Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

El objetivo general de este experimento es visualizar la formación de vasos sanguíneos in vivo en andamios tridimensionales en tiempo real mediante microscopía multifotónica. Estos medidos son preguntas clave en el campo de la generación de hueso, como cómo neutralizar y engañar la formación de vasos sanguíneos in vivo en andamios tridimensionales en tiempo real. La única ventaja de esta técnica es que permite neutralizar simultáneamente CERES, métricas extracelulares y redes moleculares circundantes in vivo.

Para empezar, prepare una solución homogénea que contenga 20 gramos de PLGA y 20 mililitros de 1,4 dioxano. Luego, agregue dos gramos de nHAP en polvo a la solución. Usando un agitador magnético, mezcle la suspensión vigorosamente a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 16 horas para formar una pasta uniforme que se utilizará para imprimir andamios PLGA NHAP porosos.

Una vez impresos, liofiliza los andamios durante 48 horas para eliminar por completo cualquier disolvente. Y luego esterilizarlos en etanol al 75 por ciento durante una hora. Después, lifálicelos una vez más para obtener material neutro y antiséptico.

A continuación, agregue cuatro coma cinco por 10 a la quinta de partículas lentivirales a cada andamio y deje que las partículas se absorban en una incubadora humidificada manteniendo 37 grados centígrados durante dos horas. Ahora que la partícula lentiviral se absorbe en los andamios, lave los andamios dos veces con dos mililitros de PBS para eliminar cualquier residuo suelto. Congele los andamios lavados en nitrógeno líquido.

Y después de lifalyzing una vez más, guárdelos a menos 80 grados centígrados para estudios posteriores. Transfiera andamios 3D previamente recubiertos con cuatro coma cinco veces diez a la quinta partículas lentivirales portadoras de proteína fluorescente verde en viales criogénicos de dos coma cero mililitros llenos de un mililitro de DMEM completo e incube a 37 grados centígrados con agitación durante cinco días. Cada doce horas de incubación, recoja muestras de un mililitro de los medios que contienen partículas lentivirales liberadas de los andamios y reemplácelas con un mililitro de medios frescos.

Para transducir HEK293T células, primero retire el medio de HEK293T células cultivadas en una placa de 12 pocillos y lave las células dos veces con PBS. A continuación, añada un mililitro del medio previamente recogido a las células de HEK293T lavadas e incube la placa durante 48 horas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada. Después de 48 horas de incubación, se midió el número de células HEK293T positivas para GFB mediante citometría de flujo para determinar el número de partículas lentivirales bioactivas.

Para comenzar, divida aleatoriamente seis ratones negros C57 en tres grupos de tratamiento: control, PH y PHp de 14 animales cada uno. Afeita la piel de la cabeza de un ratón anestesiado y desinfecta la superficie con una tintura de yodo y luego una solución de alcohol al 75 por ciento. Coloque la cabeza del ratón en un instrumento estereotáxico y mida la piel con un bisturí y luego, con unas tijeras, haga un corte lineal de un centímetro.

Con un hisopo de algodón estéril, raspe el periostio del hueso craneal para revelar su superficie. Luego, en el lado izquierdo del cráneo, crea con una fresa de trépano un defecto de tamaño crítico de cuatro milímetros de diámetro. Trasplante el andamio en el lado del defecto óseo.

Use pinzas oftálmicas para cubrir suavemente el sitio quirúrgico con el periostio. Después, cierra la herida aplicando tres puntos de sutura por cada centímetro de incisión. Por último, administre el analgésico buprenorfina para controlar el dolor postoperatorio y mantenga al animal en una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal hasta que despierte.

Cuando el ratón recupere la conciencia, proporciónele comida y agua y controle su actividad diaria hasta el final del experimento. Después de ensamblar el sistema de microscopía multifotónica para imágenes TPEF y SHG, ajuste el láser de zafiro de titanio de femtosegundos a 860 nanómetros. Para visualizar los vasos sanguíneos recién formados, inyecte al ratón por vía intravenosa 200 microlitros de una solución salina de dextrano de 10 miligramos por mililitro, luego, utilizando el instrumento estereotáctico, inmovilice al animal anestesiado en una placa calefactora para mantener su temperatura corporal a 37 grados centígrados.

Inyectar al ratón 200 microlitros de solución salina por vía intraperitoneal para prevenir la deshidratación. Finalmente, proporcione al animal una mezcla del tres por ciento de isoflurano en oxígeno al 100 por ciento para mantener suficiente anestesia y analgesia durante la toma de imágenes. Para comenzar la obtención de imágenes, escanee un par de espejos galvo para crear un área de muestreo de 512 por 512 micrómetros.

Luego, usando una lente de objetivo de inmersión en agua NA de un punto O, enfoque el haz de excitación en la muestra y recoja la señal TPEF HSG dispersa hacia atrás. Ajuste el campo de visión de modo que cubra el área ósea normal y el borde del defecto en el grupo de control, pero solo el andamio implantado cuando se obtengan imágenes del animal del grupo PH o PHp. Luego, escanee cinco sitios diferentes del defecto.

Adquiera pilas de imágenes cada 12 segundos durante un período de imágenes de dos horas. Aquí se presenta una fotografía del andamio preparado con la técnica de impresión 3D, junto con una imagen de micro-CT que muestra la porosidad general del material preparado. La estructura microporosa del andamio se muestra en una imagen SEM adquirida con un aumento de 5000 veces.

Como se ha mostrado, las células HEK293T tratadas con medios que contenían partículas lentivirales liberadas de los andamios expresaron eficientemente la proteína fluorescente verde. Según lo estimado por citometría de flujo, el número total de partículas liberadas alcanzó aproximadamente el 40 por ciento. El efecto de liberación más robusto se observó dentro de las primeras 24 horas del estudio, y disminuyó gradualmente con el tiempo, lo que confirma que las partículas lentivirales recubiertas en los andamios mantienen su actividad biológica hasta por 96 horas.

El análisis in vivo de los vasos sanguíneos formados dentro de un defecto óseo de la pantorrilla mostró que los nuevos vasos sanguíneos, aunque indetectables en el grupo de control de ratones, eran claramente visibles en los grupos de PH y PHp ocho semanas después del trasplante de andamio. Además, mientras que en los grupos de PH y PHp se detectaron muchos sitios de deposición de colágeno, solo en el grupo de PHp se pudo observar un número creciente de vasos más pequeños que crecían en andamios y el área general de los vasos sanguíneos fue significativamente diferente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar inmovilizar la cabeza del mouse para mantenerla quieta durante el escaneo y evitar cualquier artefacto. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las imágenes fotoacústicas, para proporcionar datos adicionales, como imágenes de tejido profundo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración ósea investigaran la angiogénesis en los trasplantes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la formación de plasma in vivo en andamios 3D en tiempo real y microscopía de fotones.