Aerodinámico unicelular TCR aislamiento y generación de vectores retrovirales para In Vitro y In Vivo expresión de TCR humana

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como el repertorio de TCR alfa y beta de la población específica de un antígeno, así como la funcionalidad in vivo de los TCR humanos. Las principales ventajas de esta técnica son la eficiencia relativamente alta de la reacción de PCR, así como su compatibilidad con la clonación posterior de TCR. Este protocolo utiliza una PCR de dos pasos para amplificar las cadenas alfa y beta de TCR desde una sola célula sin conocimiento previo de la secuencia TCR.

La primera PCR es una reacción múltiplex que utiliza un conjunto de cebadores específicos de región variable alfa o beta junto con un cebador específico para la región constante. La segunda PCR es una reacción anidada que se ceba a partir de la secuencia adaptadora incorporada en el extremo cinco primo del producto PCR, así como una secuencia de región constante interna. Estos cebadores también incorporan sitios de restricción únicos en los cinco extremos principales y tres primarios del producto de PCR para facilitar la clonación posterior.

Una vez clonada en el vector plantilla, la secuencia TCR codificada es quimérica, y consta de regiones variables humanas con regiones constantes de reflejo. La construcción quimérica del TCR permite la interacción entre el TCR y el complejo de señalización CD3 espejo, lo que hace que este protocolo de clonación del TCR sea compatible con estudios funcionales posteriores en líneas celulares espejo y en modelos de ratón humanizados. Configure la clasificación de células individuales preparando los reactivos de transcripción inversa en un área limpia y sin plantillas.

Por lo general, las personas nuevas en el método de PCR de una sola célula tendrán dificultades debido a los bajos niveles de plantilla. Por otro lado, la sensibilidad de la PCR anidada multiplex es sensible a bajos niveles de contaminación de la plantilla. Por lo tanto, es necesario limpiar a fondo las áreas en las que se configurarán las reacciones de PCR.

En esta reacción se utiliza una mezcla de tres cebadores inversos específicos para la región constante de las cadenas alfa y beta. Prepare la mezcla maestra de transcripción inversa combinando reactivos en un depósito de pipeteo. Para tener en cuenta el error de pipeteo, prepare suficiente mezcla de reacción para diez pocillos adicionales.

Utilice un multicanal para pipetear seis microlitros por pocillo en una placa de PCR de 96 pocillos. Cubra el plato sin apretar con un sello y mantenga el plato en hielo. Prepare las células T para la clasificación de células individuales tiñendo las células con anticuerpos contra los marcadores de superficie celular.

Clasifique las células T a la vez celda por pocillo mientras deja vacía la fila doce, que servirá como control negativo. Selle la placa con una película adhesiva y gire a 1000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Ejecute inmediatamente la reacción de transcripción inversa.

Si es posible, realice la primera reacción de PCR el mismo día. Para ejecutar la reacción multiplex, mezcle por separado las mezclas maestras de PCR V alfa y V beta en depósitos de pipeteo. Mantenga el plato con ADNc en hielo o en un bloque frío.

Transfiera 22,5 microlitros de reacción beta de TCR a una nueva placa de PCR de 96 pocillos. A continuación, utilice un multicanal para transferir 2,5 microlitros de ADNc a la placa de PCR. Utilice un multicanal para pipetear 22,5 microlitros de reacción alfa TCR directamente en la placa que contiene el resto del ADNc.

Selle las placas con adhesivo, haga un vórtice suave y gire brevemente hacia abajo. Ejecute la primera reacción de PCR. Los platos se pueden almacenar a 20 grados centígrados.

Al día siguiente, prepare las segundas reacciones de PCR anidadas. Utilizando un multicanal, pipetee las mezclas maestras para las reacciones TCR alfa y TCR beta a 22,5 microlitros por pocillo en dos nuevas placas de PCR de 96 pocillos. Agregue la plantilla de reacción de PCR multiplex a 2,5 microlitros por pocillo.

Selle las placas, haga un vórtice suave y gire brevemente hacia abajo. La primera reacción de PCR restante debe sellarse y almacenarse a 20 grados centígrados para que sirva como fuente de plantilla de respaldo. Realice la segunda reacción de PCR.

Una vez completada la segunda reacción de PCR anidada, ejecute cinco microlitros de la reacción en un gel de agarosa al 1%. Incluya los pozos de control positivo y negativo. La banda esperada debería tener un tamaño de alrededor de 500 pares de bases.

Purificar el resto de la segunda reacción, veinte microlitros, utilizando un kit de purificación de PCR de formato de 96 pocillos y realizar la secuenciación Sanger. Las secuencias de TCR obtenidas pueden analizarse utilizando software inmunogenético disponible en línea. La información de la secuencia se puede utilizar para evaluar el repertorio y la clonalidad de la población de células T.

Las secuencias alfa y beta de TCR emparejadas se pueden utilizar en análisis funcionales posteriores. Realice ligaduras consecutivas de TCR beta y TCR alfa en el vector de plantilla. La plantilla TCR beta y TCR alfa se sustituyen por las cadenas amplificadas de PCR.

En la primera ligadura, la plantilla TCR beta se sustituye por la cadena beta amplificada por PCR. Una vez que se haya verificado la inserción correcta de TCR beta mediante la secuenciación de resumen de prueba, reemplace la plantilla TCR alfa por la cadena alfa amplificada por PCR. HEK293T celdas se utilizan para probar el emparejamiento exitoso de la cadena TCR y la expresión de la superficie celular.

HEK293T células se transfectan conjuntamente con el vector TCR marcado por el reportero fluorescente de ametrina y un vector que codifica el complejo CD3 marcado por GFP. La expresión superficial del TCR quimérico se verifica mediante citometría de flujo mediante la tinción de las células con el anticuerpo CD3 anti-ratón. El nivel de expresión de CD3 en la superficie de las células transfectadas con la construcción TCR quimérica debe ser comparable a las transfectadas con el vector plantilla de control totalmente simétrico.

En resumen, hemos descrito un protocolo eficiente basado en PCR para la identificación y clonación de cadenas TCR emparejadas a partir de células individuales. Anticipamos que esta será una herramienta valiosa para estudiar las respuestas de las células T humanas en la autoinmunidad, la vigilancia tumoral y la eliminación de patógenos. La principal ventaja del protocolo de PCR aquí descrito es su compatibilidad con estudios posteriores in vitro e in vivo.