite la evaluación simultánea de la especificidad del antígeno, así como restricción HLA.</li>
</ol> 2. Configurar el tipo de celular solo.
<ol><li>Realizar todos los procedimientos en una campana o un área libre de plantilla amplificado. Alícuota los reactivos para evitar la contaminación, limpie todas las superficies de trabajo y, si es posible, equipo con el 10% lejía antes de la instalación de la polimerización en cadena. Use puntas de filtro, reactivos libres de RNasa y DNasa y plásticos en todas las PCR y vector de clonación pasos. Reactivos claves pueden encontrarse en la Tabla de materiales. 
	Nota: La reacción de polimerización en cadena múltiplex es muy sensible, y bajos niveles de contaminación pueden resultar en el producto amplificado.</li>
	<li>Generar la mezcla principal de transcripción reversa combinando 10 x reacción de RT del almacenador intermediario, 25 X DNTPs, enzima U RT 9 0.01% Triton-X, 0,7 inhibidor de Rnasa de la U y 383 nM de cada cartilla de RT-TCR (enumerada en la tabla 1) en un depósito de pipetas estéril. Para cada placa de 96 pocillos, constituyen suficiente mix master para 10 reacciones adicionales (total 106), para compensar la pérdida de líquido durante el pipeteo. Consulte la tabla 2 para los componentes de reacción y cantidades por bien.</li>
	<li>Preparar una colección de PCR de 96 pocillos placa para celular clasificación por pipeteo 6 μl de la mezcla principal de reversa de la transcripción por pozo con una pipeta multicanal. Mantenga la placa en hielo o en un bloque frío.</li>
	<li>Etiqueta de células con anticuerpos a la célula marcadores de superficie (por ejemplo CD4 y CD3, o CD8 y CD3, cada uno a 2 μg/mL, en combinación con tinte de división celular o la tinción de tetrámero).</li>
	<li>Las células de tipo T en una célula por pozo, omitiendo la fila 12, que servirá como control negativo. 
	Nota: La eficiencia de la clase dependerá de la alineación de la placa precisa colección dentro del sostenedor de la placa, así como mantener las células y las placas a una temperatura baja antes de la reacción de cDNA. Placas de colección deben tener hielo en todo momento, excepto durante la clasificación, cuando son fijos dentro de la placa de enfriamiento. Clasificadores no todos cuentan con un soporte de placa regulado de temperatura; sin embargo, se recomienda encarecidamente el uso de uno. Puesto que el tipo toma generalmente alrededor 10-15 min por placa, hay un mayor potencial para la degradación de RNA si la placa no se mantiene a baja temperatura.</li>
	<li>Como control positivo, añadir un mayor número de células (100) manualmente con una pipeta a uno de los pozos en esta etapa. Por otra parte, previamente aislado ARN de células agrupadas puede utilizarse como control positivo a 10 ng por bien. 
	Nota: Pipetear control purificado RNA con precisión y cuidado para evitar la contaminación cruzada de otros pozos y falsos positivos.</li>
	<li>La placa con la película adhesiva del sello y desactivación a 1000 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Inmediatamente transcribir RNA a cDNA por incubar la placa a 25 ° C durante 10 min, 37 º C durante 45 minutos y 85 ° C durante 10 minutos 
	Nota: Para asegurar la eficaz reacción de PCR, se recomienda que la primera reacción de PCR se realizó el mismo día. Por otra parte, las placas transcritas pueden conservarse en-80 ° C hasta por 2 meses.</li>
</ol> 3. Realizar PCR anidado multiplex Nota: preparar todos los mixes de maestro en una zona libre de plantilla para evitar la contaminación.
Cartilla de <ol><li>reconstituir cada región variable a 100 μm con DNasa y Rnasa free H 2 O. A continuación, combinar 20 μl de cada uno de los 44 iniciadores para generar la piscina de la cartilla de V-alfa. Para generar la beta V piscina primer combinan 20 μl de cada uno de los iniciadores de V-beta 40 y 80 μl de DNasa y Rnasa free H 2 O. cartilla secuencias aparecen en la tabla 1. Una vez agrupados, la concentración de cada cebador en la mezcla es 2.3 μm.</li>
	<li>Reconstituir los iniciadores de la región constante de solución stock de 100 μm con DNasa y Rnasa free H 2 O. diluir los iniciadores de la región constante a 10 μm trabajo solución y alícuota para uso.</li>
	<li>Preparar dos mezclas de maestro separadas para la amplificación de la TCR-alfa y TCR-beta. Generar las mezclas maestras combinando 5 X buffer, 80 piscina de cartilla μm dNTPs, 3% de DMSO, 2 μm (concentración final de 46 nM para cada cartilla), 200 nM TCR constante región inversa la cartilla, 1 U ADN polimerasa y DNasa y Rnasa free H 2 O (tabla 2 
	Nota: Los cálculos se basan en el volumen final de la PCR de 25 μl por pocillo, donde 22,5 μl mezclar maestro de PCR se combina con plantilla de cDNA de 2.5 μl.</li>
	<li>Mantenga la placa con cDNA en hielo o en un bloque frío. Utilice un multicanal para pipetear 22,5 μl de reacción de TCR-beta en una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Luego usar un multicanal para transferir 2.5 μl de cDNA a la placa PCR.</li>
	<li>Utilizar un multicanal para pipetear 22,5 μl de reacción de la TCR-alfa directamente en la placa que contiene el resto del cDNA.</li>
	<li>Sello las placas con el adhesivo suavemente vortex y vuelta abajo a 1000 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ejecutar la reacción de PCR multiplex con los siguientes ciclos: 5 min a 95 ° C seguido de 34 ciclos de 20 s a 95 ° C, 30 s a 54 ° C y 1 min a 72 ° C, seguido de 7 min a 72 ° C.</li>
	<li>Llevar a cabo la reacción de PCR anidada en un volumen final de 25 μl, usando 2,5 μl de la mezcla PCR múltiplex como plantilla.
