Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función

El objetivo general de este procedimiento simple pero efectivo es aislar y enriquecer las células B raras de unión a antígenos de sangre periférica humana utilizando nanopartículas magnéticas para su análisis fenotípico y funcional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología con respecto al fenotipo y la biología de las células B de unión a antígenos raros, tanto antes como después del encuentro con antígenos in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que evita los problemas asociados con la geometría, particularmente cuando se usa una placa de estireno o una cuenta grande.

Y evita los problemas asociados con la velocidad de flujo cuando se aíslan células mediante citometría de flujo para aislar células raras en poblaciones de células iniciales bastante grandes. Inmediatamente después de recolectar de 30 a 50 mililitros de sangre entera en tubos de recolección de sangre heparinizada, mezcle la sangre en una proporción de 1:1 con magnesio estéril a temperatura ambiente y PBS sin calcio. A continuación, coloque la mezcla de sangre en 10 mililitros de solución de gradiente de densidad a temperatura ambiente en un tubo cónico estéril de 50 mililitros utilizando una presión de disparo de pipeta lenta y constante.

Separar las células por centrifugación. Deseche la capa superior que contiene plasma y plaquetas y utilice una pipeta estéril para transferir la capa buffy del contenedor de células mononucleares a un nuevo tubo estéril de 50 mililitros. Llene el tubo con hasta 50 mililitros de PBS para el lavado de las células mononucleares por centrifugación.

Luego, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de PBS fresco para contar y vuelva a suspender las células a una concentración de 1x10^7 células por mililitro en PBS fresco en hielo. Para teñir las células para la unión magnética de perlas, primero transfiera alícuotas de celdas de 1-2x10^6 a tubos de poliestireno de cinco mililitros para cada compensación de fluorescencia y control de fluorescencia menos uno, según corresponda. A continuación, recoja el resto de la muestra de células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet a una concentración de 3-6x10^7 células por mililitro en un tampón FACS frío filtrado estéril.

Divida la solución celular en partes iguales en cuatro tubos FACS en hielo y agregue un reagant de bloqueo del receptor Fcgamma humano a estas cuatro fracciones de muestra experimentales. Al final de la incubación de bloqueo de unión inespecífica, agregue los anticuerpos de tinción de superficie celular conjugados con fluorescencia apropiados a las células de las cuatro fracciones de muestra. A continuación, se añade el antígeno biotinilado adecuado a las fracciones A y D, seguido de la adición de un volumen suficiente de antígeno no marcado a la fracción B, de modo que la mayoría de los receptores con una afinidad de al menos 1x10^6 molares queden bloqueados.

Incubar todas las muestras durante 30 minutos en hielo, seguido de una incubación de 30 minutos de la fracción B con el antígeno biotinilado adecuado. Al final de las incubaciones, lavar las células dos veces en un mililitro de tampón FACS helado por cada 5x10^7 células. Y vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de formaldehído al 2% por 5x10^7 células durante cinco minutos en la oscuridad sobre hielo.

Después de la fijación, lave las celdas dos veces más como se acaba de demostrar. Y vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de tampón FACS fresco y helado por cada 5x10^7 células. A continuación, etiquete las células con uno o dos microgramos del anticuerpo conjugado secundario de estreptavidina adecuado durante 20 minutos en la oscuridad sobre hielo y lave las células dos veces más.

Para el enriquecimiento basado en nanopartículas magnéticas, vuelva a suspender las fracciones de células A, B y C en un mililitro de tampón de separación frío por celdas 5x10^7 y filtre las celdas a través de filtros individuales de 40 microlitros para eliminar cualquier aglomeración. A continuación, agregue las nanopartículas de tinte fluorescente a la concentración adecuada durante 10 minutos en la oscuridad a cuatro grados Celsius con rotación y lave las muestras dos veces en un mililitro de tampón de separación frío. Vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de tampón de separación frío por cada 5x10^7 células.

A continuación, equilibre tres columnas magnéticas en sus imanes del tamaño adecuado con tres mililitros de tampón de separación cada una, permitiendo que todo el volumen de tampón de separación pase por cada columna hacia un contenedor de residuos. Ahora coloque un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado debajo de cada columna y agregue las celdas marcadas con partículas magnéticas a sus respectivas columnas. Cuando todo el volumen de cada fracción de celda haya pasado a través de cada columna, agregue tres mililitros de tampón de separación helado fresco en la parte superior de cada columna, recogiendo los efluentes en los tubos etiquetados.

Después de que el segundo lavado haya drenado completamente a través de las columnas, coloque los tubos de células seleccionadas negativamente de cada fracción en hielo y transfiera las columnas a nuevos tubos de 15 mililitros para cada fracción. Llene cada columna con aproximadamente seis mililitros de tampón de separación nuevo e inmediatamente sumerja el tampón a través de las columnas para recoger las celdas unidas magnéticamente. A continuación, recoja las fracciones celulares positivas y negativas por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en la solución adecuada para el análisis posterior planificado.

En estos gráficos, la frecuencia de células B reactivas al toxoide tetánico de un individuo que fue vacunado por última vez contra el tétanos hace más de una década demuestra la capacidad de este método para enriquecer las células de unión al toxoide tetánico aproximadamente siete veces con la pureza de aproximadamente 4%La adición de un exceso de 50 veces de toxoide tetánico no marcado a las células de un sujeto que fue vacunado unos tres años antes de la extracción de sangre. Antes de añadir el antígeno biotinilado, la unión al tétanos-toxoide disminuye en un 83%, lo que demuestra la especificidad de la unión al antígeno. Cuando el antígeno biotinilado se omite del procedimiento, solo el 0,2% de las células B todavía se unen, presumiblemente, lo que refleja la unión de algún antígeno no tetánico en el absorbente.

Estos gráficos demuestran cómo la frecuencia de células B vírgenes específicas del toxoide tetánico a partir de una muestra de sangre extraída siete días después de la vacunación de refuerzo de un sujeto sano, disminuye del 84% al 64% después del refuerzo. Mientras que el porcentaje de poblaciones de memoria y plasmablasto aumenta del 16% al 36% y de cero al 40% respectivamente. Además, los datos representativos de ELISPOT de una muestra de sangre periférica obtenida siete días después del refuerzo de un sujeto sano ilustran el enriquecimiento cuádruple en la frecuencia de células secretoras de anticuerpos contra el toxoide tetánico observadas en las células B aisladas que se unen al toxoide tetánico.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en unas tres o cuatro horas con todos los controles adecuados. El método puede combinarse con ensayos secundarios, por ejemplo, la transferencia de células a receptores adoptados para estudios posteriores del destino y la función de las células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y enriquecer las células B raras de unión a antígenos de la sangre periférica humana utilizando los controles adecuados.