El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

El objetivo general de este experimento consiste en fabricar un dispositivo microfluídico especializado y utilizarlo para medir la longevidad y los fenotipos celulares de una sola célula de levadura. Este método puede ayudar a responder algunas preguntas clave en el campo del envejecimiento de levaduras, como por qué las células madre envejecen y mueren, y cuáles son los primeros eventos moleculares que impulsan la pérdida de la homeostasis celular y, eventualmente, el envejecimiento y la muerte celular. La principal ventaja de esta técnica es que podemos rastrear las células madre, su longevidad y diversos marcadores moleculares al mismo tiempo, lo que nos permite identificar eventos moleculares que se correlacionan con la longevidad.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el envejecimiento de levaduras, también puede aplicarse a otras áreas, como el monitoreo de respuestas secundarias a la participación que requiere verificación celular durante muchas generaciones. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la fabricación de dispositivos microfluídicos, la carga de células y la configuración del microscopio requieren mucha práctica para realizarse con éxito. Una demostración previa de este método es fundamental, ya que resulta difícil cargar adecuadamente el dispositivo microfluídico con levaduras.

Para comenzar, fabrique un molde de oblea de silicio para el dispositivo utilizando técnicas estándar, como se describe en el protocolo de texto adjunto. Colóquelo con la cara estructurada hacia arriba en una placa de Petri de 15 centímetros. Sujete el molde sobre la placa de Petri con cinta adhesiva.

A continuación, coloque un recipiente de pesaje limpio sobre una balanza y taree la balanza. Vierta 50 gramos de la base de PDMS en el recipiente de pesaje y luego agregue cinco gramos del agente de curado de PDMS. Mezcle la base de PDMS y el agente de curado con una pipeta desechable.

Comience desde el borde del recipiente de pesado y muévase lentamente hacia el interior. Mezcle bien durante varios minutos hasta que se formen pequeñas burbujas en toda la mezcla. Vierta lentamente la mezcla en la placa de Petri, de modo que cubra completamente el molde de oblea de silicio.

Luego, coloque la placa de Petri en vacío durante 10 minutos para eliminar todas las burbujas de aire de la mezcla de PDMS. Si quedan burbujas en la superficie de la mezcla una vez retirada del vacío, utilice una pipeta para expulsarlas. A continuación, hornee el dispositivo a 75 grados Celsius durante dos horas.

Una vez enfriado nuevamente a temperatura ambiente, corte cuidadosamente a través del PDMS alrededor del molde y luego desprenda suavemente la capa de PDMS polimerizado del molde de oblea de silicio, evitando cualquier daño a la estructura del molde. Coloque la capa de PDMS sobre la mesa con el lado del patrón hacia arriba. Corte cuidadosamente cada chip individual con una cuchilla industrial de filo único, dejando un margen adecuado desde el borde de cada chip para evitar dañar la estructura.

Con el lado del patrón hacia arriba, utilice un punzón para perforar agujeros directamente hacia abajo a través de los círculos de entrada y salida en cada lado de los canales. Verifique cada agujero insertando nuevamente la aguja del punzón en el orificio. Asegúrese de que la aguja pueda salir por el otro lado, lo que indica que no hay obstrucciones.

A continuación, use la cinta para eliminar partículas de polvo y residuos de la superficie superior. Repita este paso al menos tres veces y deje un trozo limpio de cinta adhesiva Scotch sobre el PDMS para mantener una superficie libre de polvo. Luego, gire el dispositivo y repita este procedimiento en la cara opuesta del PDMS.

Deje también el último trozo de cinta adhesiva en este lado. Ahora prepare una superficie de vidrio para la base del dispositivo. Seleccione el trozo de cubreobjetos de 24 milímetros por 30 milímetros con un espesor entre 13 y 17 milímetros.

Rocíe etanol al 70 % sobre el vidrio y séquelo con un eliminador de polvo para esterilizar la superficie. Luego, transfiera el cubreobjetos y el PDMS a una placa de plástico. Retire la cinta adhesiva del PDMS y coloque el lado del patrón hacia arriba en la placa, sin tocar la superficie superior.

