Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

El objetivo general de este experimento es obtener una inmunotinción previa a la inclusión confiable en tejido cerebral no primate para microscopía electrónica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroanatomía, como la incidencia sináptica de una inervación determinada en una estructura cerebral precisa. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un método sencillo y de bajo costo para etiquetar inervaciones específicas adecuadas para microscopía electrónica.

Comience transfiriendo secciones de 50 micrones de grosor de cerebro de primate no humano fijado con acroleína, que contengan la región de interés, a una placa de 12 pocillos que contenga PBS. Lave las secciones libres con tres cambios de PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego incube las secciones en una solución recién preparada de borohidruro de sodio durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agite suavemente sin tapar.

Una vez transcurridos los 30 minutos, aspire el borohidruro de sodio y agregue PBS a cada pocillo. Coloque la placa sobre un agitador y agite vigorosamente durante 10 minutos. Repita el lavado otras dos veces o hasta que no quede ningún residuo de gas de reacción.

Bloquee las secciones incubándolas en una solución de 2% de suero normal y 0,5% de gelatina fría de pescado diluida en PBS durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, incube las secciones en solución de anticuerpo primario con agitación suave durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, después de lavar las secciones como antes, incube las secciones en solución de anticuerpo secundario durante una hora y media a temperatura ambiente con agitación suave.

Después de lavar los cortes como antes, incubar en solución de avidina-biotina-peroxidasa o ABC durante una hora con agitación suave. A continuación, preparar una solución fresca de 3,3'-diaminobencidina al 0,05 % con peróxido de hidrógeno al 0,005 % diluido en TBS. Después del lavado, incubar los cortes en la solución de DAB durante tres a siete minutos con agitación suave.

Una vez que el precipitado marrón haya desarrollado el color deseado, detenga la reacción lavando rápidamente dos veces con TBS frío, seguido de una serie de lavados con TBS y PB con tiempos determinados. Transfiera la placa que contiene las secciones teñidas con DAB a la campana extractora. Transfiera las secciones a una placa de seis pocillos llena de PB y aplane completamente las secciones pipeteando cuidadosamente el PB fuera de la placa, luego agregue la solución de tetraóxido de osmio gota a gota para evitar perturbar las secciones aplanadas.

Cubra la placa con papel de aluminio para proteger las secciones de la luz e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Durante la osmificación, prepare una resina epoxi repelente al agua agregando cantidades adecuadas de cada componente de la mezcla de resina epoxi a un vaso plástico grande. Agite con un palillo de madera o una pipeta plástica hasta obtener un color marrón homogéneo, luego transfiera cantidades iguales de resina a vasos de aluminio del tamaño adecuado según el número de secciones que se procesarán y déjelos reposar.

Una vez finalizado el período de osmificación, lave los cortes tres veces en tampón fosfato durante 10 minutos con agitación suave. Tras el lavado, deshidrate los cortes en la siguiente serie de etanol graduado durante dos minutos cada uno. A continuación, transfiera los cortes a viales de vidrio llenos con óxido de propileno e incube en óxido de propileno tres veces durante dos minutos cada vez para completar el proceso de deshidratación.

Luego, transfiera cuidadosamente las secciones, una por una, a los recipientes de aluminio, evitando el contacto con el aire tanto como sea posible. Incruste las secciones en una resina epoxi hidrorrepelente previamente mezclada y colóquelas a incubar durante la noche bajo la campana extractora a temperatura ambiente. Al día siguiente, recubra portaobjetos de vidrio y cubreobjetos plásticos con aceite mineral, luego ablande la resina incubando los recipientes de aluminio a 60 grados Celsius durante 12 a 15 minutos como máximo.

Aplane cuidadosamente las secciones sobre el lado engrasado del portaobjetos de vidrio. Coloque el cubreobjetos engrasado y retire con cuidado cualquier aire residual. Incube los portaobjetos a 60 grados Celsius durante 48 horas.

