Name: Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a visualizar la angiogénesis in vivo mediante microscopía multifotón en andamios 3D-PLGA/nHAp modificados genéticamente para reparar defectos óseos críticos en calota murina.

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Este estudio fue apoyado por el programa de pavo real de Shenzhen, China (Nº 110811003586331), el programa de investigación básica de Shenzhen (no. JCYJ20150401150223631, no. JCYJ20150401145529020 y no. JCYJ20160331190714896), el Guangdong pública de investigación y desarrollo de capacidades programa especial (Nº 2015A020212030), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 81501893), el programa nacional mayor Basic Research de China (2013CB945503) y la Programa de innovación de SIAT para excelentes investigadores jóvenes (Y5G010).

el cuidado de los animales fue en cumplimiento de la guía para el cuidado y uso de laboratorio animales de la provincia de Guangdong. Todos los procedimientos fueron realizados bajo la supervisión y aprobación del Comité de ética para la investigación Animal, institutos de avanzada tecnología de Shenzhen, de la Academia China de Ciencias.
 1. lentivirales (LV) producción <ol><li>clon de cDNA de pdgf-b en un vector de expresión lentivirales (pLenti6/5-eGFP o LV-eGFP) en un múltiple encargo-clonación sitio aguas abajo del promotor de citomegalovirus con Spe I y Sal I sitios de restricción para construir el plásmido pLenti6/5-PDGFB-eGFP (LV - pdgfb) 25.</li>
	<li>Producir partículas lentivirales (LV - pdgfb) de las células HEK - 293 pies por transferencia junto con los plásmidos de empaquetado de virus (pLP1 pLP2 y pVSV G) utilizando el método estándar de fosfato de calcio con cloroquina (concentración final: 25 μm) 25.</li> <li>después de 48 h de la transfección, la cosecha y filtro de virus que contiene 500 mL sobrenadante con un filtro (0.45 μm). Posteriormente, las partículas virales se concentran por ultracentrifugación a 89.000 x g durante 2 h. resuspender en 200 μL de tampón fosfato solución salina (PBS), alícuota y almacenar a -80 ° C.</li>
	<li>Para determinar la concentración de lentivirus, incubar las células HEK293T con lentivirales en serie diluido por 24 h y calcular el título lentivirales, como se describió anteriormente 25.</li>
</ol> 2. Fabricación de andamios PLGA/nHAp 3D impreso e inmovilización de LV <ol><li>disolver 20 g de PLGA (poli D, L-lactide-co-glicólido) material en 20 mL de 1, 4-dioxano para formar una solución homogénea. Añadir 2 g de combinar polvo de HAp (nano-hydroxyapatide) (nHAp) a la solución; el EGLP: nHAp ratio debe ser 10:1 (w/w).</li>
	<li>Agitar vigorosamente la solución mezclada (revolvimiento de velocidad: 1.500 rpm) a temperatura ambiente durante 16 h con un agitador magnético hasta para formar una pasta uniforme. Fabricar en andamios porosos de PLGA/nHAp utilizando una impresora 3D de baja temperatura con un inyector automatizado que deposita en el fondo de capa por capa, pegar a la tapa, según un modelo prediseñado 26; los tamaños de poro de las matrices de soporte van desde 200 a 400 μm.</li>
	<li>Vacío liofilización los andamios durante 48 h para quitar el solvente tan completamente como sea posible. Remoje las matrices de soporte en solución de etanol 75% durante 1 h para la esterilización y liofilizar para conseguir andamios neutros, asépticos. 
	Nota: Los parámetros principales para liofilización vacío incluyen la temperatura de condensación (° C) y el grado de vacío (Pa). Bajo un grado de vacío de 45 Pa, los andamios PLGA/nHAp eran vacío liofilizada a-78 ° C por 48 h eliminar completamente el disolvente.</li>
	<li>Añadir 10 μl de partículas LV (4.5 x 10 5) a cada PLGA/nHAp andamio (4 x 4 x 2 mm) e incubar los andamios por 2 h a 37 ° C en una incubadora humidificada para permitir la adsorción.</li>
	<li>Después de la inmovilización, enjuague los andamios dos veces con PBS para eliminar las partículas de LV. Snap freeze los andamios recubiertos en partículas de LV en nitrógeno líquido, liofilizar otra vez y almacenar a-80 ° C para su uso futuro.</li>