	<ol><li>Reconstituir los cebadores internos y adaptador a 100 μm con DNasa y Rnasa libre H 2 O. hacer 10 μm alícuotas del material de trabajo.</li>
		<li>Preparar dos mezclas de maestro separadas para ampl TCR-alfa y TCR-betamostr. Mezcla 5 X buffer, 25 X DNTP, 3% DMSO, 200 nM adaptador hacia adelante la cartilla, cartilla anidados inversa de 200 nM, 1 U ADN polimerasa y polimerasa de la DNA y libre de nucleasas H 2 O para un volumen final de 22.5 μl (tabla 2). Para cada placa de 96 pocillos, constituyen suficiente mix master para 10 reacciones adicionales (total 106), para compensar la pérdida de líquido durante el pipeteo. 
		Nota: En el segundo uso de la reacción de PCR el 5 X PCR de búfer que contiene colorante de carga para facilitar la carga del gel de la agarosa.</li>
		<li>Usando un multicanal, pipeta la mezcla principal para las reacciones TCR-alfa y TCR-beta en 22.5 μl por pocillo en dos placas de PCR de 96 pocillos nueva.</li>
		<li>Añadir la plantilla de la reacción de PCR multiplex en 2,5 μl por pocillo. 
		Nota: La primera reacción de PCR quedan sellada y almacenada a-20 ° C para servir como una fuente de plantilla adicional, si es necesario (ver Nota 4.3).</li>
		<li>Sellar las placas, suavemente vortex y vuelta abajo a 1000 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ejecutar la reacción de PCR anidada con los siguientes ciclos: 5 min a 95 ° C seguido de 34 ciclos de 20 s a 95 ° C, 30 s a 56 ° C y 1 min a 72 ° C, seguido de 7 min a 72 ° C.</li>
		<li>Ejecutar 5 μl de la reacción final hacia fuera en una agarosa 1% gel con bromuro de etidio (incluyendo los pocillos de control positivo y negativo). 
		Nota: La banda esperada debe ejecutarse en tamaño de bp alrededor de 500. Un ejemplo de reacción se muestra en la figura 2.</li>
		<li>Purifica el resto de la segunda reacción (20 μl) utilizando un formato de 96 pocillos kit PCR purificación, eluir con 15 μl de 70 ° C H 2 O por pozo y realizar Sanger secuenciación. Usar el apropiado alfa de TCR o TCR-beta adaptador delantero cartilla de secuenciación (tabla 1). 
		Nota: Secuencias pueden ser analizadas con el software de inmunogenética disponibles en línea.</li>
	</ol></li></ol> 4. Clonación las cadenas de polimerización en cadena alfa y beta.
 Nota: la piscina de los cebadores adelantados utilizados en la primera reacción y los iniciadores inversos en la segunda reacción de PCR se utilizan para incorporar sitios de restricción. Por lo tanto, los productos PCR obtenidos alfa y beta cadena están listos para ser secuencialmente el clonado en el vector retroviral de la plantilla ( figura 1).
Productos <ol><li>Resumen la PCR purificada de la beta anidados reacción con BstbI y MfeI (tabla 3). 
	Nota: No sobrepase 5 μg insertar.</li>
	<li>En paralelo, digerir el vector plantilla con BstbI y MfeI (tabla 3). Utilice 1-2 μg del vector de la plantilla por el TCR. Ejecutar el vector digerido en un gel de agarosa y aislar la banda más grande (~ 7500 bp). Purificar el vector con un gel kit purificación DNA. 
	Nota: Durante la recopilación de la enzima de la restricción, murino TCR-beta variable región de la plantilla se quita, lo que permite la adición de la región variable de TCR-beta humana.</li>
	<li>Purificar los productos PCR digeridos utilizando un kit de purificación PCR. 
	Nota: Comprobar la capacidad de purificación de ADN de las columnas incluidas en el kit; utilizar varias columnas si es necesario. La cantidad mínima de un purificado inserto necesario para una reacción de ligadura acertada es de 50 ng en una concentración mínima de 10 ng/μl. Si la cantidad de inserción purificada no es suficiente para una ligadura acertada, la segunda reacción de PCR puede repetirse.</li>
	<li>Tratar el vector plantilla con 10 enzima U CIP durante 1 h a 37 ° C para evitar la uno mismo-ligadura, seguida por la inactivación de calor durante 10 minutos a 75 ° C. purifica el ADN con un kit de potabilización de PCR (tabla 3).</li>
	<li>Ligan TCR-beta Inserte y vector con ligase de la DNA en un volumen total de 20 μl en 6 exceso molar de la estufa durante 30 min a temperatura ambiente. 
	Nota: En total, la reacción de la ligadura debe contener unos 150 ng de ADN (tabla 3).</li>
	<li>De transformaciones, mezclar 8 μl de la reacción de la ligadura con 80 μl de células químicamente competentes de e. coli DH5α (Tabla de materiales) e incubar en hielo durante 30 min choque térmico a 42 ° C por 45 s. Añadir 500 μl Super Caldo óptimo medio de Catabolito supresión (novedosa) y agitar durante 1,5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Placa salida 250 μl de cultivo bacteriano en una ampicilina que contiene la placa de agar caldo de lisogenia (LB). Incubar la placa durante la noche (~ 16 h) a 37 ° C.</li>
	<li>Al día siguiente elegir colonias bacterianas y crece en medio de 3 mL LB con ampicilina durante la noche. Aislar el DNA plasmídico utilizando el kit de purificación de DNA plasmídico.</li>
	<li>Confirmar la inserción exitosa de la cadena beta, un pequeños Resumen de prueba con las enzimas de restricción BstbI y MfeI. En un volumen de reacción total μl 12, combinar 200-500 μg plásmido ADN y 0.25 μl de cada enzima tampón de enzima X 10 (tabla 3). Ejecutar la reacción hacia fuera en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio para confirmar el tamaño de la banda de insertar (~ 500 bp).</li>
	<li>Después de confirmar la presencia de la inserción, la secuencia de la sección de TCR-beta del vector usando la cartilla reversa IRES (tabla 1).</li>
