Name: La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a mantener tejido neuronal agudo viable durante más de 24 horas mediante el sistema Braincubator. Este método permite realizar registros electrofisiológicos e imagen de calcio con alta calidad.

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Agradecemos a Colin Symons y James Wright por su asistencia técnica. Este trabajo contó con el apoyo de una subvención de financiación inicial (WSU) a Y.B. y a la oficina de innovación de la Universidad de Western Sydney. M.C. cuenta con el apoyo de la beca ARC (DECRA).

El protocolo siguiente se describe la preparación de C57BL / 6 y C3H / He (retinally degenere) tejido neuronal de ratón, pero las técnicas similares puede aplicarse a otras especies. Todos los animales estaban sanos y tratarse con las condiciones normales de temperatura, humedad, 12 h ciclo luz / oscuridad, el acceso libre a comida y agua, y sin ningún tipo de estímulos de estrés previstos. Todos los experimentos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el comité de la Universidad de Western Sydney Cuidado de Animales y Ética y de acuerdo con el uso de los animales y las directrices para el cuidado de Investigación de Animales (Autoridad # A9452, # A10396 y # A8967). 1. Preparación de la rebanada del cerebro <ol><li> Anestesiar al animal mediante inhalación de isoflurano (5%) y decapitar usando una guillotina de roedores. Retire el cerebro rápidamente, como se describe anteriormente 9 y colocarlo en solución enfriada con hielo fisiológica (LCRa) que contiene (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 25NaHCO 3, 25 de dextrosa, y saturado con carbógeno (95% O 2/5% de mezcla de CO 2; 310 mOsm; pH 7,4). </li><li> Cortar rodajas de cerebro, en la región de interés, a 300 m de grosor con un microtomo vibración. </li><li> Transferir las rebanadas de un sistema de incubación hecha a la medida que supervisa y controla estrechamente los niveles de pH (pH 7.2 a 7.4), el flujo y la temperatura Carbógeno, como se ha descrito previamente 10, 11. </li><li> Conjunto temperatura inicial cámara a 35 ° C durante 15 - 30 min, y luego reducir lentamente a 15 - 16 ° C como se muestra en la Figura 1C. Incubar las rebanadas en el sistema de incubación hasta que se necesite, ya sea para electrofisiología o formación de imágenes. NOTA: Si las rebanadas deben ser utilizados para el calcio de imágenes, siga los pasos a continuación antes tejido enfriamiento por debajo de la temperatura ambiente. </li></ol> 2. Retina Wholemount Preparación y limitante interna para retirar la membrana <ol><li> Preparar wholemounts retina en régimen normal,las condiciones de iluminación de laboratorio o tenue luz roja / infrarroja. </li><li> La eutanasia a los animales por dislocación cervical y los ojos inmediatamente enucleate. Hacer un pequeño corte a lo largo de la ora serrata, y el lugar, ya sea en medios de Ames, o ACSF que contiene (mM): 125 NaCl, 25 de NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 de glucosa, 0,5 L-glutamina, y saturar con carbógeno (95% O 2/5% de CO mezcla 2; ~ 300 mOsm; pH 7,4), a TA. </li><li> Retirar inmediatamente la córnea, cristalino y vítreo cortando a lo largo de la ora serrata con pequeñas tijeras y la eliminación de la lente y el vítreo con fórceps. Coloque el tejido en el sistema de incubación a RT. NOTA: tejido de la retina puede ser mantenido en el ojo de copa, después de la reducción lenta de la temperatura a 15-16 ° C, durante&gt; 24 h en el sistema de incubación hasta que se necesite. </li><li> Para extraer la ILM, transferir el ocular de la retina que