Name: Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a analizar la morfología dendrítica en neuronas de Drosophila medulla mediante imágenes de doble vista y herramientas computacionales en 3D. Este método avanza el mapeo de circuitos cerebrales.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano (subvención HD008913 a C-HL), y el Centro de Tecnología de la Información (PGM, NP, ESM y MM).

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<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor-derived+activin+promotes+dendritic+termination+and+restricts+the+receptive+fields+of+first-order+interneurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila.</a> Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+R7+axons+in+the+Drosophila+visual+system+is+mediated+both+by+transduction+of+an+activin+signal+to+the+nucleus+and+by+mutual+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion.</a> Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).</li>
<li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).</li>
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<li>Takemura, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+circuits+integrate+neighboring+visual+signals+in+a+Drosophila+motion+detection+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway.</a> Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li>
<li>Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+NeuronJ+tracing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of NeuronJ tracing data.</a> Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
<li>Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Measure%3A+a+web-accessible+tool+for+the+analysis%2C+comparison+and+search+of+digital+reconstructions+of+neuronal+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies.</a> Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+Estimation+from+Incomplete+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22JASA%22%5BJournal%5D)">Nonparametric Estimation from Incomplete Observations.</a> JASA. 53, 457-481 (1958).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se muestra cómo reproducir y analizar los árboles dendríticos de neuronas medulares de Drosophila. En la primera sección, de doble punto de vista de imagen, se describe la deconvolución y la combinación de dos pilas de imágenes en una pila de imágenes de alta resolución. La segunda sección, el trazado de las dendritas y el registro, se describe el rastreo y registro de las dendritas de las neuronas medulares en la matriz de la columna de referencia. En la tercera sección, el análisis dendríticas, describe...

Durante el desarrollo, las neuronas dendritas elaboradas en los patrones complejos ramificados, pero estereotipados para formar sinapsis con sus socios presináptica. patrones de ramificación dendríticas se correlacionan con la identidad y las funciones neuronales. Las ubicaciones de los cenadores dendríticas determinan el tipo de entradas presinápticos que reciben, mientras que la ramificación dendrítica de complejidad y de campo tamaños gobiernan el número de entrada. Por lo tanto, las propiedades morfológicas dendríticas son elementos indispensables para la conectividad sináptica y la computación neuronal. En muchas regiones del cerebro complejos, tales como los lóbulos ópticos de la mosca y la retina de los vertebrados, los circuitos sinápticos están organizados en columnas y capas para facilitar el procesamiento de información 1, 2. En una organización tan columna y capa, las neuronas presinápticas de un axones distintos proyectos modalidad para terminar en una capa específica (denominada orientación-capa específica) y para formar una matriz bidimensional ordenada (la called mapa topográfico), mientras que las neuronas postsinápticas se extienden dendritas de tamaños apropiados en capas específicas para recibir aportes presinápticas de los tipos y números correctos. Si bien la orientación axonal a las capas y columnas ha sido bien estudiado 3, 4, se sabe mucho menos acerca de cómo dendritas se encaminan a capas específicas y ampliar adecuadamente dimensionados campos receptivos para formar conexiones sinápticas con los socios correctos presináptica 5. La dificultad de formación de imágenes y la cuantificación de la orientación dendrítica de capas y columnas ha dificultado el estudio del desarrollo dendrítico en las estructuras cerebrales columnares y laminados. Drosophila neuronas médula son un modelo ideal para el estudio de enrutamiento dendríticas y ensamblaje de circuitos en las columnas y capas. El neurópila mosca médula está organizada como una celosía en 3D de 10 capas y aproximadamente 750 columnas. Cada columna está inervado por un conjunto de fibras aferentes, incluyendo photoreceptors R7 / R8 y neuronas de la lámina L1 - L5, cuyos terminales axonal formar mapas topográficos de una manera específica de la capa 6. Alrededor de 38 tipos de neuronas medulares están presentes en cada columna de médula y dendritas elaboradas en capas específicas y con tamaños de los campos apropiados para recibir las aportaciones de estos aferentes 7. Los circuitos sinápticos en la médula se han reconstruido a nivel microscópico de electrones; por lo tanto, las asociaciones sinápticas están bien establecidos 7, 8. Además, herramientas genéticas para el etiquetado de diferentes tipos de neuronas médula están disponibles 9, 10, 11. Mediante el examen de tres tipos de transmedulla (TM), las neuronas (TM2, TM9 y TM20), hemos identificado previamente dos atributos de tipo celular específico dendríticas: (i) las neuronas se proyectan Tm dendritas, ya sea en la dirección anterior o posterior (proy planadirección reflexión), dependiendo de los tipos de células y (ii) dendritas de las neuronas médula terminar en capas médula específicos de una forma de células de tipo específico (terminación de capa específica) 12. Planar dirección de proyección y la terminación de capa específica son suficientes para diferenciar estos tres tipos de neuronas Tm, mientras que las mutaciones que alteran las respuestas de Tm a capa y columnas señales afectan a distintos aspectos de estos atributos. A continuación, presentamos un flujo de trabajo completo para el examen de los patrones dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas (Figura 1). En primer lugar, se muestra un método de imagen de doble vista, que utiliza software personalizado para combinar dos imagen confocal pilas para generar imágenes isotrópicas de alta calidad. Este método requiere solamente la microscopía confocal convencional para generar imágenes de alta calidad que permitan el rastreo fiable de ramas dendríticas, sin recurrir a la super-resolución microscopía, como unas STED (emisión estimulada agotamiento) o iluminación estructural. En segundo lugar, se presenta un método para el seguimiento de los cenadores dendríticas y para el registro de las huellas resultantes de neuritas a una matriz columna de referencia. En tercer lugar, se muestran los métodos computacionales para la extracción de información en la dirección de proyección planar y la terminación de la capa específica de dendritas, así como para derivar estimaciones de ramificación y de terminación de frecuencias dendríticas. Juntos, estos métodos permiten la caracterización de patrones dendríticas en 3D, la clasificación de los tipos de células sobre la base de morfologías dendríticas, y la identificación de posibles defectos en los mutantes.