Luego, transfiera la placa a una cámara de plasma. Aplique un tratamiento con plasma de oxígeno al PDMS y al cubreobjetos para hacer las superficies hidrofílicas. A continuación, retire la placa de la cámara de plasma y conecte cuidadosamente las superficies tratadas con plasma del PDMS al cubreobjetos.

Asegúrese de que no haya burbujas de aire entre el PDMS y el vidrio de cubierta. Finalmente, transfiera el dispositivo a un horno y caliente a 75 grados Celsius durante al menos dos horas. Sumerja los tubos de entrada y salida en una solución de etanol al 70 % un día antes de la preparación del chip de PDMS.

Al día siguiente, llene una jeringa de cinco mililitros con agua autoclavada y lave cada tubo colocando el tubo sobre la jeringa y enjuagándolo con agua. Repita el paso de lavado al menos tres veces para eliminar el etanol residual. A continuación, examine los canales de PDMS bajo un microscopio óptico.

Utilizando un objetivo de 10 X, asegúrese de que las estructuras sean consistentes e intactas. Estabilice el chip de PDMS intacto sobre la plataforma del microscopio utilizando cinta adhesiva Scotch. Sujete una jeringa de cinco mililitros cargada con agua estéril a una bomba de jeringa e inserte los tubos de entrada y salida correspondientes en el dispositivo.

Establezca el caudal en 750 microlitros por hora y enjuague el chip durante aproximadamente 10 minutos. Observe los canales para asegurarse de que todas las burbujas de aire sean eliminadas. Si después del enjuague de 10 minutos quedan burbujas, ajuste manualmente la velocidad para eliminarlas.

Transfiera un mililitro de una muestra de levadura preparada a dos tubos de microcentrifugado de 1,5 mililitros y centrifugue las muestras durante cinco minutos a 3.000 × g. Retire la mayor parte del sobrenadante de cada tubo y combine los restos para formar una muestra de 5 mililitros. Con la muestra de levadura ya lista, retire los tubos de entrada del chip de PDMS. Invierta manualmente la bomba de jeringa para aspirar una pequeña burbuja de aire de uno a dos centímetros de longitud en cada tubo de entrada y luego aspire los cultivos celulares.

Luego, inserte el tubo de entrada nuevamente en el chip de PDMS y reinicie la bomba para cargar las células a una velocidad de 750 microlitros por hora. Deje la bomba de jeringa encendida durante 10 minutos y luego examine el progreso de la carga celular bajo el microscopio. Una carga exitosa atrapará células bajo más del 60 % de los pilares de suspensión.

Para mantener las células de levadura, cambie la solución en la jeringa a una solución nutritiva y ajuste la velocidad a 400 microlitros por hora. El fenotipo de longevidad de la levadura se puede obtener contando el número de brotes producidos por cada célula madre atrapada y estimando el estimador de Kaplan-Meier. Mediante este protocolo, el dispositivo atrapa frecuentemente células hijas nuevas que brotaron de las células ya atrapadas.

Estas células luego se convierten en nuevas células madre que pueden identificarse mediante software de análisis de imágenes posterior. Estas nuevas células madre proporcionan una medición de longevidad más precisa. En este experimento, la longevidad promedio de las nuevas células madre fue ligeramente mayor, aproximadamente en dos generaciones.

Además del número de brotes, se puede extraer de los datos de imagen el intervalo de tiempo entre dos eventos sucesivos de brotación. La formación de brotes se ralentiza considerablemente hacia el final de su vida útil, lo que indica el estado no saludable de estas células envejecidas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar siempre un chip recién preparado para ayudar a evitar la formación de burbujas, y aumentar la concentración de células con el fin de mejorar la eficiencia de carga celular cuando sea necesario.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del envejecimiento de la levadura exploraran los primeros cambios moleculares que son causales del fenotipo de envejecimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar este dispositivo microfluídico y de cómo utilizarlo para medir la longevidad y los fenotipos celulares en células individuales.