	<li>Tras la confirmación de la secuencia del inserto de TCR-beta, realizar un proceso similar para la inserción de la región variable alfa. Digerir los productos PCR purificados de la reacción anidada alfa y la inserción de TCR-beta recién generada con vector, con SnaBI y SacII. 
	Nota: Durante la recopilación de la enzima de la restricción, la región variable TCR-alfa murina plantilla se retira, permitiendo la incorporación de la región variable de TCR-alfa humana.</li>
	Alfa <li>ligan inserta en vectores TCR que codifican la región variable beta correspondiente con ligase de la DNA en un volumen total de 20 μl en 6 exceso molar de la estufa durante 30 min a temperatura ambiente. 
	Nota: En total, la reacción de la ligadura debe contener unos 150 ng de ADN (tabla 3).</li>
	<li>Para transformaciones, mezclar 8 μl de la reacción de la ligadura con 80 μl de células químicamente competentes de e. coli DH5α (Tabla de materiales) e incubar en hielo durante 30 min choque térmico a 42 ° C por 45 s. Añadir 500 μl novedosa medio y agitar durante 1,5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Placa salida 250 μl de cultivo bacteriano en una ampicilina que contiene la placa de agar caldo de lisogenia (LB). Incubar la placa durante la noche (~ 16 h) a 37 ° C.</li>
	<li>Al día siguiente elegir colonias bacterianas y crece en medio de 3 mL LB con ampicilina durante la noche. Aislar el DNA plasmídico utilizando el kit de purificación de DNA plasmídico.</li>
	<li>Confirmar la inserción exitosa de la cadena alfa por un pequeños Resumen de prueba con las enzimas de restricción SnaBI y SacII. En un volumen de reacción total 12 μl mezclar 200-500 μg ADN plásmido, 0.25 μl de cada enzima y tampón de enzima x 10 (tabla 3). Ejecutar la reacción hacia fuera en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio para confirmar el tamaño de la banda de insertar (~ 500 bp).</li>
	<li>Después de confirmar la presencia de la inserción, la secuencia de la sección de TCR-alfa del vector usando la cartilla de MSCV2-forward (tabla 1).</li>
	<li>Una vez que se valida la secuencia de la cadena alfa, verificar la completa inserción TCR por secuenciación con el primer TCR-beta-inversión y IRES-inversa (tabla 1).</li>
</ol> 5. Verificar la expresión superficial de la célula TCR y especificidad.
 Nota: las células HEK293T se utilizan para probar acertado TCR cadena pariNG y célula superficial expresión ( Figura 3A) 8. La tinción de tetrámero de péptido-MHC puede realizarse también en las células transfected HEK293T para comprobar la retención de aislamiento de genes TCR especificidad antigénica post ( figura 3B).
<ol><li>Placa de células HEK293T en placas de cultivo de tejidos 12-bien en 1 x 10 5 células por pocillo en 1 mL completo DMEM medios conteniendo 5% FCS y la cultura durante la noche a 37 ° C. placa suficientes células han señalado pocillos distintos para cada nueva TCR , control plantilla TCR vectores, CD3 vectores solamente, control vector TCR solamente y no transfectadas bien. 
	Nota: Transfección con una plantilla totalmente ratón TCR vector (mTCR-pMIA) en combinación con el vector de mCD3εγδζ-pMIG, mTCR-pMIA vector solo, y mCD3εγδζ-pMIG vector solo se usan como controles positivos y negativos. 
	Nota: DMEM completo contiene 2 mM L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 μm no esenciales aminoácidos, 5 mM HEPES buffer, 5.5 x 10 -5 unidades de 2-Mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Al día siguiente, transfectar las células con el vector h/mTCR-pMIA quimérica de 1 μg, 1 μg del ratón CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vector y un reactivo de transfección basada en liposomas siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Para cada TCR, añadir 6 μl de reactivo de transfección a 100 μl de temperatura, DMEM libre de suero. Brevemente vortex e incubar a temperatura ambiente durante 15 min</li>
	<li>En separado 1,5 mL tubos combinan 1 μg de TCR-pMIA vector con 1 μg del ratón CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vector o 1 μg de cada vector separado para los controles de.</li>
	<li>Dropwise, añadir la solución DMEM/reactivo de transfección para los tubos que contienen el vector de ADN. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min</li>
	<li>Dropwise, añadir la solución de ADN de DMEM de reactivo de transfección de las células HEK293T. Golpear suavemente la placa para mezclar. Incubar a 37 ° C durante 24 h.</li>
	<li>Después de 24 h reemplazar los medios de comunicación y mantener las células en cultivo por más de 24 h.</li>
	<li>Extraer las células de la placa mediante pipeteo vigoroso y teñir las células con el anticuerpo anti-ratón CD3 (2,5 μg/mL) para verificar la expresión superficial de la quimérica-TCR mediante citometría de flujo.</li>
	<li>Para comparar la expresión de CD3 entre células fueron transfectadas a un nivel similar, el análisis de las células que expresan un nivel alto de moléculas reportero fluorescente (GFP para complejo CD3 y ametrina de vectores de expresión de TCR) similar de la puerta. Óptimo, el análisis debe ser cerrado GFP + ametrina + células dentro de los 10 4 10 5 intensidad fluorescente ( Figura 3A). 
	Nota: El nivel de expresión de CD3 en células transfectadas con la construcción quimérica debe ser comparable al vector control ratón (original plantilla) ( Figura 3A). Los vectores retrovirales de TCR generados son compatibles con sistemas de expresión de vivo como se describió anteriormente 4.</li>
</ol>