</ol> 3. In Vitro Cinética de liberación de partículas de LV de andamios y ensayo de actividad de transducción LV <ol><li>incubar andamios 3D (4 x 4 x 2 mm) con LV-proteína verde fluorescente (LV-eGFP, 4,5 x 10 5 LV partículas) en 1 mL de DMEM completo en criogénico 2,0 mL frascos a 37 º C con agitación durante 5 días.</li>
	<li>Se toma una muestra de 1 mL cada 12 h de 12 h a 120 h de incubación post y cambiar el medio. En cada momento, añadir 1 mL de medio fresco en lugar de 1 mL de medio de incubación.</li>
	<li>Usar los medios de comunicación recogidos para transducir las células HEK293T por Co incubar durante 48 h. medida el número de partículas bioactivas de LV por determinar el número de GFP-positivas HEK293T células por citometría de flujo 27.
	<ol><li>Antes de transducción de las células HEK293T, retire el medio de cultivo y enjuague las células HEK293T dos veces con PBS. Añadir los medios recogidos con lentivirus liberados de los andamios al pozo (1 mL/pocillo) y de la cultura con las células HEK293T durante 48 h a 37 ° C en una incubadora humidificada.</li>
	</ol></li></ol> 4. In Vitro Evaluación de la médula ósea MSC (CMMo) migración <ol><li>antes del ensayo de migración, preparar BMSCs expresando la proteína fluorescente de tomate (BMSCs-T) y de proteína (BMSCs-P) de PDGF-BB 28.</li>
	<li>Realizar el análisis de la migración de CMMo con un compartimiento de Boyden usando una placa de 24 pozos y filtros de policarbonato con un tamaño de poro de 8 μm.
	<ol><li>Lugar 0,5 mL de BMSCs (5 x 10 4) transfected con LV expresan la proteína fluorescente de tomate (BMSCs-T) en las cámaras superiores. Colocar 0,5 mL de BMSCs (2 x 10 5) transfected con LV expresando proteínas PDGF-BB (BMSCs-P) en las cámaras inferiores.</li>
	</ol></li> <li>Incluyen seis grupos en este experimento y agregar 500 μl del compartimiento inferior de cada pocillo. 
	A. control, medio libre de suero de blanco sólo control B. FBS, medio suplementado con 10% FBS control C. PDGF-BB, PDGF-BB de 4 ng/mL en medio libre de suero D. PDGF-BB agarrar grupo, PDGF-BB (4 ng/mL) y anticuerpos policlonales anti-PDGF-BB (4 ng/mL) en medio libre de suero Grupo CMMo E., 2 x 10 5 BMSCs en medio libre de suero Grupo F. BMSCs-P, 2 x 10 5 P BMSCs en medio libre de suero.</li>
	<li>Incubar durante 48 h en 5% CO 2 y a 37 ° C en una incubadora humidificada. Luego, eliminar las células migradas en el lado inferior de la cámara y recogerlos para la cuantificación del número de BMSCs-T por citometría de flujo.
	<ol><li>Quitar las células migradas en la cámara baja lado usando un raspador celular y resuspender las células migradas con 2 mL de PBS. Cuantificar el número de T-BMSCs migrado por citometría de flujo 29.</li>
	</ol></li></ol> 5. Establecimiento de un Calvarial crítico hueso defecto modelo murino y trasplante del andamio Nota: ratones machos BALB/c (7 semanas) fueron compradas de Guangdong médica centro de animales de laboratorio (Guangdong, China).
Experimentan de ratones machos <ol><li>inscribir un total de 42 para el defecto del hueso calvarial. Los ratones se dividen al azar en tres grupos, con catorce en cada grupo que recibir los siguientes tratamientos: Grupo A, no implantes; Grupo B, PH andamios implantaron (PLGA/nHAp); y grupo C, PHp andamios implantados (nHAp/PLGA/LV-pdgfb).</li>
	<li>Anestesiar los animales con la administración intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Quitar la piel con Pasta depilatoria y limpiar la piel de la cabeza con una solución de alcohol 75% antes de hacer la primera incisión. Fijar la cabeza de cada ratón con un instrumento estereotáctico para mantenerlo inmóvil durante la cirugía.</li>
	<li>Hacer una incisión inicial con bisturí y luego agrandarlo ingenioHS tijeras para crear una incisión en la piel lineal de 1 cm. Raspe el periostio del hueso del cráneo a la superficie del hueso del cráneo usando un hisopo de algodón estéril.</li>
