Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas
23 de marzo de 2017
Aquí, se muestra cómo analizar enrutamiento dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas. El flujo de trabajo incluye una visualización dual técnica de imagen para mejorar la calidad de imagen y herramientas computacionales para el seguimiento, el registro de los cenadores dendríticas en la matriz de la columna de referencia y para el análisis de las estructuras dendríticas en el espacio 3D.
El objetivo general de este protocolo es analizar el enrutamiento dendrico de las neuronas adultas de Drosophila medulla en columnas y capas para caracterizar patrones dendricos, determinar los tipos de células en función de la morfología e identificar mutantes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, incluido el mapeo de los circuitos cerebrales y la comprensión del mecanismo de cableado de la dendrita. La principal ventaja de esta técnica es que transmite las propiedades dendríticas en el espacio tridimensional, mejorando así la comprensión de la lógica y las funciones del cableado dendrítico.
El objetivo de este procedimiento es adquirir dos pilas de imágenes de las neuronas de interés en dos orientaciones ortogonal, horizontal y frontal. Usando las técnicas estándar, se tiñeron cerebros de mosca disecados con anti-GFP de conejo y un anticuerpo que marca los axones fotorreceptores como anticuerpos primarios. A continuación, etiquete los anticuerpos primarios con anticuerpos secundarios fluorescentes y limpie el cerebro con glicerol al 70% y PBS 1X.
Para montar el cerebro en la orientación horizontal, transfiera un cerebro aclarado con glicerol a una gota de 20 microlitros de medio de montaje antidesvanecimiento depositado centralmente en el portaobjetos del microscopio. Luego, en un cubreobjetos, coloque pequeños parches de arcilla en las cuatro esquinas para evitar que el cubreobjetos aplaste el cerebro. Ahora, bajo un microscopio de disección, coloque los cerebros en la posición ventral hacia arriba.
Utilice la superficie dorsal convexa del cerebro como punto de referencia para identificar la orientación de la muestra de cerebro. Esto proporcionará una vista horizontal de la neurona. A continuación, coloque el cubreobjetos.
Utilizando un microscopio confocal, idealmente equipado con detectores GaAsP, obtenga la pila de imágenes de vista horizontal con un objetivo de alta apertura numérica y un zoom digital de 2,5. Adquiera al menos 180 secciones ópticas, tenga 512 píxeles cuadrados y un tamaño de paso de 2 micras. Después de tomar la primera pila de imágenes, retire el cubreobjetos del portaobjetos y vuelva a colocar el cerebro en la posición anterior hacia arriba, lo que proporciona una vista frontal.
Luego, usando la misma técnica, haga una nueva pila de imágenes de la vista frontal de las mismas neuronas fotografiadas en la vista horizontal. Asegúrese de registrar también la ubicación de la neurona de interés con respecto a la médula neuropal. La identificación de las mismas neuronas es factible con un aumento menor.
Sin embargo, si se pierde la señal porque el tejido es profundo, simplemente imagine la mitad ventral de su cerebro. Compruebe también si la muestra se movió mientras adquiría imágenes examinando las pilas de imágenes. La convolución de imágenes y la combinación de imágenes se detallan en el protocolo de texto.
El objetivo de este procedimiento es rastrear las neuritas y asignar puntos de referencia para su registro. Primero abra el archivo de imagen recombinado. A continuación, vaya a editar.
A continuación, muestre el ajuste de la pantalla y apague el canal fotorreceptor, que es rojo. A continuación, visualice la imagen en el modo de superación. Si el ordenador está equipado con un sistema de estereografía, encienda el estéreo y utilice el modo de búfer cuádruple para visualizar imágenes en 3D.
Agregue nuevos filamentos, vaya a superar, luego filamentos, y haga clic en la pestaña etiquetada omitir la creación automática, editar manualmente. A continuación, haga clic en la pestaña de dibujo y seleccione AutoDepth. A continuación, seleccione configuración.
Cambie la opción de línea e ingrese el número de píxel apropiado para una mejor visualización. Luego, alterne mostrar dendritas, punto de inicio y punto de ramificación, y establezca la calidad de renderizado en 100%Ahora seleccione la pestaña de dibujo y comience a trazar neuritas. Comience con el axón, luego pase a las dendritas.
El axón y las dendritas de las neuronas trans de la médula deben ser fáciles de diferenciar. Después de trazar las neuritas, vuelva a la configuración y desactive el punto de inicio y el punto de ramificación. A continuación, vaya a superar, luego a exportar.
