La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

El objetivo general de esta técnica es mantener el tejido neuronal durante períodos prolongados sin una degradación significativa del tejido. Con este método, los registros electrofisiológicos y las imágenes de calcio se pueden realizar más de 24 horas después de la extracción de tejido. Este método aumentará en gran medida la viabilidad del tejido neuronal extraído de forma aguda y mantendrá su viabilidad durante más de 24 horas, estableciendo un nuevo estándar de oro para la incubación aguda de tejidos.

La principal ventaja de esta técnica es que el tiempo experimental en que se puede utilizar el tejido se incrementa significativamente. Esto reduce el número de animales necesarios y maximiza la cantidad de datos que se pueden obtener de cada experimento. El Braincubator es un sistema automatizado que mantiene la temperatura del tejido y evita la proliferación bacteriana en el líquido extracelular.

Esto proporciona un entorno estrictamente controlado para el tejido. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Orsolya Kekesi y Alba Bellot-Sáez, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para la preparación de las rebanadas de cerebro, prepare rebanadas de cerebro de 300 micrómetros de grosor que contengan la región de interés con un vibrátomo.

A continuación, transfiera las rodajas a un sistema de incubación hecho a medida con flujo de carbógeno, niveles de pH y temperatura controlada. Ajuste la temperatura inicial de la cámara a 35 grados centígrados durante 15 a 30 minutos y luego redúzcala lentamente a 15 grados centígrados. Después de eso, incube las rodajas en el sistema de incubación hasta el registro electrofisiológico o la toma de imágenes.

Para la preparación de la montura completa de la retina, enuclee inmediatamente los ojos de un animal sacrificado. Haga un pequeño corte a lo largo de la ora serrata y coloque los ojos y el Ames'media o aCSF con suministro de carbógeno a temperatura ambiente. Después de eso, retire inmediatamente la córnea, el cristalino y el vítreo cortando a lo largo de la ora serrata con unas tijeras pequeñas y retírelos con pinzas.

Coloque el tejido en el sistema de incubación a temperatura ambiente. Para eliminar la membrana limitante interna, transfiera la copa del ojo que contiene la retina a un pequeño frasco de vidrio que contenga papaína, L-cisteína, EDTA y DNasa a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Aplique carbogen a la solución a través de la tapa, pero no burbujee.

Detenga la digestión enzimática colocando el tejido en una solución de ovomuccoide y BSA durante 10 minutos en el BSS de Earle. A continuación, lave bien el pañuelo con aCSF. Posteriormente, transfiera el tejido al sistema de incubación y reduzca la temperatura a unos 15 a 16 grados centígrados.

A continuación, transfiera el tejido de la retina al microscopio. Aísla la retina del ocular y córtala en cuatro pedazos con una cuchilla de afeitar. Si se requiere toda la retina, haga cuatro pequeños cortes en la periferia de la retina para permitir que quede plana.

Este tejido ahora puede transferirse al microscopio para electrofisiología o mantenerse en el Braincubator. El tejido se mantiene en la cámara principal que contiene las sondas para las mediciones de pH y temperatura. Una segunda cámara está aislada de la cámara principal y se expone a 1,1 vatios de luz UVC para irradiar las bacterias que flotan en la solución.

Utilice una bomba peristáltica para hacer circular aCSF a través de las dos cámaras, y una placa fría termoeléctrica Peltier para enfriar o calentar la cámara principal. En este procedimiento, disuelva el tinte de calcio en DMSO para hacer una solución de un milimolar. Añadir un 1% de ácido plurónico F-127 a la mezcla para conseguir un volumen final de 50 microlitros.

Luego, sonicéalo durante 10 minutos. Prepare una cámara de carga de vidrio con tinte de calcio diluido en 2,5 mililitros de líquido cefalorraquídeo para lograr una concentración final de 10 micromolares para cortes de cerebro y 20 micromolares para retina. En el caso de los cortes de retina y cerebro de animales jóvenes, incubar la muestra en el baño durante 45 minutos.

Para animales adultos, pipetee 25 microlitros de tinte directamente sobre la rodaja de cerebro y manténgalo durante 75 minutos para permitir una mejor penetración del tinte en las capas profundas. Para asegurar una oxigenación adecuada del tejido sumergido durante la incubación del tinte, oxigénelo continuamente con carbógeno a través de la tapa, pero no burbujee. Después de la carga de tinte, lave el tejido con aCSF y transfiéralo al sistema de incubación.