	<li>Utilizar una fresa trépano para crear un defecto de tamaño crítico de 4 mm de diámetro en el lado izquierdo de la calvaria 30. Transplante el andamio en el sitio de defecto óseo. 
	Nota: Defectos de tamaño crítico (CSD) se definición originalmente como &#34; el tamaño más pequeño intraóseo de la herida en un hueso determinado y especies de animales que no se curan espontáneamente durante la vida del animal. &#34; en este experimento, el defecto de 4 mm de diámetro es un defecto de tamaño crítico hueso, según el estudio previamente 31 , 32.</li>
	<li>Utilizar fórceps oftálmicos para retroceder el periostio suavemente para cubrir el sitio quirúrgico. Suturar la piel Incisa con tres puntadas por cm.</li>
	<li>Realizar cuidado post-operatorio. Administrar la buprenorfina analgésica (0.1 mg/kg) para aliviar el dolor. Mantener la temperatura del cuerpo con una almohada hasta que el animal se despierta. Posteriormente, alimentar los animales con alimentos y agua y registrar su actividad todos los días hasta el final de la prueba. Nota: Se puede administrar Analgesia antes del procedimiento dependiendo de su cuidado de los animales local Comité directrices.</li></ol> 6. En Vivo Proyección de imagen de angiogénesis en el defecto óseo con MPM Nota: dextrano de las kD 250 (10 mg/mL) en solución salina, conjugado con FITC se inyectó por vía intravenosa en ratones para obtener alta SNR (signal to noise ratio) imágenes de vasos sanguíneos nuevos según un estudio anterior 33. Tenga en cuenta que se trata de un procedimiento de supervivencia. <ol><li>montar el sistema de microscopía multifotón (MPM) para imágenes de señal (SHG) de segunda generación armónica y dos fotones fluorescencia emocionada (TPEF).</li>
	<li>Anestesiar los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) e inmovilizar los animales en una placa calefactora para mantener su temperatura corporal a 37 ° C a lo largo de los experimentos. Use 3.0% isoflurano gas en 100% de oxígeno para mantener la analgesia y la anestesia satisfactoria durante el proceso de proyección de imagen. Inyectar por vía intraperitoneal una solución salina (200 μL/animal) para evitar la deshidratación antes de la proyección de imagen.</li>
	<li>Tune el láser de femtosegundo Ti zafiro a 860 nm. Crear un área de 512 x 512 μm muestreo mediante la exploración de un par de espejos galvo y usar objetivo de inmersión en agua NA1.0 al haz de excitación focusthe en la muestra y para recoger la señal de retrodispersión TPEF/SHG. 
	Nota: La imagen fue realizada en un sistema generador de imágenes microscópico multifotón de construir casa (MPM). Durante la proyección de imagen, un láser de femtosegundo Ti zafiro fue sintonizado a 860 nm como la longitud de onda de excitación óptima. El rayo láser fue trama escaneado a través de un plano de la muestra utilizando un par de espejos del galvanómetro. Después de pasar por un espejo dicroico de 685 nm, la viga se centró en la muestra por un objetivo de 20 X NA1.0. Las señales inducidas de TPEF y SHG fueron recogidas por el mismo objetivo. Las señales se separó de la excitación láser por el espejo dicroico mencionados anteriormente y purificada por un filtro de paso corto de 680 nm. Las señales de TPEF y SHG fueron recogidas por un paquete de la fibra y llevó a cabo un espectrógrafo. El detector en el espectrógrafo fue un arsenal linear de los tubos de fotomultiplicador (PMTs). La combinación del espectrógrafo y PMTs arsenal linear ofrece la capacidad de grabar la señal en bandas espectrales consecutivas 16, de 400 nm a 600 nm, 12,5 nm a intervalos. Por lo tanto, las señales de TPEF y SHG se detecta al mismo tiempo y separadas en dominios espectrales. Además, para imágenes en 3D, un motor axial fue utilizado para controlar la profundidad de la proyección de imagen. El área de cada imagen se estableció en 512 x 512 μm y 2 μm (grupo control, 5 μm) ajustó el intervalo de profundidad. En particular, 5 sitios de cada defecto se reflejada para recoger datos estadísticamente significativos, y los sitios de proyección de imagen seleccionados se distribuyeron aleatoriamente y uniformemente a lo largo del defecto.</li>