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens</td><td>Professional Scientific Volume Imaging</td><td>versión 16.05</td><td>para la deconvolución de imágenes (https://svi.nl).&nbsp; software comercial</td></tr><tr><td>MIPAV</td><td></td><td>versión 7.3.0</td><td>para la recombinación y registro de imágenes (http://mipav.cit.nih.gov/);</td></tr><tr><td>plugin MIPAV gratuito: PlugInDrosophila Complemento MIPAV gratuito RetinalRegistration.class</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class</td><td></td><td></td> software <td>gratuito</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>para el seguimiento de neuritas y la asignación de puntos de referencia para el registro de imágenes (http://www.bitplane.com); software comercial</td></tr><tr><td>Vaa3D</td><td></td><td></td><td>para visualizar archivos swc ( https://github.com/Vaa3D/release/releases/); software gratuito</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2014b</td><td>para el análisis morfométrico de dendritas (http://www.mathworks.com); software comercial</td></tr><tr><td>Matlab toolbox: TREES1.14</td><td></td><td>v1.14</td><td>para analizar parámetros morfométricos dendríticos (http://www.treestoolbox.org/download.html); software gratuito</td></tr><tr><td>Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox</td><td></td><td>v1.0</td><td>Para el cálculo de parámetros morfométricos (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Sample files</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWC definición</td><td></td><td></td><td>de archivo http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html</td></tr><tr><td>Los códigos y los archivos de muestra para la combinación de imágenes y el registro</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration</td></tr><tr><td>Ejemplo de punto de referencia&nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sistema informático</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Windows Windows 7 x64 o Macintosh OS X 10.7 o posterior</td><td></td><td></td><td>Procesador de cuatro núcleos de 3 GHz y 64 bits, 16 G de RAM (mínimo)</td></tr><tr><td>Opcional: Quadro4000&nbsp; (o superior) tarjeta gráfica</td><td>Nvidia</td><td></td><td>para la visualización estereográfica de dendritas.</td></tr><tr><td>Opcional: NVIDIA 3D vision2</td><td>Nvidia</td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html</td></tr><tr><td>Opcional: Pantalla LCD de 120 Hz para NVIDIA 3D vision2</td><td></td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</ strong</td></tr><tr><td>>Reactivos para la imagen</anticuerpo fuerte></td>24B10 Los Estudios del Desarrollo Banco de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hibridoma</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Anticuerpo</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Ratón (H+L), Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A21124</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montaje Medio Vectorial</td><td>Laboratorios</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Montaje&nbsp; Arcilla &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>S04179</td><td></td></tr><tr><td>70% de glicerol en 1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass, alto rendimiento, D = 0,17&nbsp; mm</td><td>Zeiss</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr></tbody></table>

analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

En muchas regiones del sistema nervioso central, tales como los lóbulos ópticos de la mosca y la corteza de los vertebrados, los circuitos sinápticos se organizan en capas y columnas para facilitar el cableado del cerebro durante el desarrollo y tratamiento de la información en los animales desarrollados. las neuronas postsinápticas dendritas elaboradas en los patrones específicos de tipo en capas específicas que hacen sinapsis con las terminales presinápticas apropiadas. El neurópila mosca médula se compone de 10 capas y alrededor de 750 columnas; cada columna está inervado por las dendritas de más de 38 tipos de neuronas medulares, que responden a las terminales axonales de unos 7 tipos de aferentes de una manera específica del tipo. Este informe detalla los procedimientos para analizar la imagen y dendritas de las neuronas medulares. El flujo de trabajo incluye tres secciones: (i) la sección de formación de imágenes de doble vista combina dos pilas de imágenes confocal recogidos en las orientaciones ortogonales una imagen en 3D de alta resolución de las dendritas en; (Ii) la dendrita rastreo y registro de huellas sección dendríticascenadores en 3D y los registros de huellas dendríticas en la matriz de la columna de referencia; (Iii) la sección de análisis dendríticas analiza los patrones dendríticas con respecto a las columnas y capas, incluyendo la terminación y la proyección plana dirección de capa específica de cenadores dendríticas, y calcula las estimaciones de ramificación y de terminación de frecuencias dendríticas. Los protocolos utilizan plugins personalizados construidos en la MIPAV de código abierto (Procesamiento de Imágenes Médicas, análisis y visualización) cajas de herramientas personalizadas de la plataforma y en el idioma de laboratorio matriz. En conjunto, estos protocolos proporcionan un flujo de trabajo completo para analizar el enrutamiento dendríticas de Drosophila neuronas médula en capas y columnas, para identificar tipos de células, y para determinar defectos en los mutantes.

Uso de la vista de doble procedimiento de imagen que se presenta aquí, un cerebro de la mosca que contiene neuronas TM20 escasamente etiquetados fue fotografiada en dos direcciones ortogonales. Antes de la formación de imágenes, el cerebro se tiñeron con anticuerpos primarios y secundarios adecuados para la visualización de GFP y fotorreceptoras axones membrana anclada. Para formación de imágenes, el cerebro se montó primero en la orientación horizontal (Figura 2A, B). U...

Aquí, se muestra cómo analizar enrutamiento dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas. El flujo de trabajo incluye una visualización dual técnica de imagen para mejorar la calidad de imagen y herramientas computacionales para el seguimiento, el registro de los cenadores dendríticas en la matriz de la columna de referencia y para el análisis de las estructuras dendríticas en el espacio 3D.