contiene a un pequeño frasco de vidrio que contiene 30 U / ml de papaína, 1 mM de L-cistina, EDTA 0,5 mM y 0,005% de DNasa en Earl&#39;s-Solución salina equilibrada (BSS) a 37 ° C durante 20 min. Aplicar el 95% de O2 / 5% de CO 2 a la solución a través de la tapa, pero no hacer burbujas. Si se utiliza el tejido de animales jóvenes (&lt;6 semanas), se diluye la solución a mitad de su fuerza. <ol><li> Deja de digestión enzimática, mediante la colocación del tejido en una solución de ovomucoide (10 mg / ml) y BSA (10 mg / ml) durante 10 min en BSS de Earl. tejido de lavado a fondo con LCRa antes de la transferencia al sistema de incubación y a reducir la temperatura a 15-16 ° C. </li></ol></li><li> Mantener el tejido de la retina en el ojo taza hasta que se necesite. Para su transferencia al microscopio, aislar la retina del ojo taza y se corta en 4 piezas con una hoja de afeitar. Si se requiere toda la retina, hacer cuatro cortes pequeños en la periferia de la retina para permitir que quede plano. NOTA: Para los experimentos de imagen, carga con el calcio-colorantes antes de la transferencia al sistema de incubación, véase más adelante. </li></ol> 3. Realizar el mantenimiento del tejido en la incubadora <ol><li&gt; Place tejido en la cámara principal que contiene sondas para mediciones de pH y de temperatura (Figura 1A, B). </li><li> Hacer circular LCRa a través de una segunda cámara (cámara de UVC, construido como se ha descrito previamente 12) aislado de la cámara principal y se expusieron a 1,1 W luz UVC (254 nm, lámpara UV 5W / 2P esterilizador) con el fin de eradiate bacterias que flotan en la solución (Figura 1A). temporización luz de control UVC a través de un temporizador programable utilizando una función aleatoria que se activa en momentos que varían entre 15 y 26 min cada 15 - 30 minutos para evitar un calentamiento excesivo de la ACSF. </li><li> Ajuste la velocidad de flujo en la cámara UVC a 12 ml / min, como se informó anteriormente 12. Cubrir la cámara UVC con papel de aluminio para evitar UVC iluminación fuera de la cámara, lo que puede dañar el tejido neuronal. NOTA: Para obtener tejido de la retina adaptada a la oscuridad, aplicar una cubierta a medida que la cámara principal para excluir la luz. </li><li> Use una bomba peristáltica para Circulate la solución (LCRa) a través de las dos cámaras y un plato frío termoeléctrico Peltier refrigerador para enfriar o calentar la cámara principal a las temperaturas deseadas en el rango de 0 - 50 ° C. Para la incubación del tejido óptimo, use 15 - 16 ° C para la viabilidad a largo plazo. </li></ol> 4. El calcio colorante de carga <ol><li> Seleccionar colorantes de calcio en base a la preferencia del investigador individual. Aquí utilizamos Fura-2AM, Fluo-8 o Fluo-4am. Sin embargo, este método se puede aplicar a otros colorantes, así: disolver colorantes de calcio en DMSO a una solución de copolímeros de 1 mM y 1% de bloque (por ejemplo, ácido-127 Pluronic) a un volumen final de 50 l y se somete a ultrasonidos durante 10 min. </li><li> Añadir solución a LCRa a una concentración final de 10 mM, copolímeros de bloque 0,01% para los cortes de cerebro, y 20 mM (retina), copolímeros de bloque 0,02% para la retina. En las retinas (papaína tratada) y las secciones de cerebro de animales jóvenes, la carga de la bañera durante 45 minutos a 37 ° C (Fura-2 AM) o a temperatura ambiente (Fluo-4 am, Fluo-8 AM). <ol><li> Para los animales adultos, (&gt; 12 semanas) pipetear los colorantes (50 l) directamente en las secciones de cerebro, y mantener durante 75 min para permitir una mejor penetración del