Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

El objetivo general de este experimento es obtener una inmunotinción fiable previa a la inclusión de tejido cerebral de no primates para la microscopía electrónica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroanatomía, como la incidencia sináptica de una inervación dada en una estructura cerebral precisa. La principal ventaja de esta técnica es que es un método fácil y de bajo coste para etiquetar inervaciones específicas adecuadas para la microscopía electrónica.

Comience transfiriendo secciones de 50 micras de espesor de cerebro de primate no humano fijado con acroleína que contenga la región de interés a una placa de 12 pocillos que contenga PBS. Lave las secciones flotantes tres veces en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego incube las secciones en una solución de borohidruro de sodio recién preparada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mece suavemente sin cubrirte.

Una vez transcurridos los 30 minutos, aspirar el borohidruro de sodio y añadir PBS a cada pocillo. Coloque el plato sobre una mecedora y agite vigorosamente durante 10 minutos. Repita el lavado dos veces más o hasta que no quede nada del gas de reacción.

Bloquee las secciones incubando en una solución de 2% de suero normal y 0,5% de gelatina de pescado fría diluida en PBS durante una hora a temperatura ambiente con un balanceo suave. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, incubar las secciones en una solución primaria de anticuerpos con un balanceo suave durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, después de lavar las secciones como antes, incubar las secciones en una solución secundaria de anticuerpos durante una hora y media a temperatura ambiente con un balanceo suave.

Después de lavar las secciones como antes, incubar en una solución de avidina-biotina-peroxidasa o ABC durante una hora con balanceo. A continuación, prepare una solución fresca de 0,05%3, 3'diaminobenzidina con peróxido de hidrógeno al 0,005% diluido en TBS. Después del lavado, incube las secciones en la solución DAB durante tres a siete minutos con un balanceo suave.

Una vez que el precipitado marrón se haya desarrollado al color deseado, detenga la reacción lavando rápidamente dos veces en TBS frío, luego a través de una serie de lavados TBS y PB cronometrados. Transfiera la placa que contiene las secciones manchadas con DAB a la campana de ventilación. Transfiera las secciones a una placa de seis pocillos llena de PB y aplane completamente las secciones pipeteando cuidadosamente el PB fuera de la placa, luego agregue la solución de tetróxido de osmio gota a gota para evitar perturbar las secciones aplanadas.

Cubra la placa con papel de aluminio para proteger las secciones de la luz e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente sin agitar. Durante la osmificación, prepare resina epoxi repelente al agua agregando cantidades apropiadas de cada componente de la mezcla de resina epoxi a un vaso de plástico grande. Revuelva con un palo de madera o una pipeta de plástico hasta obtener un color marrón homogéneo, luego transfiera cantidades iguales de resina a tazas de aluminio del tamaño adecuado para el número de secciones a procesar y déjela reposar.

Una vez transcurrido el periodo de osmificación, lavar las secciones tres veces en PB durante 10 minutos con balanceo a baja velocidad. Después del lavado, deshidrate las secciones de la siguiente serie de etanol graduado durante dos minutos cada una. A continuación, transfiera las secciones a viales de vidrio llenos de óxido de propileno e incube en óxido de propileno tres veces durante dos minutos cada una para completar el proceso de deshidratación.

Luego transfiera las secciones con cuidado, una por una, a las tazas de aluminio, evitando el contacto con el aire tanto como sea posible. Incruste las secciones en resina epoxi repelente al agua previamente mezclada e incube durante la noche bajo la campana de ventilación a temperatura ambiente. Al día siguiente, cubra los portaobjetos de vidrio y los cubreobjetos de plástico con aceite mineral, luego ablande la resina incubando los vasos de aluminio a 60 grados centígrados durante 12 a 15 minutos como máximo.

Aplana con cuidado las secciones del lado engrasado del portaobjetos de vidrio. Coloque el cubreobjetos engrasado y expulse con cuidado el aire restante. Incubar los portaobjetos a 60 grados centígrados durante 48 horas.

