Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

El objetivo general de este experimento es visualizar en tiempo real la formación de vasos sanguíneos in vivo en andamios tridimensionales mediante microscopía de múltiples fotones. Estas mediciones abordan una pregunta clave en el campo de la generación ósea, como es la forma de neutralizar y rastrear en tiempo real la formación de vasos sanguíneos in vivo en andamios tridimensionales. Una ventaja de esta técnica es que permite neutralizar simultáneamente las células CERES, las matrices extracelulares y las redes moleculares circundantes in vivo.

Para comenzar, prepare una solución homogénea que contenga 20 gramos de PLGA y 20 mililitros de 1,4 dioxano. Luego, agregue dos gramos de nHAP en polvo a la solución. Utilizando un agitador magnético, mezcle vigorosamente la suspensión a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 16 horas para formar una pasta uniforme que se utilizará para imprimir andamios porosos de PLGA/nHAP.

Una vez impresas, liofilice los andamios durante 48 horas para eliminar completamente cualquier disolvente. Luego, esterilícelos en etanol al 75 por ciento durante una hora. Posteriormente, liofilice nuevamente para obtener un material neutro y antiséptico.

A continuación, agregue cuatro coma cinco veces 10 a la quinta de partículas lentivirales a cada andamio y permita que las partículas se absorban en un incubador humedecido que mantenga 37 grados celsius durante dos horas. Ahora que las partículas lentivirales se han absorbido en los andamios, lave los andamios dos veces con dos mililitros de PBS para eliminar cualquier residuo no unido. Congele rápidamente los andamios lavados en nitrógeno líquido.

Y tras liofilizar nuevamente, almacénelos a menos 80 grados Celsius para estudios posteriores. Transfiera andamios 3D previamente recubiertos con cuatro coma cinco por diez a la quinta partículas lentivirales que portan la proteína verde fluorescente a viales criogénicos de dos coma cero mililitros llenos con un mililitro de DMEM completo e incúbelos a 37 grados Celsius con agitación durante cinco días. Cada doce horas de incubación, recoja muestras de un mililitro del medio que contiene partículas lentivirales liberadas de los andamios y sustitúyalas por un mililitro de medio fresco.

Para transducir células HEK293T, primero retire el medio de las células HEK293T cultivadas en una placa de 12 pocillos y lave las células dos veces con PBS. A continuación, añada un mililitro del medio previamente recolectado a las células HEK293T lavadas e incube la placa durante 48 horas a 37 grados celsius en un incubador humedecido. Tras 48 horas de incubación, mida el número de células HEK293T positivas para GFB mediante citometría de flujo para determinar la cantidad de partículas lentivirales bioactivas.

Para comenzar, divida aleatoriamente ratones C57 black six en tres grupos de tratamiento: control, PH y PHp, con 14 animales cada uno. Afeite la piel en la cabeza de un ratón anestesiado y desinfecte la superficie con tintura de yodo y luego con una solución de alcohol al 75 por ciento. Coloque la cabeza del ratón en un instrumento estereotáxico y haga una incisión en la piel con un escalpelo, luego use tijeras para realizar un corte lineal de un centímetro.

Con un hisopo estéril, raspe el periostio del hueso craneal para exponer su superficie. Luego, en el lado izquierdo del cráneo, cree con una fresa de trepanación un defecto de tamaño crítico de cuatro milímetros de diámetro. Transplante el andamio en el sitio del defecto óseo.

Utilice fórceps oftálmicos para cubrir suavemente el sitio quirúrgico con el periostio. Posteriormente, cierre la herida aplicando tres puntos por cada centímetro de incisión. Finalmente, administre el analgésico buprenorfina para controlar el dolor postoperatorio y mantenga al animal sobre una almohadilla calefactora para conservar su temperatura corporal hasta que despierte.

Cuando el ratón recupere la conciencia, proporciónele alimento y agua y supervise su actividad diaria hasta el final del experimento. Después de armar el sistema de microscopía de múltiples fotones para imágenes de TPEF y SHG, ajuste el láser de titanio-safiro de femtosegundos a 860 nanómetros. Para visualizar los vasos sanguíneos recién formados, inyecte al ratón por vía intravenosa 200 microlitros de una solución de dextrano al 10 miligramos por mililitro en solución salina, luego, utilizando el instrumento estereotáctico, inmovilice al animal anestesiado sobre una placa calefactora para mantener su temperatura corporal a 37 grados celsius.

Inyecte al ratón 200 microlitros de solución salina por vía intraperitoneal para prevenir la deshidratación. Finalmente, administre al animal una mezcla al tres por ciento de isoflurano en oxígeno al cien por ciento para mantener una anestesia y analgesia adecuadas durante la adquisición de imágenes. Para comenzar la adquisición, escanee un par de espejos galvanométricos para crear un área de muestreo de 512 por 512 micrómetros.

Luego, utilizando un objetivo de inmersión en agua NA 1,0, enfoque el haz de excitación sobre la muestra y recopile la señal de dispersión inversa de HSG por fluorescencia de dos fotones (TPEF). Ajuste el campo de visión para que cubra el área ósea normal y el borde del defecto en el grupo control, pero únicamente el andamio implantado al obtener imágenes del animal del grupo PH o PHp. A continuación, escanee cinco sitios diferentes del defecto.

Adquiera pilas de imágenes cada 12 segundos durante un período de adquisición de imágenes de dos horas. Aquí se presenta una fotografía del andamio preparado mediante la técnica de impresión 3D, junto con una imagen de micro-TC que muestra la porosidad general del material preparado. La estructura microporosa del andamio se muestra en una imagen de MEB obtenida con un aumento de 5000 veces.

Como se muestra, las células HEK293T tratadas con medio que contenía partículas lentivirales liberadas de los andamios expresaron eficazmente la proteína verde fluorescente. Según se estimó mediante citometría de flujo, el número total de partículas liberadas alcanzó aproximadamente el 40 por ciento. El efecto de liberación más robusto se observó durante las primeras 24 horas del estudio y disminuyó gradualmente con el tiempo, lo que confirma que las partículas lentivirales recubiertas sobre los andamios mantienen su actividad biológica durante hasta 96 horas.

El análisis in vivo de los vasos sanguíneos formados dentro de un defecto óseo craneal mostró que los nuevos vasos sanguíneos, aunque indetectables en el grupo control de ratones, eran claramente visibles en ambos grupos PH y PHp ocho semanas después del trasplante del andamiaje. Además, aunque en ambos grupos PH y PHp se detectaron muchos sitios de depósito de colágeno, solo en el grupo PHp se observó un número creciente de vasos más pequeños que crecían hacia el andamiaje, y el área total de los vasos sanguíneos fue significativamente diferente. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar inmovilizar la cabeza del ratón para mantenerla quieta durante la exploración y así evitar cualquier artefacto. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la imagen fotoacústica para obtener datos adicionales, tales como imágenes de tejidos profundos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración ósea estudiaran la angiogénesis en trasplantes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar en tiempo real la formación de plasma in vivo en andamios tridimensionales y mediante microscopía de microfotones.