colorante en las capas profundas. </li><li> Para asegurar una oxigenación adecuada de la rebanada sumergida durante la incubación colorante, preparar una cámara de carga de vidrio con una tapa cerrada (frasco circular de 2,5 cm de diámetro, 3,5 cm de altura) con tintes de calcio diluido en 2,5 ml de LCRa. Oxigenar continuamente con 95% O2 / 5% de CO 2. No hacer burbujas. </li></ol></li><li> Después de la carga de colorante, lavar el tejido con ACSF y traslado al sistema de incubación, reducir lentamente la temperatura a 15 - 16 ° C hasta su uso experimental. </li></ol> 5. Registros electrofisiológicos y de imagen <ol><li> Coloque el tejido en una cámara de grabación sumergida bajo el microscopio, y perfundir con oxigenada LCRa a una velocidad de flujo de 4-5 ml / min, ya sea a temperatura ambiente (~ 22 ° C) o temperatura fisiológica (~ 35 ° C). Hold el tejido en su lugar mediante el uso de un encargo a &#39;&#39; arpa &#39;&#39;, hecha de hilos de nylon o de oro estirados y pegados a través de una pieza en forma de U de oro o de alambre de platino. </li><li> Para electrofisiología: <ol><li> Preparar las pipetas de registro de 1,5 mm (1,19 mm de diámetro interior) de vidrio de borosilicato con un extractor de micropipeta para lograr una resistencia final 5-6 mO. </li><li> Llenar la pipeta con 3-4 l de solución interna como se describe anteriormente 13 y visualizar células bajo infrarrojos contraste de interferencia diferencial (IR-DIC) utilizando una cámara CCD. La solución intracelular debe adaptarse cuidadosamente para cada experimento para lograr los resultados experimentales. </li><li> Posición de la pipeta, mientras que el mantenimiento de una presión positiva aplicada a través de un orificio de aspiración en el soporte de la pipeta, en la membrana de una célula usando un micromanipulador. Dado que la ILM ha sido retirado de la retina, no se requiere ningún raspado membrana antes. Una vez que la pipeta está en la célula, aplicar negativo suavepresión a la pipeta para lograr un sellado gigaohmio. A continuación, la ruptura de la membrana celular con una breve cantidad de presión negativa. </li><li> Hacer de células enteras grabaciones current- o de fijación de voltaje utilizando técnicas estándar, según corresponda. </li></ol></li><li> El calcio de imágenes: <ol><li> Para imagen radiométrica de Fura-2, utilice un ultra-alta velocidad de conmutación de longitud de onda para proporcionar longitudes de onda de excitación de 340 nm y 380 nm. Pasar la luz emitida a partir de células individuales a través de un filtro de emisión de 510 ± 20 nm, y capturar con una alta sensibilidad, una cámara digital de alta velocidad. </li><li> Para una sola longitud de onda de excitación de Fluo-4, la luz de excitación a través de un filtro de 460 - filtro de paso de banda de 490 nm y la luz emitida a través de un 515 - filtro de paso de banda de 550 nm. Para la grabación más rápida y más sensible utilizar una cámara digital de alta velocidad, por ejemplo. Adquirir imágenes según sea necesario. </li><li> Medir alteraciones en la fluorescencia como una función del tiempo, ya sea en una sola longitud de onda (Fluo-4) o el uso de la relación de longitud de ondamétodo (Fura-2), como se describe anteriormente 8, 14. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Yossi Buskila y Paul Breen declaran ser copropietarios de PAYO Scientific Pty Ltd, una empresa especializada en la construcción de sistemas de incubación para tejido neural agudo. Todos los demás autores no informan intereses financieros ni posibles conflictos de intereses relacionados con el estudio actual.