	<li>5 analizar sitios en cada defecto para recoger datos estadísticamente significativos para medir la formación de vasos.
	<ol><li>Uso exploración sitios aleatoriamente y uniformemente distribuidos a lo largo del defecto. Para el grupo control, tienen el campo de la cubierta (FOV) del área original del hueso y el borde del defecto, pero para los grupos PH y PHp, con el FOV en el andamio implantado.</li>
		<li>Hacer una incisión de 1 cm lineal de la piel con un bisturí y suturar la piel abierta a la fijación para revelar el sitio de trasplante. Utilice una jeringa para colocar una gota de agua entre el lente de inmersión y trasplantes para formar un vaso de agua.</li>
	</ol></li> <li>Adquirir imagen pilas cada 12 s en un 2 h, periodo de la proyección de imagen. Mostrar y analizar datos volumétricos mediante un programa personalizado de MATLAB y cuantificar las áreas de vasos sanguíneos con ImageJ software 34 , 35.</li>
</ol> 7. Análisis de expresión génica de Genes relacionados con la angiogénesis por RT-qPCR y pdgf-b Nota: PCR se realizó siguiendo los pasos habituales: 95 ° C por 30 s, 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s. Post-PCR fusión curvas confirmaron la especificidad de la amplificación de solo objetivo, y se determinó el cambio de doblez del gen de interés con respecto a β-actina. La reacción para cada muestra fue probada tres veces.
<ol><li>Cosecha implantados los andamios y los tejidos de los ratones experimentales en 2, 4 y 8 semanas después de la operación 36; las muestras del grupo de control (n = 4), tomadas en los mismos puntos de tiempo, debe ser de tejido óseo adyacente. 
	Nota: En cada momento (2, 4 y 8 semanas), sacrificados a los ratones con la inhalación de CO 2. Diseccionar el calvaria y, posteriormente, retire y cosechar los andamios implantados del calvaria.</li>
	<li>Utilizar un reactivo comercial para extraer el ARN total de cada muestra según el fabricante &#39; protocolo de s. Utilizar el Kit de transcripción inversa para invertir-transcribir el ARN en ADNc tras el fabricante &#39; Protocolo s.</li>
	<li>Realizar PCR en tiempo real cuantitativa utilizando el sistema de detección de SYBR Green; los iniciadores se enumeran en la tabla 1.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td colspan="8"> Primer(5&#39;&#8211;3&#39;)</td></tr> <tr><td colspan="2" rowspan="1"> Gene</td>
			<td colspan="2" rowspan="1"> hacia adelante</td>
			<td colspan="4" rowspan="1"> revés</td></tr>
		<tr><td>pdgfb</td> <td colspan="3"> CATCCGCTCCTTTGATGATCTT</td> <td colspan="4"> GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT</td></tr>
		<tr><td>vWF</td> <td colspan="3"> CTCTTTGGGGACGACTTCATC</td> <td colspan="4"> TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC</td></tr>
		<tr><td>VEGFR2</td> <td colspan="3"> GAAATGACACTGGAGCCTACA AG</td> <td colspan="4"> TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G</td></tr>
		<tr><td>β-actina</td> <td colspan="3"> GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG</td> <td colspan="4"> CAAT GCAGTACATAATTTACACAGAAG</td></tr></tbody>
</table> tabla 1: conjuntos de Pimer.
 8. MicroCT análisis de la regeneración del hueso <ol><li>Euthanize ratones con inhalación de CO 2 en operación después de 8 semanas. En un ambiente bien ventilado, con cuidado coloque cada ratón en una jaula del ratón limpio y bomba de gas de CO 2 en la jaula para anestesiar los ratones antes de la eutanasia.</li>
	<li>Diseque el cráneo para microCT proyección de imagen de la región del defecto óseo. Usuario los siguientes parámetros en los experimentos de exploración: 9 μm de resolución, Al filtro de 0.5 mm, 50 kV voltaje y actual 142 μA.</li>
	Recon <li>estructura todos los datos de proyección de imagen usando software comercial proporcionan por la empresa. Calibrar las exploraciones utilizando la función de calibración de un software de CTAn. 
	Nota: Coloque una unidad de Hounsfield (HU) en los ratones en cada escaneo.</li>
</ol>