Reduzca lentamente la temperatura a unos 15 a 16 grados centígrados hasta su uso. Para el registro, coloque tejido en una cámara de registro sumergida bajo un microscopio y perfundícelo con aCSF oxigenado a un caudal de cuatro a cinco mililitros por minuto. Sostenga el pañuelo usando un arpa hecha a medida.

A continuación, prepare algunas pipetas de grabación con un extractor de micropipetas para lograr una resistencia final de cinco a seis megaohmios. Llene una pipeta con tres o cuatro microlitros de solución interna y luego coloque la solución en hielo. A continuación, visualice las celdas utilizando una cámara CCD bajo IR-DIC.

Coloque la pipeta en la membrana celular mediante un micromanipulador. Mantenga la presión positiva a través de un puerto de succión en el soporte de pipetas. Una vez que la pipeta esté en la celda, aplique una suave presión negativa a la pipeta para lograr un sellado de gigaohmios.

A continuación, rompe la membrana celular con una breve presión negativa. Posteriormente, inicie la grabación de la pinza amperimétrica o de corriente de toda la celda. Para obtener imágenes radiométricas de Fura-2, utilice un conmutador de longitud de onda de ultra alta velocidad para proporcionar longitudes de onda de excitación de 340 nanómetros y 380 nanómetros.

A continuación, capture la luz emitida a través de un filtro de omisión con una cámara digital de alta sensibilidad y alta velocidad. Para una sola longitud de onda de excitación de Fluo-4, filtre la luz de excitación a través de un filtro de paso de banda de 460 a 490 nanómetros y la luz emitida a través de un filtro de paso de banda de 515 a 550 nanómetros. Después de la digestión, las células ganglionares de la retina y las células amacrinas desplazadas se pueden visualizar claramente bajo la iluminación DIC, y se pueden seleccionar para registros de pinza de parche sin ningún raspado previo de la membrana limitante interna.

Aquí se muestran registros representativos de pinza amperimétrica de una célula ganglionar de la retina. La despolarización de la célula a través de la pipeta de parche provocó la generación de un potencial de acción dependiente de la dosis, lo que indica la viabilidad de las células después del tratamiento con papaína. La eliminación de la membrana limitante interna también permitió la tinción ubicua de la capa de células ganglionares con Fura-2 AM. Y las células respondieron a la aplicación de cloruro de potasio de 30 milimolares con un gran aumento en la concentración de calcio intracelular, como lo demuestra un aumento en la proporción de 342 a 380 nanómetros en relación con F0. Después de la aplicación de cloruro de potasio, los niveles de calcio volvieron a la línea de base después de la estimulación.

Y las células podrían ser estimuladas posteriormente para producir una respuesta de amplitud similar. Además, estas respuestas fueron indistinguibles entre la retina registrada a menos de cuatro horas y más de 24 horas después de la disección. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tejido neuronal agudo está indefenso desde el punto de vista ambiental.

Por lo tanto, la regulación estricta de aCSF a través de un monitoreo cercano del pH, la temperatura y los niveles bacterianos es esencial para mantener la actividad celular y la integridad de la red. Este procedimiento se puede utilizar para mantener el tejido neuronal durante más de 24 horas sin necesidad de técnicas asépticas o el uso de medios de cultivo que contengan factores de crecimiento o antibióticos que puedan afectar a la fisiología. Esperamos que este método establezca el estándar de oro para los parámetros ideales para maximizar la viabilidad del tejido.

Esto reduce la variabilidad en la salud del propio tejido y, por lo tanto, reduce la variabilidad experimental. El uso del protocolo de papaína para digerir la membrana limitante interna de la retina permite lograr una tinción ubicua con tintes de calcio. Este protocolo también se puede utilizar para obtener registros intracelulares multisitio de las neuronas de la capa de células ganglionares.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo mantener el tejido viable durante más de 24 horas para imágenes y experimentos electrofisiológicos. No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser peligroso. Siempre se deben usar precauciones, como gafas protectoras, mientras se realiza este procedimiento.