Este artículo describe un método de incubación de extender la viabilidad del tejido neuronal aguda para los experimentos de formación de imágenes y electrofisiológicos, reduciendo así el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales. Dos procesos principales gobiernan el deterioro del tejido neuronal a través del tiempo: i) el aumento de los niveles de bacterias, y el consiguiente aumento de la endotoxina bacteriana liberado, y ii) la excitotoxicidad que sigue el procedimiento de corte traumático...

Electrofisiología y la imagen funcional (calcio, colorantes sensibles al voltaje) son dos de las técnicas experimentales más utilizados en la neurociencia. preparaciones de cortes de cerebro y de la retina wholemount, que será examinada aquí, proporcionan un medio de examinar las propiedades electrofisiológicas y conectividad sináptica y sin contaminación de anestésicos o relajantes musculares. Rodajas de cerebro y de la retina wholemount mantienen su integridad estructural, a diferencia de las culturas o los homogeneizados celulares, permitiendo el estudio de los circuitos cerebrales específicos y redes 1. Las grabaciones de tejido aislado tienen ventajas sobre las grabaciones en vivo como los movimientos asociados con el latido del corazón y la respiración se eliminan. Por otra parte, la visualización directa permite que las clases específicas de células para ser dirigidos, y la aplicación local de herramientas farmacológicas 2, 3. patch-clamp grabaciones y Calcio tinte de carga en wholemount retina se complica por la existencia de la membrana limitante interna (ILM), que cubre la capa de células ganglionares de la retina (RGC) e impide el acceso directo a las células. Típicamente, esta membrana se raspa con una pipeta de vidrio para permitir la aplicación directa de una pipeta de parche y la formación de un sello gigaohmio en una sola célula. Además, los colorantes de calcio de baño aplicado no cruzan la ILM y, o bien deben ser inyectados debajo de esta membrana 4, retrógradamente transportado después de la inyección en el nervio óptico 5 o electroporación a través del tejido 6. Por otra parte, cuando se utiliza un modelo de roedor de la retinitis pigmentosa, el ratón rd / rd, la ILM es más gruesa y más impenetrable. Aquí, nosotros usamos una técnica para eliminar la ILM con la digestión enzimática 7, para permitir tanto ubicua de calcio colorante de carga, y el acceso directo a las células ganglionares de la retina para recordi patch-clampNGS 8. grabaciones de éxito de cualquiera de las secciones de cerebro o de la retina wholemount dependen de la disección y la incubación del tejido neuronal viable. Típicamente, el tejido se extrae en la mañana del experimento y se incubó en fluido cerebroespinal artificial (ACSF) hasta que se utiliza para las grabaciones. Por lo general, el tejido sigue siendo viable durante 6 - 8 h, con una degradación significativa después de esta ventana de tiempo. Sin embargo, ambas secciones de cerebro y preparados retinae wholemount suelen producir más tejido que puede ser grabado desde dentro de este período de tiempo corto. En consecuencia, el tejido a menudo se desecha al final del día y la disección se completa de nuevo en días posteriores. Esto significa otro animal y se utiliza ~ 2 h de la configuración y la disección / tinción repetida. El siguiente protocolo describe un método para extender la vida de tejido neuronal durante más de 24 h, lo que significa un menor número de animales se utilizan, y el tiempo más experimental está disponible. Viabilidad del tejido wcomo se evaluó a través de la grabación de las propiedades electrofisiológicas y la dinámica del calcio, y estas propiedades eran indistinguibles entre &lt;4 hy&gt; 24 h postdissection. Estos resultados indican que no sólo tienen una propiedad de una sola célula intacta y funcional después de una incubación prolongada, pero la actividad de la red, según la evaluación de calcio de imágenes y registros electrofisiológicos, es sin cambios&gt; 24 h postdissection. Por otra parte, se muestra que los colorantes de calcio pueden permanecer en las células durante períodos prolongados sin causar efectos perjudiciales. La aplicación de este protocolo demuestra que la actividad funcional de las neuronas en el tejido neuronal aguda puede mantenerse durante largos períodos de tiempo, una vez que el entorno externo es altamente regulado. Además, como la viabilidad del tejido varía mucho entre laboratorios debido a diferentes protocolos de incubación, este método establece un estándar de oro para los parámetros ideales que se deben aplicar para reducir la variabilidad en la salud de neu agudaRonal tejido.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich VETEC V800372</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de disociación de papaína</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>Dimetilsulfóxido anhidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Baja absorbancia UV*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>Solución al 20% en DMSO&nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla vibratoria micrótomo&nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>equipado con Leica' s Vibrocheck&comercio; dispositivo de medición&nbsp;</td></tr><tr><td>Mesa antivibratoria</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio vertical de platina fija</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de microscopio</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&nbsp;</td></tr><tr><td>Objetivo de microscopio</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>Conmutador de longitud de onda de alta velocidad</td><td>Instrumento</td><td>Sutter Lambda DG-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de pinza de parche</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de datos</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; Sistema</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de microelectrodos</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Tirador de micropipetas de tipo marrón / Flameado/marrón</td></tr><tr><td>Cámara de grabación/perfusión</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Cámaras de baño abiertas de perfil bajo</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes de células vivas Andor iQ</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubadora</td><td>Payo Scientific</td><td></td><td>BR26021976 www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-termoeléctrico Enfriador de placa fría</td><td>Tecnología</td><td>TE CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Tecnología TE</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

la incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la sección de electrofisiología y calcio de imágenes

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Aguda preparaciones de tejidos neuronales, rodajas de cerebro y de la retina wholemount, por lo general sólo puede ser mantenido durante 6 - 8 h después de la disección. Esto limita el tiempo experimental, y aumenta el número de animales que se utilizan por estudio. Esta limitación específicamente impactos protocolos tales como imágenes de calcio que requieren pre-incubación prolongada con tintes de baño-aplicado. crecimiento bacteriano exponencial dentro de 3 - 4 h después de cortar está estrechamente correlacionada con una disminución de la salud de los tejidos. Este estudio describe un método para limitar la proliferación de bacterias en preparaciones agudas para mantener el tejido neuronal viable durante periodos prolongados de tiempo (&gt; 24 h) sin la necesidad de antibióticos, los procedimientos estériles, o medios de cultivo de tejidos que contienen factores de crecimiento. Ciclando el fluido extracelular a través de la irradiación UV y mantener el tejido en una cámara de retención de encargo en 15 - 16 ° C, el tejido no muestra diferencias en las propiedades electrofisiológicas, o si calciognaling a través de colorantes de calcio intracelular en&gt; 24 h postdissection. Estos métodos no sólo extender el tiempo experimental para aquellos que utilizan tejido neuronal aguda, pero se reducirá el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales, y establecerá un estándar de oro para la incubación del tejido neuronal aguda.