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<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el actual protocolo, describimos un método eficiente para la célula TCR amplificación y posterior sub clonación de las cadenas de alfa y beta TCR de pares en un vector de expresión retroviral de la plantilla. Aunque se han desarrollado varios protocolos PCR unicelular, ninguno hasta ahora han sido compatible con la inmediata sub clonación en un vector de expresión. En la mayoría de los casos, se amplifica una secuencia parcial que abarca las regiones CDR3 altamente variables, con suficiente secuencia para extrapolar l...

El receptor T (TCR) dicta decisión de destino de la célula de T durante el desarrollo, homeostasis de estado estacionario y estimulación antigénica en la periferia1,2,3. La reciente expansión de tecnologías de secuenciación profunda ha descubierto una diversidad TCR anteriormente subestimada en las respuestas de células T específicas de antígeno. Diversidad de los TCR sugiere un potencial de respuestas de células T funcionalmente amplia. Para integrar el análisis de repertorio TCR secuencia con análisis funcionales de TCR, los métodos de secuenciación deben ser diseñados para ser compatible con sistemas experimentales y en vivo los modelos utilizados para el posterior análisis funcional de selección TCR. Hemos desarrollado un enfoque eficiente para el aislamiento de secuencia TCR humano y racionalizar el clonación en un vector de plantilla TCR quimérico humano/ratón compatible con la expresión del TCR en ratones humanizados HLA4. Aislamiento de cadenas alfa y beta correspondientes de heterodiméricos TCRs requiere amplificación por PCR de dos cadenas de una sola célula. Aunque, varios protocolos de clonación de TCR unicelulares han sido elaborados y utilizados, ninguno hasta ahora han sido fácilmente compatible con alto rendimiento aerodinámico directa clonación de desconocido/Vβ Vα TCRs en vectores retrovirales necesarios para re-expresión en vivo 4,5,6,7. Estudios previos han utilizado dos enfoques principales, ya sea para amplificar selectivamente una porción limitada del TCR suficiente para extrapolar la secuencia, o para amplificar el TCR toda secuencia4,5,6 , 7. río abajo el análisis funcional de TCR secuencias obtenidas mediante la primera aproximación requiere costosas en silico Asamblea y novo de construcción del TCR. Mientras que el segundo enfoque proporciona la secuencia completa del TCR, la región constante humana no es compatible con la expresión en vivo de los TCRs clonadas en modelos de ratón. Nuestro enfoque está específicamente diseñado para ser compatible con en vivo análisis funcional de TCR en modelos de ratón. Hemos desarrollado una eficiente y ágil sola célula protocolo PCR que permite la directa sub clonación de fragmentos PCR en el vector de expresión de la plantilla.
Nuestro enfoque utiliza una muy sensible multiplex nested PCR reacción que se realiza en dos pasos. En la primera reacción multiplex paso una piscina de 40 cebadores específicos para todas las cadenas de beta V y una piscina de 44 cartillas específicas para todas las cadenas alfa de V se utilizan para amplificar la alfa de TCR o TCR-beta sin el conocimiento previo de la secuencia (tabla 1). El primer avance tiene una secuencia de adaptador, que se incorpora a los 5' del producto PCR. El primer revés se basa en la región constante del TCR. Se han identificado sitios de restricción únicos que están ausente de variable humana o regiones de la ensambladura TCR e incorporado en el nuevo y rediseñado TCRα y TCRβ primers (figura 1). En la segunda reacción anidada, una cartilla específica para la secuencia del adaptador y una cartilla reversa anidada dentro de la región constante se utilizan para amplificar más lejos las cadenas TCR con mayor especificidad (tabla 1, figura 1). Después de aislamiento de células individuales, dos rondas de PCR (reacción primera con un grupo de iniciadores Vα y Vβ y la segunda con las cartillas de adaptador) resultan en un producto PCR que puede ser directamente los clonados en el vector retroviral de la plantilla. La construcción final del TCR a codificar, en un marco de solo lectura abierta (ORF), regiones variables humanos combinados con regiones constantes del ratón conectadas por el 'Self-Hendedoras' secuencia de la proteína, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. La secuencia de P2A se ha utilizado en múltiples sistemas y ha sido extensivamente probada específicamente para la expresión de TCR8,9,10,11. Aunque, después traducción en al mayoría de los restos de la secuencia de P2A el c-terminal de la cadena alfa conectada por un linker flexible, mientras que la secuencia de la señal de cadena beta tiene una prolina adicional, esta modificación no tiene ningún efecto perjudicial sobre la función TCR. La región constante del ratón se utiliza en la construcción en lugar de humanos para evitar potenciales interacciones alteradas con componentes de señalización corriente abajo cuando vuelva a expresado en células de ratón. El ORF solo resultará en expresión estequiométrica separado de las cadenas alfa y beta9,11. El protocolo actual se basa en los reactivos y los enfoques que están ampliamente disponibles y está diseñado para realizarse de manera ágil y eficiente. Aunque específicamente hemos utilizado esta técnica para análisis TCR de las células T auto reactivas implicadas en la diabetes autoinmune, Anticipamos que este protocolo puede ser extensamente aplicable para la identificación y evaluación funcional de TCR humano específico para epitopos autoinmune, cáncer epitopos o respuestas a patógenos y vacunas.