Después de 48 horas, retire el cubreobjetos de plástico, dejando la sección envuelta en resina. Comience usando binoculares para ubicar la región de interés y luego use un bisturí para cortar una pequeña pieza cuadrangular de tejido de aproximadamente un mililitro cuadrado. A continuación, lima la punta de un bloque de resina y luego pega la pieza de tejido cuadrangular sobre él.

Después del secado, coloque el bloque de resina en la plataforma de ultramicrótomo en posición vertical y use una hoja de afeitar afilada para cortar gradualmente cada lado del bloque de resina para formar un trapecio con lados lisos. A continuación, coloque la plataforma en su posición horizontal y gire el bloque hasta que el lado más largo del trapecio quede hacia abajo. Coloque una herramienta de corte de diamante o un cuchillo de vidrio en un espacio dedicado.

Configure el ultramicrótomo para cortar secciones de 300 micras a un milímetro por segundo. Ajuste el cuchillo para que quede verticalmente paralelo a la pieza cuadrangular y para que muestre un ángulo horizontal muy pequeño de aproximadamente un grado y recorte la superficie de la pieza cuadrangular hasta que el tejido comience a aparecer. Ahora, cambie a un cuchillo de diamante ultra 45 grados equipado con un bote lleno de agua destilada para cortar secciones de 80 micras de grosor.

Alisa las secciones repasándolas con un trozo de papel absorbente con punta de xileno sin tocar la superficie del agua, y recoge las secciones en serie en rejillas de cobre de malla 150 desnudas. Coloque las rejillas en una caja de almacenamiento de rejilla, luego prepare una solución uno a uno de solución de citrato de plomo y agua destilada y filtre a través de un filtro de jeringa de 0.2 micras. Cubra el vial con papel de aluminio para protegerlo de la luz.

Coloque cada rejilla sobre una gota de la solución de citrato de plomo diluida, con la sección en contacto con la solución Luego use pinzas pequeñas para sostener la rejilla y enjuáguela bien con dos vasos de precipitados que contengan agua destilada. Retire suavemente el exceso de agua con papel absorbente y coloque las rejillas en una caja de rejilla. Después de 30 minutos, las secciones pueden examinarse mediante microscopía electrónica de transmisión.

Esta micrografía electrónica del globo pálido interno del mono ardilla muestra material bien conservado después de la perfusión transcardíaca con acroleína-PFA en la técnica de inmunoperoxidasa diaminobenzidina. Como se ve allí, el procedimiento permite ver la vaina de mielina de un axón grande, indicado por la punta de flecha. Esta micrografía electrónica del globo pálido externo muestra los perfiles dendríticos, indicados por la letra d, pequeños axones no mielinizados, indicados por a, y las varices axónicas, marcadas como av, pueden identificarse fácilmente.

Las flechas muestran un ejemplo de una varicosidad axonal que establece un contacto sináptico simétrico con el perfil dendrítico. Los elementos inmunomarcados se pueden identificar fácilmente por su citoplasma o axoplasma lleno de precipitado DAB denso en electrones. Aquí, una dendrita inmunoteñida para la colina acetiltransferasa en el GPi recibe un contacto sináptico de una varicosidad axonal no marcada.

Esta micrografía electrónica muestra un axón mielinizado en el GPe con una vaina de mielina relativamente intacta cuyo axoplasma está inmunomarcado para la tirosina hidroxilasa. Este ejemplo muestra una varicosidad axonal en el GPi inmunomarcado para el transportador de serotonina que establece un contacto sináptico simétrico con una dendrita. En este ejemplo, el precipitado DAB recubre la membrana plasmática y la superficie exterior de los orgánulos.

La varicosidad axonal que se muestra aquí se observó en el GPe y se inmunizó para la tirosina hidroxilasa. Esto representa un ejemplo de precipitado de DAB que llena completamente el axoplasma, con vesículas sinápticas visibles pero más difíciles de delinear. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica doble previa a la inclusión, para responder a preguntas adicionales como las colocalizaciones de proteínas o receptores a nivel sináptico.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar la inmunohistoquímica previa a la inclusión de tejido cerebral de no primates, proceder a la inclusión en resina epoxi y ultracortar la región de interés en secciones de 80 micrómetros de espesor adecuadas para microscopía electrónica.