estrecha regulación de la carga bacteriana y la temperatura del LCRa durante la incubación es esencial para mantener la viabilidad del tejido neuronal. Esto puede ser optimizado a través de irradiación con luz UVC y manteniendo la temperatura de la LCRa a 15 - 16 ° C (Figura 1). Por otra parte, la ACSF Parámetros de sello (APS; Figura 1C) proporciona el experimentador con un registro de las condiciones ambientales (pH y temperatura.), Lo que ofrece un es...

Una vez retirado del cuerpo, el tejido neuronal se ve afectada en gran medida por las condiciones ambientales, lo que lleva a una eventual degradación de los tejidos después de 6-8 h. Utilizando un método de incubación única, que sigue de cerca y regula el ambiente extracelular de los tejidos, la viabilidad del tejido se puede ampliar de manera significativa para&gt; 24 h.

La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

El objetivo general de esta técnica consiste en mantener el tejido neuronal durante períodos prolongados sin degradación significativa del tejido. Mediante este método, se pueden realizar grabaciones electrofisiológicas e imágenes de calcio más de 24 horas después de la extracción del tejido. Este método aumentará considerablemente la viabilidad del tejido neuronal extraído de forma aguda y mantendrá su viabilidad durante más de 24 horas, estableciendo un nuevo estándar de oro para la incubación de tejido agudo.La principal ventaja de esta técnica es que el tiempo experimental durante el cual se puede utilizar el tejido aumenta significativamente. Esto reduce el número de animales necesarios y maximiza la cantidad de datos que se pueden obtener de cada experimento. El Braincubator es un sistema automatizado que mantiene la temperatura del tejido y previene la proliferación bacteriana en el líquido extracelular.Esto proporciona un entorno estrictamente controlado para el tejido. Esta técnica será demostrada por Orsolya Kekesi y Alba Bellot-Saez, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para la preparación de cortes de cerebro, prepare cortes cerebrales de 300 micrómetros de grosor que contengan la región de interés con un vibrátomo.Luego, transfiera las secciones a un sistema de incubación personalizado con flujo de carbógeno, niveles de pH y temperatura controlados. Establezca la temperatura inicial de la cámara en 35 grados Celsius durante 15 a 30 minutos, y luego redúzcala lentamente a 15 grados Celsius. A continuación, incube las secciones en el sistema de incubación hasta la grabación de electrofisiología o el análisis por imágenes.Para la preparación de montajes completos de retina, enuclee inmediatamente los ojos de un animal sacrificado. Haga un pequeño corte a lo largo de la ora serrata y coloque los ojos en medio de Ames o en aCSF con suministro de carbógeno a temperatura ambiente. A continuación, retire inmediatamente la córnea, el cristalino y el vítreo cortando a lo largo de la ora serrata con tijeras pequeñas y elimínelos con pinzas.Coloque el tejido en el sistema de incubación a temperatura ambiente. Para eliminar la membrana limitante interna, transfiera la copa ocular que contiene la retina a un frasco de vidrio pequeño que contenga papaína, L-cisteína, EDTA y DNasa a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Aplique carbógeno a la solución a través de la tapa, pero no burbujee.Detenga la digestión enzimática colocando el tejido en una solución de ovomucoide y BSA durante 10 minutos en BSS de Earle. Luego, lave el tejido exhaustivamente con aCSF. Posteriormente, transfiera el tejido al sistema de incubación y reduzca la temperatura a aproximadamente 15-16 grados Celsius.A continuación, transfiera el tejido retiniano al microscopio. Aísle la retina del copa ocular y córtela en cuatro piezas con una hoja de afeitar. Si se requiere la retina completa, realice cuatro cortes pequeños en la periferia de la retina para permitir que quede plana.Este tejido ahora puede transferirse al microscopio para realizar electrofisiología o mantenerse en el Braincubator. El tejido se mantiene en la cámara principal que contiene las sondas para mediciones de pH y temperatura. Una segunda cámara está aislada de la cámara principal y se expone a luz UVC de 1,1 vatios con el fin de irradiar las bacterias que flotan en la solución.Utilice una bomba peristáltica para circular el ACSF a través de las dos cámaras y una placa fría termoeléctrica Peltier para enfriar o calentar la cámara principal. En este procedimiento, disuelva el colorante de calcio en DMSO para obtener una solución de un milimolar. Añada ácido plurónico F-127 al 1 % a la mezcla para alcanzar un volumen final de 50 microlitros.Luego, someta la muestra a sonicación durante 10 minutos. Prepare una cámara de carga de vidrio con colorante de calcio diluido en 2,5 mililitros de ACSF para obtener una concentración final de 10 micromolares para cortes cerebrales y de 20 