<table><tbody><tr><td>CFSE&nbsp;</td><td>eBiociencia&nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-humano CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>de CD3 (OKT3) antihumano PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-ratón CD3 AF647</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>100322</td><td>2,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa recombinante biotech grd 2.5KU&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Kit RT de ADNc de alta capacidad&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (enzima RT)&nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Agua sin nucleasa 1000mL</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq ADN polimerasa 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Placa de PCR de media falda</td><td>de pozo Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Película adhesiva transparente&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>4306311</tr><tr><td>Agarosa ultrapura&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>Biolabs de Nueva Inglaterra&nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (inserto) 30 U (vector)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (inserto) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (inserto) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (inserto) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>Fosfatasa intestinal (CIP) de terneroNew</td> <td>England Biolabs&nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Ligasa rápida&nbsp;</td><td>Biolabs de Nueva Inglaterra&nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps sistemas de purificación de ADN&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps Sistemas de purificación de ADN&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>Kit de limpieza y concentrador de ADN-25</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 Kit de limpieza y concentrador de ADN-5</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAkit de purificación de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Eficiencia de subclonación DH5a Células competentes&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>18265017</tr><tr><td>Transit LT-1 Reactivo 1mL (reactivo de transfección)</td><td>Mirus&nbsp;</td><td></td><td></td>MIR2300</tr><tr><td>BD FACS Aria II (clasificador)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (citómetro de flujo)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aerodinámico unicelular tcr aislamiento y generación de vectores retrovirales para in vitro y in vivo expresión de tcr humana