Seleccione el objeto y guarde el filamento como un archivo de inventor. El siguiente paso es asignar puntos de referencia. Para comenzar, seleccione Mostrar ajuste de pantalla y active ambos canales de imagen.
Luego vaya a superar, luego a medir. Y en la pestaña de edición, alterne un canal específico y seleccione el canal fotorreceptor en este caso. Ahora asigne puntos de referencia para la capa superior.
Seleccione superar, luego puntos de medición y marque el comienzo de la capa m1 como capa superior. Utilice la función de plano de recorte para facilitar la asignación de puntos. El orden de los puntos es ecuatorial, ecuatorial anterior, anterior, ventral anterior, ventral, ventral posterior, posterior, ecuatorial posterior y centro.
Para encontrar el fotorreceptor central, es el que se asocia con la mayoría de los procesos dendríticos. A continuación, asigne los puntos de referencia para las capas R8 y R7 utilizando la misma técnica. Después de definir cada conjunto de puntos de referencia, exporte las coordenadas.
Seleccione estadísticas y, a continuación, valores detallados y específicos, y posición. A continuación, seleccione exportar estadísticas en la visualización de pestañas a archivo y guarde las coordenadas como un archivo CSV. A continuación, abra los tres archivos CSV en un editor de hojas de cálculo.
Copie y pegue las coordenadas de los 27 puntos de referencia en un nuevo archivo, siguiendo el orden de arriba, R8 y, a continuación, R7. Proceda siguiendo el protocolo de texto para la estandarización del registro no lineal de cuerpo rígido y TPS para la configuración ventral derecha en el cálculo de las frecuencias de ramificación y terminación dendríticas. En última instancia, los datos se utilizan para realizar diversas parcelas informativas. Utilizando el procedimiento de imagen de doble vista que se presenta aquí, se obtuvo una imagen de un cerebro de mosca que contenía neuronas tm 20 escasamente marcadas en dos direcciones ortogonales.
La recombinación de imágenes mejora la resolución axial. La imagen recombinada tiene una mejor resolución que las de las imágenes de vista horizontal y frontal. Después de consultar modelos 3D, se recogieron trazas dendríticas de 15 tm 20 neuronas y se compararon con trazas dendríticas de 15 tm 2 neuronas.
Se analizaron las probabilidades de ramificación y terminación de estas neuronas. Ambos tipos fueron similares para segmentos de menos de 4 micras. El análisis específico de la capa de la terminación dendrítica mostró que los dos tipos de neuronas se distribuyen de maneras distintas y específicas de la capa.
Las dendritas Tm 2 reciben entradas en m2 y en m5. Mientras que las dendritas tm 20 terminan en la capa m1 a m3. El análisis planar muestra que las dendritas tm 2 se proyectan hacia atrás, mientras que las dendritas tm 20 se proyectan hacia atrás.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo adquirir dos de sus imágenes confocales. Lea las marcas de estudio en los archivos de imágenes y extraiga las propiedades dendríticas de estas imágenes. Al intentar este procedimiento, es importante marcar la muestra correctamente antes de la obtención de imágenes confocal.
Ya que la combinación de imágenes fallará si la muestra se mueve durante la toma de imágenes.
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Resumen
Este protocolo describe un método para analizar la distribución dendrítica de neuronas de la médula de Drosophila adulta en columnas y capas. Utiliza técnicas de imagenología de doble vista y herramientas computacionales para mejorar la calidad de las imágenes y analizar las estructuras dendríticas en el espacio tridimensional.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neuroanatomía
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- La ruta dendrítica es fundamental para comprender la circuitría cerebral.
- La caracterización de los patrones dendríticos ayuda a determinar los tipos celulares.
- La identificación de mutantes puede proporcionar información sobre la función neuronal.
- El análisis 3D mejora la comprensión de la lógica del cableado dendrítico.
Objetivo del estudio
- Analizar la ruta dendrítica en neuronas de la medula de Drosophila.
- Caracterizar los patrones dendríticos y determinar los tipos celulares.
- Identificar mutantes que afecten la morfología dendrítica.
Métodos Utilizados
- Adquirir dos pilas de imágenes de neuronas en orientaciones ortogonales.
- Tincionar cerebros de mosca disecados con anticuerpos específicos.
- Etiquetar anticuerpos primarios con anticuerpos secundarios fluorescentes.
- Clarificar el cerebro utilizando glicerol y PBS para la obtención de imágenes.