<ol><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPNMB+enhances+bone+regeneration+by+promoting+angiogenesis+and+osteogenesis%3A+potential+role+for+tissue+engineering+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone.</a> J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

El hueso es un tejido altamente vascularizado con una capacidad única para curar continuamente y remodelación a lo largo de la vida de un individuo1. El nivel de vascularización es importante para la reparación de osteogénesis y defecto. Baja vascularización limita la aplicación clínica amplio de ingeniería de tejido óseo. Construyendo un hueso altamente vascularizado tejido diseñado según la teoría de la biomimética, se ha convertido en una herramienta para la reparación de defectos óseos de gran...

El hueso es un tejido altamente vascularizado que continúa para remodelar durante la vida de un individuo1. La regeneración ósea rápida y eficaz de los defectos de hueso grande como resultado de trauma, no sindical, resecciones tumorales o malformaciones craneofaciales es un proceso fisiológico complejo. Enfoques terapéuticos tradicionales utilizados para la reparación del defecto óseo incluyen implantación de autoinjerto y aloinjerto, pero su uso implica varios problemas y limitaciones, tales como la disponibilidad limitada, morbosidad del sitio donante importante, un alto riesgo de infección, y la sede de rechazo inmune2,3. Sin embargo, injertos óseos artificiales ofrecen una alternativa eficiente para paliar estas limitaciones. Pueden ser hechos de materiales biodegradables, son fáciles de fabricar con un tamaño de poro adecuado y pueden ser modificados genéticamente4,5.
En la actualidad, se han empleado varios andamios de ingeniería de tejidos en el desarrollo de la ingeniería de tejido óseo6,7. Para inducir la regeneración y reparación óseas más eficazmente, Biomateriales Ingeniería combinadas con factores de crecimiento han surgido y logra buenos resultados8,9. Por desgracia, la vida media corta, fácil perder actividad y dosis supraphysiological de factores de crecimiento para la eficacia terapéutica limitan su uso clínico10. Para superar estos problemas, la entrega de genes del factor de crecimiento en lugar de factores de crecimiento se ha demostrado como un enfoque eficaz para mantener la actividad biológica para el tratamiento de defectos oseos y enfermedades11,12. Vectores virales son prometedor entrega herramientas para la regeneración de los tejidos debido a su alta expresando eficiencia13.
Entre los factores de crecimiento, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) fue seleccionado en este estudio porque es un mitógeno y chemoattractant para las células mesenquimales y osteogénicos, sino un estimulante de la angiogénesis14,15 . Anteriores estudios clínicos y preclínicos demostraron que PDGF-BB podría con seguridad y efectivamente promover la reparación ósea en defectos oseos periodontales16,17. Estudios recientes revelaron que el PDGF-BB estimula angiogénesis por motivar la célula endotelial proliferación y la migración en vivo18,19. Además, PDGF-BB puede también hacer que las células madre mesenquimales (MSCs) capaces de diferenciarse en células endoteliales20y este destaca más el papel potencial de MSCs en neovascularización. Por lo tanto, inducir la formación de novo de vasculatura en andamios con PDGF-BB es un paso importante para la reparación de tejido crecido en andamios en ingeniería del tejido fino del hueso.
Defecto de hueso curativo es un proceso morfogenético de tejido dinámico que requiere osteogénesis coordinada y angiogénesis en la reparación de posiciones21. Neoangiogénesis en andamios de ingeniería de tejido implantados es un requisito previo esencial para el suministro de células con nutrientes y oxígeno para el crecimiento y la supervivencia y para la eliminación de desechos metabólicos. Utilizan métodos de la proyección de imagen, incluyendo rayos x micro-computarizada tomografía (microCT), la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), microscopía electrónica (SEM), tomografía de coherencia óptica (OCT) y el láser confocal de la microscopia, la exploración se aplican en lugar de examinación histológica para obtener angiogénesis información22,23. Sin embargo, estos métodos enfrentan a diversos obstáculos en la visualización y medición occidentalización en andamios 3D en ingeniería del tejido fino del hueso. Microscopía multifotón (MPM) es una técnica de bio-proyección de imagen relativamente nueva que tiene la clara ventaja de simultáneamente visualizar células, matriz extracelular y redes vasculares en vivo. Posee una capacidad inherente de proyección de imagen tridimensional para la penetración de tejido profundo y provoca fotodaño baja. Por lo tanto, en la última década, el MPM ha ganado mucha atención en estudios biomédicos24, incluyendo en neurociencias, la inmunología y la dinámica de la célula de vástago. Sin embargo, apenas se utiliza en la investigación ortopédica.

<table><tbody><tr><td>Poli(D,L-lactida-co-glicólido) (PLGA)</td><td>Sigma</td><td>P1941</td><td>Relación L/G 75:25, MW 66000-107000</td></tr><tr><td>Nanopartículas de hidroxiapatita</td><td>Sigma</td><td>702153</td><td>Diámetro medio < 200 nm</td></tr><tr><td>Sal de difosfato de cloroquina</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado con FITC 250-kD dextrano</td><td>Sigma</td><td>FD250S</td><td></td></tr><tr><td>1,4-dioxano</td><td>lingfeng, Shanghái</td><td></td><td>0,45 micras</td></tr><tr><td>Filtros Stericup</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB Cdna</td><td>Sino Biological, Inc</td><td>MZ50801-G</td> Anti-PDGF-BB <td></td></tr><tr><td>anticuerpo policlonal de ratón</td><td>&nbsp; BioVision, Inc</td><td>5489-30T</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB proteína</td><td></td> recombinante <td>4489-50</td><td></td></tr><tr><td>Solución de transfección de fosfato de calcio</td><td>Promega Corporation</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>L-DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina, líquida</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Transwell&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>Ratones machos BALB/c Centro</td> de <td>Animales de Laboratorio Médico de Guangdong &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital sódico&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1063180500</td><td></td></tr><tr><td>microscopía</td><td></td><td></td> multifotónica <td>Un hecho en casa en los Institutos de Tecnología Avanzada de Shenzhen para detectar fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) y señal de generación de segundos armónicos (SHG).</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Keyuan, Shandong</td><td>401750169</td><td></td></tr><tr><td>reactivo TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td><td>Takara</td><td>RR420B</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina y eosina</td><td>Beyotime</td><td>C0105</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Leica& nbsp;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga OPtima L-100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Impresora de baja temperatura&nbsp;</td>Universidad <td></td><td>de Tsinghua</td><td>Un instrumento hecho en casa en la universidad de Tsinghua</td></tr><tr><td>LightCycler 480 &nbsp;</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td></td></tr><tr><td>microCT</td><td>Bruker</td><td>1176</td><td></td></tr><tr><td>software comercial</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de angiogénesis por microscopía multifotón en vivo en modificados genéticamente 3d-plga/nhap andamio para calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