Después de 48 horas, retire la cubierta de plástico, dejando la sección incrustada en resina. Comience utilizando un binocular para localizar la región de interés y luego use un escalpelo para cortar un pequeño trozo cuadrangular de tejido de aproximadamente un milímetro cuadrado. A continuación, limé la punta de un bloque de resina y luego pegue el fragmento cuadrangular de tejido sobre ella.

Después de secar, coloque el bloque de resina en la platina del ultramicrotomo en posición vertical y use una cuchilla afilada para cortar gradualmente cada lado del bloque de resina y formar un trapecio con lados lisos. A continuación, coloque la platina en posición horizontal y gire el bloque hasta que el lado más largo del trapecio quede orientado hacia abajo. Coloque una herramienta de corte de diamante o un cuchillo de vidrio en el espacio designado.

Configure el ultramicrótomo para cortar secciones de 300 micrones a un milímetro por segundo. Ajuste el cuchillo para que sea verticalmente paralelo al trozo cuadrangular y para que muestre un ángulo horizontal muy pequeño de aproximadamente un grado, y recorte la superficie del trozo cuadrangular hasta que comience a aparecer el tejido. Ahora, cambie a un cuchillo de diamante ultra de 45 grados equipado con una embarcación llena de agua destilada para cortar secciones de 80 micrones de grosor.

Suavice las secciones pasando sobre ellas un trozo de papel absorbente impregnado en xilol sin tocar la superficie del agua, y recoja secciones seriadas sobre rejillas de cobre bare de 150 mallas. Coloque las rejillas en una caja de almacenamiento para rejillas, luego prepare una solución uno a uno de la solución stock de citrato de plomo y agua destilada y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrones. Cubra el vial con papel de aluminio para protegerlo de la luz.

Coloque cada rejilla sobre una gota de la solución diluida de citrato de plomo, con la sección en contacto con la solución. Luego, use pinzas pequeñas para sostener la rejilla y enjuáguela completamente en dos vasos que contengan agua destilada. Retire suavemente el exceso de agua con papel absorbente y coloque las rejillas en una caja para rejillas. Después de 30 minutos, las secciones pueden examinarse mediante microscopía electrónica de transmisión.

Esta micrografía electrónica del globo pálido interno del mono ardilla muestra material bien conservado tras la perfusión transcardíaca con acroleína-PFA en la técnica de inmunoperoxidasa con diaminobencidina. Como se observa, el procedimiento permite visualizar la vaina de mielina de un axón grande, indicada por la punta de flecha. Esta micrografía electrónica del globo pálido externo demuestra que es fácil identificar perfiles dendríticos, indicados con la letra d, pequeños axones no mielinizados, indicados con a, y varicosidades axónicas, etiquetadas como av.

Las flechas muestran un ejemplo de una varicosidad axónica estableciendo un contacto sináptico simétrico con el perfil dendrítico. Los elementos inmunomarcados pueden identificarse fácilmente por su citoplasma o axoplasma llenos de precipitado electrondenso de DAB. Aquí, una dendrita inmunotincionada para colina acetiltransferasa en la GPi recibe un contacto sináptico proveniente de una varicosidad axónica no marcada.

Esta micrografía electrónica muestra un axón mielinizado en el GPe con una vaina de mielina relativamente intacta cuyo axoplasma está inmunomarcado para tirosina hidroxilasa. Este ejemplo muestra una varicosidad axónica en el GPi inmunomarcada para el transportador de serotonina que establece un contacto sináptico simétrico con una dendrita. En este ejemplo, el precipitado de DAB delinea la membrana plasmática y la superficie externa de los orgánulos.

La varicosidad axónica mostrada aquí se observó en la GPe y se inmunomarcó para tirosina hidroxilasa. Este caso representa un ejemplo de precipitado de DAB que llena completamente el axoplasma, con vesículas sinápticas visibles pero más difíciles de delimitar. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como inmunohistoquímica doble con preinclusión, para responder preguntas adicionales, como la colocalización de proteínas o receptores a nivel sináptico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar la inmunohistoquímica previa al inclusión de tejido cerebral no primate, proceder a la inclusión en resina epoxi y ultraseccionar la región de interés en cortes de 80 micrómetros de grosor adecuados para microscopía electrónica.