micromolares para retina. Para retina y cortes cerebrales de animales jóvenes, incube la muestra en el baño durante 45 minutos.Para animales adultos, aplique 25 microlitros de colorante directamente sobre el corte de cerebro y manténgalo durante 75 minutos para permitir una mejor penetración del colorante en las capas profundas. Para asegurar una adecuada oxigenación del tejido sumergido durante la incubación con el colorante, oxigene continuamente mediante carbógeno a través de la tapa, pero sin burbujear. Tras la carga con el colorante, lave el tejido con aCSF y transfiéralo al sistema de incubación.Reduzca lentamente la temperatura a aproximadamente 15-16 grados Celsius hasta su uso. Para la grabación, coloque el tejido en una cámara de grabación sumergida bajo un microscopio y perfúndalo con aCSF oxigenado a un flujo de cuatro a cinco mililitros por minuto. Sujete el tejido utilizando una púa casera.A continuación, prepare algunos pipetas de registro utilizando un extractor de micropipetas para lograr una resistencia final de cinco a seis megaohmios. Llene una pipeta con tres a cuatro microlitros de solución interna, y luego coloque la solución en hielo. A continuación, visualice las células utilizando una cámara CCD bajo IR-DIC.Coloque la pipeta sobre la membrana celular utilizando un micromanipulador. Mantenga una presión positiva a través de un puerto de succión en el porta-pipetas. Una vez que la pipeta esté sobre la célula, aplique una presión negativa suave a la pipeta para lograr un sello del orden de gigaohmios.Luego, rompa la membrana celular con una breve presión negativa. Posteriormente, inicie la grabación de corriente o voltaje en configuración de célula completa. Para la imagen ratiométrica de Fura-2, utilice un conmutador de longitud de onda de ultra alta velocidad para proporcionar longitudes de onda de excitación de 340 nanómetros y 380 nanómetros.Luego, capture la luz emitida mediante un filtro de emisión con una cámara digital de alta sensibilidad y alta velocidad. Para una única longitud de onda de excitación de Fluo-4, filtre la luz de excitación a través de un filtro de banda pasante de 460 a 490 nanómetros y la luz emitida a través de un filtro de banda pasante de 515 a 550 nanómetros. Tras la digestión, las células ganglionares de la retina y las células amacrinas desplazadas pueden visualizarse claramente bajo iluminación DIC y pueden ser seleccionadas para registros de registro por parche sin necesidad de raspar previamente la membrana limitante interna.Se muestran aquí grabaciones representativas con clamp de corriente de una célula ganglionar retiniana. La despolarización de la célula mediante la pipeta de parche provocó la generación de potenciales de acción dependientes de la dosis, lo que indica la viabilidad de las células tras el tratamiento con papaína. La eliminación de la membrana limitante interna también permitió una tinción ubicua de la capa de células ganglionares con Fura-2 AM. Además, las células respondieron a la aplicación de cloruro de potasio 30 milimolar con un gran aumento en la concentración de calcio intracelular, evidenciado por un incremento en la relación de 342 a 380 nanómetros respecto a F0. Tras la aplicación de cloruro de potasio, los niveles de calcio regresaron a la línea base tras la estimulación.Y las células pudieron estimularse posteriormente para producir una respuesta de amplitud similar. Además, estas respuestas fueron indistinguibles entre la retina registrada a menos de cuatro horas y más de 24 horas posteriores a la disección. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tejido neuronal agudo es ambientalmente vulnerable.Por lo tanto, la regulación estricta del LCRa mediante una vigilancia cercana del pH, la temperatura y los niveles bacterianos es esencial para mantener la actividad celular y la integridad de la red. Este procedimiento puede utilizarse para conservar el tejido neuronal durante más de 24 horas sin necesidad de técnicas asépticas ni del uso de medios de cultivo que contengan factores de crecimiento o antibióticos que puedan afectar la fisiología. Esperamos que este método establezca el estándar de oro para los parámetros ideales que maximicen la viabilidad del tejido.Esto reduce la variabilidad en la salud del propio tejido y, posteriormente, disminuye la variabilidad experimental. Utilizar el protocolo de papaina para digerir la membrana limitante interna de la retina permite lograr una tinción ubicua con colorantes de calcio. Este protocolo también puede emplearse para obtener grabaciones intracelulares multilocalizadas de neuronas de la capa de células ganglionares.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mantener tejido viable durante más de 24 horas para experimentos de imagen y electrofisiológicos. No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como usar protección ocular, al realizar este procedimiento.