La reconstrucción de defectos óseos de tamaño crítico sigue siendo un grave problema clínico debido a la pobre angiogénesis dentro tejido-dirigida andamios durante la reparación, que da lugar a una falta de suficiente riego sanguíneo y provoca la necrosis de los tejidos nuevos. Rápida vascularización es un requisito vital para la supervivencia de tejidos nuevos e integración con el existente tejido anfitrión. La generación de novo de vasculatura en andamios es uno de los pasos más importantes en la fabricación más eficiente, lo que permite reparar el tejido que crece en un andamio de la regeneración ósea. Para abordar este problema, la modificación genética de un andamio de biomaterial se utiliza para acelerar la angiogénesis y osteogénesis. Sin embargo, visualización y seguimiento en vivo formación de vasos sanguíneos en tiempo real y en tres dimensiones (3D) andamios o nuevo tejido óseo sigue siendo un obstáculo para la ingeniería de tejido óseo. Microscopía multifotón (MPM) es una modalidad de proyección de imagen de bio novela que puede adquirir datos volumétricos de estructuras biológicas de forma mínimamente invasiva y alta resolución. El objetivo de este estudio fue visualizar la angiogénesis con microscopía multifotón en vivo en un andamio de 3D-PLGA/nHAp genéticamente modificado para la reparación del defecto hueso calvarial crítica. Andamios PLGA/nHAp fueron funcionalizados para la entrega sostenida de un gen de factor de crecimiento pdgf-b con vectores lentivirales (LV -pdgfb) para facilitar la angiogénesis y a mejorar la regeneración ósea. En un hueso calvarial de crítico implantado andamio defecto modelo de ratón, las áreas de vasos sanguíneos (BVAs) en PHp andamios fueron significativamente mayores que en PH andamios. Además, la expresión de pdgf-b y genes relacionados con la angiogénesis, vWF y VEGFR2, aumentado correspondientemente. MicroCT análisis indicó que la nueva formación de hueso en el grupo de PHp mejorada dramáticamente en comparación con los otros grupos. A nuestro conocimiento, esta es la primera vez microscopía multifotón fue utilizado en ingeniería del tejido fino del hueso para investigar la angiogénesis en un andamio biodegradable 3D en vivo y en tiempo real.

PLGA poroso cilíndrico/nHAp andamios 0,6 mm de altura y 4 mm de diámetro fueron fabricados con una impresora 3D. Las morfologías de los andamios se analizaron mediante análisis de microscopia electrónica y microCT. Figura 1A se muestra la fotografía del andamio implantado. MicroCT exploración reveló que más del 85% de los poros tenía tamaños que van desde 200 a 400 μm (figura 1B). Proyección de imagen de SEM demostró que la superficie del andamio una micr...