Resultados principales
- Las técnicas de imagen mejoradas potencian el análisis de la estructura dendrítica.
- El mapeo 3D revela la compleja conectividad de las dendritas.
- Se logra la caracterización de tipos celulares basada en la morfología.
- La identificación de mutantes proporciona información sobre el desarrollo neural.
Conclusiones
- Este método mejora significativamente la comprensión de la ruta dendrítica.
- Facilita la cartografía de los circuitos cerebrales en Drosophila.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para aplicaciones más amplias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite un análisis tridimensional de alta resolución de la arquitectura dendrítica en circuitos neuronales definidos, lo que apoya la validación de objetivos en neurofarmacología al vincular fenotipos estructurales con perturbaciones genéticas. Al cuantificar la terminación específica por capas y la proyección planar de los arborizaciones dendríticas, proporciona una reducción mecanicista de riesgos para el descubrimiento de fármacos del sistema nervioso central mediante una mayor confianza predictiva en los modelos de circuitos neuronales. El flujo de trabajo facilita la identificación de defectos específicos del tipo celular, ayudando al alineamiento de biomarcadores traslacionales y al perfeccionamiento de modelos preclínicos para indicaciones neuropsiquiátricas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la correlación de la morfología dendrítica con manipulaciones genéticas o farmacológicas en subtipos neuronales definidos.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la evaluación cuantitativa de la ramificación dendrítica y las frecuencias de terminación como indicadores funcionales.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en el blanco al establecer relaciones entre estructura y función en circuitos de neuronas de la médula relevantes para vías neurodesarrollistas conservadas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera trazados dendríticos 3D estandarizados y reproducibles registrados en un marco columnar de referencia para una puntuación morfológica consistente.
- Salida cuantitativa: Proporciona frecuencias de terminación específicas por capa y métricas de proyección plana que permiten un análisis de alto contenido del patrón dendrítico.
- Utilidad de la plataforma: Utiliza cajas de herramientas de código abierto para MIPAV y MATLAB, lo que favorece la escalabilidad y la reproducibilidad entre laboratorios en campañas de cribado enfocadas en neuroanatomía.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Asocia defectos dendríticos con capas específicas (por ejemplo, m1–m3 para tm20 frente a m2/m5 para tm2), permitiendo la correlación con biomarcadores traslacionales de disfunción circuital.
- Continuidad preclínica: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar mutantes genéticos que afectan la conectividad neuronal, apoyando decisiones de avance ajustadas al riesgo.
- Reducción del riesgo mecanicista: Clarifica los defectos en la lógica de conectividad en modelos de neurodesarrollo, reduciendo la ambigüedad en estudios de interacción con el objetivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al convertir datos de imágenes en características dendríticas cuantificables que informan las etapas de identificación del fármaco líder y validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el trazado dendrítico 3D y el análisis específico por capas para aclarar la identidad neuronal y la lógica de los circuitos.
- Tamizaje: Permite la estandarización de ensayos mediante el registro basado en referencias y el trazado automatizado de arborizaciones dendríticas en diferentes fondos genéticos.
- Análisis: Obtiene frecuencias de ramificación y terminación como medidas cuantitativas para comparar condiciones en análisis de mutantes frente a tipo silvestre.
- Investigación Traducional: Relaciona las preferencias por capas dendríticas con posibles homólogos en la corteza de vertebrados, apoyando la continuidad traducional entre especies.
- Reutilización Empresarial: Establece una tubería de imágenes y análisis reutilizable para la fenotipificación sistemática de mutantes neuronales en programas de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la fenotipificación neuronal al proporcionar datos de arquitectura dendrítica con resolución espacial.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la recombinación de imágenes de doble vista y la asignación estandarizada de puntos de referencia a través de las capas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la estratificación objetiva de subtipos neuronales basada en la morfología.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de objetivos basándose en la fidelidad estructural de los modelos dendríticos en sistemas relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía confocal, registro de imágenes 3D y análisis de la morfología neuronal.
- Depende de objetivos de alta apertura numérica (NA), detectores GaAsP y plataformas computacionales que soporten el rastreo basado en MIPAV y MATLAB.
- Necesita una estandarización entre equipos para lograr protocolos consistentes de tinción, aclarado y adquisición de imágenes en diferentes laboratorios.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir modificaciones en los marcos de referencia y en las definiciones de capas.
- Las limitaciones prácticas incluyen la pérdida de señal en tejidos profundos y la sensibilidad al movimiento de la muestra durante la adquisición de doble vista.