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Aunque se han desarrollado varios métodos para la secuencia de pares T cell receptor (TCR) alfa y beta las cadenas de las células T, ninguno hasta ahora han sido propicias para abajo en vivo análisis funcional de TCR heterodímeros. Hemos desarrollado un protocolo mejorado basado en una PCR multiplex nested dos pasos, que se traduce en un producto PCR que se extiende por toda las regiones variables de un humano cadenas alfa y beta TCR. Por identificación de sitios de restricción únicos e incorporarlos en los iniciadores PCR, hemos hecho el producto PCR compatible con directa sub clonación en el vector retroviral de la plantilla. El constructo retroviral resultante codifica un quimérico humano/ratón TCR con un dominio intracelular de ratón, que es funcional en células de ratón o en modelos de ratón en vivo . En general, el protocolo descrito aquí combina humano unicelular emparejado TCR alfa y beta cadena identificación con generación optimizada de vectores retrovirales fácilmente adaptables para la expresión de TCR in vitro e in vivo . El video y el material que lo acompaña están diseñados para dar una descripción muy detallada de la célula PCR, para que los pasos críticos pueden ser seguidos y potenciales peligros evitar. Además, ofrecemos una descripción detallada de las medidas clonaje necesarias para generar el vector de expresión. Una vez dominado, todo el procedimiento de célula clasificación a expresión de TCR puede realizarse en un corto período de dos semanas.