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

El objetivo general de este experimento es visualizar en tiempo real la formación de vasos sanguíneos in vivo en andamios tridimensionales mediante microscopía de múltiples fotones. Estas mediciones abordan una pregunta clave en el campo de la generación ósea, como es la forma de neutralizar y rastrear en tiempo real la formación de vasos sanguíneos in vivo en andamios tridimensionales. Una ventaja de esta técnica es que permite neutralizar simultáneamente las células CERES, las matrices extracelulares y las redes moleculares circundantes in vivo.Para comenzar, prepare una solución homogénea que contenga 20 gramos de PLGA y 20 mililitros de 1,4 dioxano. Luego, agregue dos gramos de nHAP en polvo a la solución. Utilizando un agitador magnético, mezcle vigorosamente la suspensión a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 16 horas para formar una pasta uniforme que se utilizará para imprimir andamios porosos de PLGA/nHAP.Una vez impresas, liofilice los andamios durante 48 horas para eliminar completamente cualquier disolvente. Luego, esterilícelos en etanol al 75 por ciento durante una hora. Posteriormente, liofilice nuevamente para obtener un material neutro y antiséptico.A continuación, agregue cuatro coma cinco veces 10 a la quinta de partículas lentivirales a cada andamio y permita que las partículas se absorban en un incubador humedecido que mantenga 37 grados celsius durante dos horas. Ahora que las partículas lentivirales se han absorbido en los andamios, lave los andamios dos veces con dos mililitros de PBS para eliminar cualquier residuo no unido. Congele rápidamente los andamios lavados en nitrógeno líquido.Y tras liofilizar nuevamente, almacénelos a menos 80 grados Celsius para estudios posteriores. Transfiera andamios 3D previamente recubiertos con cuatro coma cinco por diez a la quinta partículas lentivirales que portan la proteína verde fluorescente a viales criogénicos de dos coma cero mililitros llenos con un mililitro de DMEM completo e incúbelos a 37 grados Celsius con agitación durante cinco días. Cada doce horas de incubación, recoja muestras de un mililitro del medio que contiene partículas lentivirales liberadas de los andamios y sustitúyalas por un mililitro de medio fresco.Para transducir células HEK293T, primero retire el medio de las células HEK293T cultivadas en una placa de 12 pocillos y lave las células dos veces con PBS. A continuación, añada un mililitro del medio previamente recolectado a las células HEK293T lavadas e incube la placa durante 48 horas a 37 grados celsius en un incubador humedecido. Tras 48 horas de incubación, mida el número de células HEK293T positivas para GFB mediante citometría de flujo para determinar la cantidad de partículas lentivirales bioactivas.Para comenzar, divida aleatoriamente ratones C57 black six en tres grupos de tratamiento: control, PH y PHp, con 14 animales cada uno. Afeite la piel en la cabeza de un ratón anestesiado y desinfecte la superficie con tintura de yodo y luego con una solución de alcohol al 75 por ciento. Coloque la cabeza del ratón en un instrumento estereotáxico y haga una incisión en la piel con un escalpelo, luego use tijeras para realizar un corte lineal de un centímetro.Con un hisopo estéril, raspe el periostio del hueso craneal para exponer su superficie. Luego, en el lado izquierdo del cráneo, cree con una fresa de trepanación un defecto de tamaño crítico de cuatro milímetros de diámetro. Transplante el andamio en el sitio del defecto óseo.Utilice fórceps oftálmicos para cubrir suavemente el sitio quirúrgico con el periostio. Posteriormente, cierre la herida aplicando tres puntos por cada centímetro de incisión. Finalmente, administre el analgésico buprenorfina para controlar el dolor postoperatorio y mantenga al animal sobre una almohadilla calefactora para conservar su temperatura corporal hasta que despierte.Cuando el ratón recupere la conciencia, proporciónele alimento y agua y supervise su actividad diaria hasta el final del experimento. Después de armar el sistema de microscopía de múltiples fotones para imágenes de TPEF y SHG, ajuste el láser de titanio-safiro de femtosegundos a 860 nanómetros. Para visualizar los vasos sanguíneos recién formados, inyecte al ratón por vía intravenosa 200 microlitros de una solución de dextrano al 10 miligramos por mililitro en solución salina, luego, utilizando el instrumento estereotáctico, inmovilice al animal anestesiado sobre una placa calefactora para mantener su temperatura corporal a 37 grados celsius.Inyecte al ratón 200 microlitros de solución salina por vía intraperitoneal para prevenir la deshidratación. Finalmente, administre al animal una mezcla al tres por ciento de isoflurano en oxígeno al cien por ciento para mantener una anestesia y analgesia adecuadas durante la adquisición de imágenes. Para comenzar la adquisición, escanee un par de espejos galvanométricos para crear un área de muestreo de 512 por 512 micrómetros.Luego, utilizando un objetivo de inmersión en agua NA 1,0, enfoque el haz de excitación sobre la muestra y recopile la señal de dispersión inversa de HSG por fluorescencia de dos fotones (TPEF). Ajuste el campo de visión para que cubra el área ósea normal y el borde del defecto en el grupo control, pero únicamente el andamio implantado al obtener imágenes del animal del grupo PH o PHp. A continuación, escanee cinco sitios diferentes del defecto.Adquiera pilas de imágenes cada 12 segundos durante un período de adquisición de imágenes de dos horas. Aquí se presenta una fotografía del andamio preparado mediante la técnica de impresión 3D, junto con una imagen de micro-TC que muestra la porosidad general del material preparado. La estructura microporosa del andamio se muestra en una imagen de MEB obtenida con un aumento de 5000 veces.Como se muestra, las células HEK293T tratadas con medio que contenía partículas lentivirales liberadas de los andamios expresaron eficazmente la proteína verde fluorescente. Según se estimó mediante citometría de flujo, el número total de partículas liberadas alcanzó aproximadamente el 40 por ciento. El efecto de liberación más robusto se observó durante las primeras 24 horas del estudio y disminuyó gradualmente con el tiempo, lo que confirma que las partículas lentivirales recubiertas sobre los andamios mantienen su actividad biológica durante hasta 96 horas.El análisis in vivo de los vasos sanguíneos formados dentro de un defecto óseo craneal mostró que los nuevos vasos sanguíneos, aunque indetectables en el grupo control de ratones, eran claramente visibles en ambos grupos PH y PHp ocho semanas después del trasplante del andamiaje. Además, aunque en ambos grupos PH y PHp se detectaron muchos sitios de depósito de colágeno, solo en el grupo PHp se observó un número creciente de vasos más pequeños que crecían hacia el andamiaje, y el área total de los vasos sanguíneos fue significativamente diferente. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar inmovilizar la cabeza del ratón para mantenerla quieta durante la exploración y así evitar cualquier artefacto. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la imagen fotoacústica para obtener datos adicionales, tales como imágenes de tejidos profundos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración ósea estudiaran la angiogénesis en trasplantes.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar en tiempo real la formación de plasma in vivo en andamios tridimensionales y mediante microscopía de microfotones.