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

El objetivo general de este protocolo es analizar la distribución dendrítica de las neuronas de la medula de Drosophila adulta en columnas y capas, con el fin de caracterizar los patrones dendríticos, determinar los tipos celulares según su morfología e identificar mutantes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la cartografía de los circuitos cerebrales y la comprensión del mecanismo de conexión de las dendritas. La principal ventaja de esta técnica es que conserva las propiedades dendríticas en el espacio tridimensional, mejorando así la comprensión de la lógica y las funciones del cableado dendrítico.El objetivo de este procedimiento es obtener dos pilas de imágenes de las neuronas de interés en dos orientaciones ortogonales, horizontales y frontales. Utilizando técnicas estándar, tiña cerebros de mosca disecados con anticuerpo primario de conejo anti-GFP y un anticuerpo que marca los axones de los fotorreceptores. Luego, etiquete los anticuerpos primarios con anticuerpos secundarios fluorescentes y aclare el cerebro en glicerol al 70 % y PBS 1X.Para montar el cerebro en orientación horizontal, transfiera un cerebro clarificado

analyzing-dendritic-morphology-in-columns-and-layers

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Numerosos estudios recientes han identificado mutaciones en las proteínas sinápticas asociadas a patologías cerebrales. Primaria neuronas corticales cultivadas ofrecen una gran flexibilidad en el examen de los efectos de estas proteínas asociadas a la enfermedad en la morfología y motilidad de la espina dendrítica.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Arborización dendrítica de las neuronas sensoriales de...

Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

Se presenta un protocolo que permite ver y para evaluar cuantitativamente la morfología del árbol dendrítico de las células de Purkinje individuales cultivadas en cultivos de cortes organotípicos cerebelosos. Este protocolo tiene como objetivo promover estudios sobre los mecanismos de desarrollo de Purkinje células dendríticas.

El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos

Fuente: Ting, C., et al., Análisis de la morfología dendrítica en columnas y capas. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra el procedimiento de preparación de un cerebro de Drosophila, capturando pilas de imágenes horizontales y frontales de dendritas medulares marcadas con GFP bajo un microscopio confocal y creando una reconstrucción 3D para analizar su morfología en capas y columnas.

Análisis de la morfología dendrítica en capas y columnas de Drosophila Medulla

Describimos dos métodos para la visualización y cuantificación de la arborización dendrítica en el hipocampo de modelos de ratón: imágenes en tiempo real y de profundidad de campo extendida. Mientras que el primer método permite un sofisticado trazado topográfico y la cuantificación de la extensión de la ramificación, el segundo permite una visualización rápida del árbol dendrítico.

Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Aquí presentamos un protocolo de Golgi-Cox en detalle extenso. Este método fiable de tinción de tejidos permite una evaluación de alta calidad de la citoarquitectura en el hipocampo, ya lo largo de todo el cerebro, con un mínimo de resolución de problemas.

Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox

Este protocolo se centra en el análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila, que puede ser utilizado para estudios de morfogénesis dendríticas.

Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila

Presentamos un protocolo para etiquetar y analizar las neuronas piramidales, que es fundamental para evaluar posibles alteraciones morfológicas en neuronas y espinas dendríticas que pueden subyacen a anomalías neuroquímicas y conductuales.

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

La morfología dendrítica neuronal a menudo subyace a la función. De hecho, muchos procesos de enfermedad que afectan el desarrollo de las neuronas se manifiestan con un fenotipo morfológico. Este protocolo describe un método simple y poderoso para analizar cenadores dendríticos intactos y sus espinas asociadas.

Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas a través de CLARITY Tissue Clearing

Presented es una herramienta computacional que permite la medición automática simple y directa de las orientaciones de las ramas dendríticas neuronales a partir de imágenes de fluorescencia 2D.

Identificación automática de ramas dendríticas y su orientación

Las espinas dendríticas son compartimentos postsinápticos de la mayoría de las sinapsis excitatorias. Las alteraciones en la morfología de la espina dendrítica ocurren durante el neurodesarrollo, el envejecimiento, el aprendizaje y muchos trastornos neurológicos y psiquiátricos, lo que subraya la importancia de un análisis confiable de la columna dendrítica. Este protocolo describe la cuantificación de la morfología de la espina dendrítica de forma precisa y reproducible utilizando un software...

Cuantificación de la columna dendrítica mediante un software automático de reconstrucción de neuronas tridimensional

Aprende a analizar la morfología dendrítica en neuronas de Drosophila medulla mediante imágenes de doble vista y herramientas computacionales en 3D. Este método avanza el mapeo de circuitos cerebrales.

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

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