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Neurociencia

Se demuestra cómo los cambios en la concentración de calcio libre intracelular y la eficacia sináptica puede controlarse simultáneamente en una preparación de...

Seguimiento de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el molusco<em&gt; Aplysia</em

Este video muestra un método para la incubación prolongada del tejido neuronal de la retina. Los oculares que contienen retina se obtienen de un ojo de ratón; la membrana limitante interna (ILM) se digiere enzimáticamente para exponer las células neuronales de la retina, y el ocular tratado o la retina aislada se transfiere a una incubadora especializada para una incubación prolongada a baja temperatura.

Una técnica para la incubación prolongada del tejido neuronal de la retina

Este video muestra un protocolo para el registro de patch-clamp de células completas e imágenes de calcio de dos fotones en cortes de hipocampo cerebral. Este método permite estudiar la dinámica de los transitorios locales de Ca2+ (CaTs) en dendritas de diferentes tipos neuronales en cortes cerebrales agudos.

Establecimiento de una configuración de célula completa para la obtención de imágenes de calcio de dos fotones de cortes de cerebro

Este video muestra una técnica para medir la actividad neuronal en cortes de cerebro de ratón utilizando imágenes de calcio y registros electrofisiológicos. Al perfundir el tejido con iones de potasio y registrar los cambios de calcio intracelular a través de imágenes digitales de alta velocidad, este método revela respuestas neuronales en tiempo real.

Medición de la actividad neuronal en un trozo de cerebro de ratón después de una incubación prolongada

Se describen procedimientos para realizar registros simultáneos del potencial o corriente de membrana y los cambios en la concentración de calcio intracelular. Las neuronas del núcleo supraquiasmático se llenan con el indicador de calcio bis-fura-2 mediante un electrodo de pinza de parche en la configuración de pinza de parche de toda la célula.

Registro electrofisiológico simultáneo e imágenes de calcio de neuronas del núcleo supraquiasmático

Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón.

Multi-fotón intracelular de sodio Imaging Combinado con Desembalado focal UV-mediada de glutamato en las neuronas CA1 Piramidal

El sistema nervioso entérico (SNE) es una red de neuronas y glía localizada en la pared intestinal que controla los reflejos intestinales. Este protocolo describe los métodos para registrar la actividad de las neuronas entéricas y la glía en preparaciones vivas de ENS utilizando imágenes de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico

Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Microglia, las células inmunes residentes del cerebro, responde rápidamente con cambios morfológicos a modificaciones de su entorno. Este protocolo describe cómo usar microscopía de dos fotones para estudiar la atracción de procesos de microglial hacia serotonina o ATP en rebanadas de cerebro agudo de ratones.

Proyección de imagen de dos fotones de atracción Microglial procesos hacia ATP o serotonina en rebanadas de cerebro agudo

Presentamos un protocolo para preparar rodajas agudas del hipocampo dorsal-intermedio de ratones. Comparamos esta preparación transversal con el corte coronal en términos de calidad de las grabaciones y preservación de las características morfológicas de las neuronas grabadas.

Preparación de rodajas agudas del hipocampo dorsal para la grabación de células enteras y la reconstrucción neuronal en el dentate gyrus de ratones adultos

Aprende a mantener tejido neuronal agudo viable durante más de 24 horas mediante el sistema Braincubator. Este método permite realizar registros electrofisiológicos e imagen de calcio con alta calidad.

La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

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