La eficiencia de la reacción de PCR anidado multiplex se comprueba en el paso 3.2.7 (figura 2) ejecutando a 5μl de la segunda reacción en un gel de agarosa. En promedio se espera que la eficiencia de amplificación de TCR-beta sería alrededor del 80%, mientras que la eficiencia de la reacción de la TCR-alfa es generalmente más baja, en torno al 50%4. Sólo emparejadas cadenas TCR-alfa y TCR beta pueden utilizarse para la expresión del TC...

El actual combina protocolo célula emparejados humano TCR alfa y beta cadena secuenciación con optimiza generación de vectores retrovirales compatibles con expresión de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinámico unicelular TCR aislamiento y generación de vectores retrovirales para In Vitro y In Vivo expresión de TCR humana

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como el repertorio de TCR alfa y beta de la población específica de un antígeno, así como la funcionalidad in vivo de los TCR humanos. Las principales ventajas de esta técnica son la eficiencia relativamente alta de la reacción de PCR, así como su compatibilidad con la clonación posterior de TCR. Este protocolo utiliza una PCR de dos pasos para amplificar las cadenas alfa y beta de TCR desde una sola célula sin conocimiento previo de la secuencia TCR.La primera PCR es una reacción múltiplex que utiliza un conjunto de cebadores específicos de región variable alfa o beta junto con un cebador específico para la región constante. La segunda PCR es una reacción anidada que se ceba a partir de la secuencia adaptadora incorporada en el extremo cinco primo del producto PCR, así como una secuencia de región constante interna. Estos cebadores también incorporan sitios de restricción únicos en los cinco extremos principales y tres primarios del producto de PCR para facilitar la clonación posterior.Una vez clonada en el vector plantilla, la secuencia TCR codificada es quimérica, y consta de regiones variables humanas con regiones constantes de reflejo. La construcción quimérica del TCR permite la interacción entre el TCR y el complejo de señalización CD3 espejo, lo que hace que este protocolo de clonación del TCR sea compatible con estudios funcionales posteriores en líneas celulares espejo y en modelos de ratón humanizados. Configure la clasificación de células individuales preparando los reactivos de transcripción inversa en un área limpia y sin plantillas.Por lo general, las personas nuevas en el método de PCR de una sola célula tendrán dificultades debido a los bajos niveles de plantilla. Por otro lado, la sensibilidad de la PCR anidada multiplex es sensible a bajos niveles de contaminación de la plantilla. Por lo tanto, es necesario limpiar a fondo las áreas en las que se configurarán las reacciones de PCR.En esta reacción se utiliza una mezcla de tres cebadores inversos específicos para la región constante de las cadenas alfa y beta. Prepare la mezcla maestra de transcripción inversa combinando reactivos en un depósito de pipeteo. Para tener en cuenta el error de pipeteo, prepare suficiente mezcla de reacción para diez pocillos adicionales.Utilice un multicanal para pipetear seis microlitros por pocillo en una placa de PCR de 96 pocillos. Cubra el plato sin apretar con un sello y mantenga el plato en hielo. Prepare las células T para la clasificación de células individuales tiñendo las células con anticuerpos contra los marcadores de superficie celular.Clasifique las células T a la vez celda por pocillo mientras deja vacía la fila doce, que servirá como control negativo. Selle la placa con una película adhesiva y gire a 1000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Ejecute inmediatamente la reacción de transcripción inversa.Si es posible, realice la primera reacción de PCR el mismo día. Para ejecutar la reacción multiplex, mezcle por separado las mezclas maestras de PCR V alfa y V beta en depósitos de pipeteo. Mantenga el plato con ADNc en hielo o en un bloque frío.Transfiera 22,5 microlitros de reacción beta de TCR a una nueva placa de PCR de 96 pocillos. A continuación, utilice un multicanal para transferir 2,5 microlitros de ADNc a la placa de PCR. Utilice un multicanal para pipetear 22,5 microlitros de reacción alfa TCR directamente en la placa que contiene el resto del ADNc.Selle las placas con adhesivo, haga un vórtice suave y gire brevemente hacia abajo. Ejecute la primera reacción de PCR. Los platos se pueden almacenar a 20 grados centígrados.Al día siguiente, prepare las segundas reacciones de PCR anidadas. Utilizando un multicanal, pipetee las mezclas maestras para las reacciones TCR alfa y TCR beta a 22,5 microlitros por pocillo en dos nuevas placas de PCR de 96 pocillos. Agregue la plantilla de reacción de PCR multiplex a 2,5 microlitros por pocillo.Selle las placas, haga un vórtice suave y gire brevemente hacia abajo. La primera reacción de PCR restante debe sellarse y almacenarse a 20 grados centígrados para que sirva como fuente de plantilla de respaldo. Realice la segunda reacción de PCR.Una vez completada la segunda reacción de PCR anidada, ejecute cinco microlitros de la reacción en un gel de agarosa al 1%. Incluya los pozos de control positivo y negativo. La banda esperada debería tener un tamaño de alrededor de 500 pares de bases.Purificar el resto de la segunda reacción, veinte microlitros, utilizando un kit de purificación de PCR de formato de 96 pocillos y realizar la secuenciación Sanger. Las secuencias de TCR obtenidas pueden analizarse utilizando software inmunogenético disponible en línea. La información de la secuencia se puede utilizar para evaluar el repertorio y la clonalidad de la población de células T.Las secuencias alfa y beta de TCR emparejadas se pueden utilizar en análisis funcionales posteriores. Realice ligaduras consecutivas de TCR beta y TCR alfa en el vector de plantilla. La plantilla TCR beta y TCR alfa se sustituyen por las cadenas amplificadas de PCR.En la primera ligadura, la plantilla TCR beta se sustituye por la cadena beta amplificada por PCR. Una vez que se haya verificado la inserción correcta de TCR beta mediante la secuenciación de resumen de prueba, reemplace la plantilla TCR alfa por la cadena alfa amplificada por PCR. HEK293T celdas se utilizan para probar el emparejamiento exitoso de la cadena TCR y la expresión de la superficie celular.HEK293T células se transfectan conjuntamente con el vector TCR marcado por el reportero fluorescente de ametrina y un vector que codifica el complejo CD3 marcado por GFP. La expresión superficial del TCR quimérico se verifica mediante citometría de flujo mediante la tinción de las células con el anticuerpo CD3 anti-ratón. El nivel de expresión de CD3 en la superficie de las células transfectadas con la construcción TCR quimérica debe ser comparable a las transfectadas con el vector plantilla de control totalmente simétrico.En resumen, hemos descrito un protocolo eficiente basado en PCR para la identificación y clonación de cadenas TCR emparejadas a partir de células individuales. Anticipamos que esta será una herramienta valiosa para estudiar las respuestas de las células T humanas en la autoinmunidad, la vigilancia tumoral y la eliminación de patógenos. La principal ventaja del protocolo de PCR aquí descrito es su compatibilidad con estudios posteriores in vitro e in vivo.