visualizing-angiogenesis-multiphoton-microscopy-vivo-genetically

Research

Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Este protocolo describe el aislamiento de tejido adiposo derivado de células estromales de lipoaspirado y la creación de un 4 mm de tamaño crítico defecto craneal para evaluar la regeneración esquelética.

La reparación de un modelo de defecto crítico del tamaño de calota Uso adiposo derivados de las células del estroma cosechadas desde lipoaspirado

Una novela de alta resolución<em&gt; En vivo</em&gt; Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

La vascularización es clave para enfoques en la ingeniería de tejidos éxito. Por lo tanto, se requieren tecnologías fiables para evaluar el desarrollo de las redes vasculares en los tejidos-construcciones. Aquí presentamos un método simple y rentable para visualizar y cuantificar la vascularización in vivo.

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La implantación de injertos óseos autólogos y alogénicos constituyen aceptó enfoques para tratar la importante pérdida de masa ósea craneofacial. Sin embargo, el efecto de la composición de injerto en la interacción entre la neovascularización, la diferenciación celular y la formación de hueso no está claro. Se presenta un protocolo de imagen multimodal destinado a dilucidar la interdependencia angiogénesis osteogénesis en la proximidad del injerto.

Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

Se presenta un método para crear y vivir-imagen diferentes nichos humanizados de médula ósea en ratones. Basándose en el nicho de soporte creado por las células mesenquimales humanas, la adición de células endoteliales humanas induce la formación de vasos humanos, mientras que la adición de rhBMP-2 induce la formación de tejido óseo maduro quimérico humano-ratón.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.

In vitro Ensayo de germinación tridimensional de angiogénesis utilizando células madre embrionarias de ratón para el modelado de enfermedades vasculares y pruebas de fármacos

Los colgajos diseñados requieren una red vascular funcional incorporada. En este protocolo, presentamos un método de fabricación de un colgajo de tejido impreso en 3D que contiene una red vascular jerárquica y sus anastomosis microquirúrgicas directas a la arteria femoral de rata.

Fabricación de colgajos vasculares de ingeniería utilizando tecnologías de impresión 3D

Se establece un modelo in vitro del nicho vascular de la médula ósea mediante la siembra de células mesenquimales y endoteliales en hidrogeles PEG 3D prefabricados. Las redes endoteliales, los componentes de ECM y la actividad ALP de los nichos varían según el factor de crecimiento utilizado. La plataforma se puede utilizar para modelos avanzados de cáncer.

Establecimiento simple de un nicho de médula ósea osteogénica vascularizada utilizando hidrogeles de poli(etilenglicol) (PEG) prefabricados en una microplaca de imágenes

Este estudio presenta el ensayo bidimensional (2D) de migración de heridas por arañazo y el ensayo tridimensional (3D) de brotes esferoides, junto con sus respectivos métodos de análisis posteriores, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica, como ensayos adecuados para estudiar la angiogénesis in vitro.

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

La microscopía intravital permite el estudio de procesos biológicos dinámicos como la regeneración de tejidos y el desarrollo de tumores. La médula ósea del calvario, un tejido altamente dinámico, ofrece información sobre la hematopoyesis y la función vascular. El uso de un implante de fijación de cabeza biocompatible impreso en 3D permite obtener imágenes longitudinales repetitivas, lo que mejora nuestra comprensión de la dinámica de los tejidos y el microambiente tumoral.

Imagen longitudinal intravital de la dinámica vascular en la médula ósea del calvario

La angiogénesis germinal, fundamental para el desarrollo y la enfermedad, implica procesos moleculares y mecánicos complejos. Presentamos un modelo ex vivo 2.5D versátil que analiza la germinación celular de las arterias carótidas porcinas, revelando la angiogénesis dependiente de la rigidez y la mecánica distintiva de las células líder-seguidoras. Este modelo ayuda a avanzar en las estrategias de ingeniería de tejidos y los enfoques de terapia contra el cáncer.

Modelo 2.5D para la caracterización mecánica ex vivo de la angiogénesis germinal en tejido vivo

Aprende a visualizar la angiogénesis in vivo mediante microscopía multifotón en andamios 3D-PLGA/nHAp modificados genéticamente para reparar defectos óseos críticos en calota murina.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo (Video) | JoVE Journal

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

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