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Estamos aquí demostrar que la reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) puede ser utilizado como una herramienta para generar modelos de ratones con la pre-definido de receptores de células T (TCR) especificidades. Estos ratones transnuclear expresar la correspondiente TCR de su locus endógeno bajo el control del promotor endógeno.

Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Se presenta un protocolo para producir antígenos específicos de células T de ratón usando la transducción...

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

La manipulación de la expresión génica temporal en la diferenciación de células madre embrionarias (ESC) se puede lograr utilizando sistemas de genes inducibles. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares es costosa y requiere mucho tiempo. Este protocolo logra la expresión rápida de un transgén en la diferenciación de células derivadas de ES y el posterior análisis de la diferenciación hematopoyética posterior.

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

Presentamos un protocolo rápido y flexible para un sistema de expresión in vivo basado en un solo receptor de células T (TCR) retroviral.  Los vectores retrovirales se utilizan para transducir células progenitoras de la médula ósea con el fin de estudiar el desarrollo y la función de las células T in vivo como alternativa a los ratones transgénicos TCR.

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

Aquí se describe un nuevo método para generar receptores de células T específicas de antígeno (TCR) por el emparejamiento de la TCRα o TCR de un TCR existente, que posee la especificidad de antígeno de interés, con hemichain complementaria del repertorio de receptores de células T periféricas. Los TCR de novo generados conservan especificidad de antígeno con afinidad variable.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Presentamos un protocolo para la transducción retroviral de ARN guía en células T primarias de ratones transgénicos Cas9, proporcionando una alternativa eficiente para la edición de genes en el estudio de la diferenciación Th17.

Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Presentamos protocolos mejorados para la transducción retroviral de receptores de tráfico y el homing competitivo para estudiar el posicionamiento de linfocitos específicos de órganos y microambientes mediados por receptores. Este método ofrece información valiosa sobre los mecanismos de tráfico de células inmunitarias y tiene aplicaciones potenciales en futuras investigaciones básicas y terapéuticas.

Transducción retroviral eficiente y localización competitiva para investigar la localización de células T mediada por GPCR en diversos microentornos tisulares

Se proporciona un protocolo detallado para el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para lograr un knock-in dirigido altamente eficiente de grandes construcciones multicistrónicas en células T humanas primarias a través de la vía de reparación del ADN de unión de extremos mediada por homología (HMEJ). Las células T diseñadas con este protocolo adaptable a las buenas prácticas de fabricación actuales mantienen una excelente expansión celular, citotoxicidad y producción de citocinas.

Ingeniería no viral de células T humanas primarias mediante la integración dirigida de grandes plantillas de ADN mediada por homología

Este protocolo describe los pasos esenciales para el cultivo de células T primarias, incluyendo su aislamiento, activación, expansión y transfección transitoria mediante electroporación de ARNm. Además, se propone un flujo de trabajo y un panel de anticuerpos para el análisis citométrico de flujo del fenotipo, marcadores de activación, viabilidad y expresión del receptor quimérico de antígenos (CAR).

Aislamiento, cultivo y transfección transitoria de células T humanas primarias para generar células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)

Aprende a aislar TCR de células únicas y generar vectores retrovirales para expresión in vitro e in vivo. Este método de PCR en dos pasos permite analizar repertorios de TCR sin conocimiento previo de secuencias.

Aerodinámico unicelular TCR aislamiento y generación de vectores retrovirales para In Vitro y In Vivo expresión de TCR humana

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