El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

El objetivo general de este experimento es fabricar un dispositivo microfluídico especializado y utilizarlo para medir la vida útil y los fenotipos celulares de una sola célula de levadura. Este método puede ayudar a responder algunas de las preguntas clave en el campo del envejecimiento de la levadura, como por qué las células madre envejecen y mueren y cuáles son los eventos moleculares anteriores que impulsan la pérdida de la homeostasis celular y, finalmente, el envejecimiento y la muerte celular. La principal ventaja de esta técnica es que podemos rastrear las células madre, rastrear su vida útil y los diversos marcadores moleculares al mismo tiempo, por lo que podemos buscar eventos moleculares que se correlacionen con la vida útil.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el envejecimiento de la levadura, también se puede aplicar a otras áreas, como el monitoreo de las respuestas secundarias a la participación que requiere el control celular durante muchas generaciones. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la fabricación de dispositivos microfluídicos, la carga de células y la configuración del microscopio requieren mucha práctica para funcionar con éxito. La demostración previa de este método es fundamental, ya que es difícil cargar correctamente el dispositivo microfluídico con levadura.

Para comenzar, fabrique un molde de oblea de silicio para el dispositivo utilizando técnicas estándar como se describe en el protocolo de texto adjunto. Colóquelo con la característica hacia arriba en una placa de Petri de 15 centímetros. Asegure el molde en la placa de Petri con cintas adhesivas.

A continuación, coloque un bote de pesaje limpio en una balanza y rompa la balanza. Vierta 50 gramos de base de PDMS en el bote de pesaje y luego agregue cinco gramos de agente de curado PDMS. Agite la base PDMS y el agente de curado con una pipeta desechable.

Comience desde el borde del bote de pesaje y muévase lentamente hacia adentro. Revuelva bien la mezcla durante varios minutos hasta que se formen pequeñas burbujas en toda la mezcla. Vierta la mezcla lentamente en la placa de Petri, de modo que cubra completamente el molde de oblea de silicona.

A continuación, coloque la placa de Petri en el vacío durante 10 minutos para eliminar todas las burbujas de aire de la mezcla de PDMS. Si quedan burbujas en la superficie de la mezcla, una vez retiradas de la aspiradora, utilice una pipeta para soplarlas. A continuación, hornee el dispositivo a 75 grados centígrados durante dos horas.

Cuando se enfríe a temperatura ambiente, corte con cuidado el PDMS alrededor del molde y luego retire suavemente la capa de PDMS polimerizado del molde de obleas de silicona, evitando cualquier daño a la construcción del molde de obleas. Coloque la capa PDMS en el banco con el lado del patrón hacia arriba. Corte cuidadosamente el chip individual con una hoja de afeitar industrial de un solo filo, reteniendo un margen adecuado desde el borde de cada chip para evitar daños en la construcción.

Con el lado del patrón hacia arriba, use un rotulador perforador para perforar agujeros directamente hacia abajo a través de los círculos de entrada y salida a cada lado de los canales. Revise cada orificio insertando la aguja de la pluma perforadora nuevamente en el orificio. Asegúrese de que la aguja pueda salir por el otro lado, lo que indica que no hay obstrucciones.

A continuación, utilice la cinta para limpiar las partículas de polvo y los residuos de la superficie superior. Repita este paso al menos tres veces y deje un trozo limpio de cinta adhesiva Scotch en el PDMS para mantener una superficie libre de polvo. A continuación, dé la vuelta al dispositivo y repita este procedimiento en el sitio opuesto al PDMS.

Deja el último pedazo de cinta adhesiva en este lado también. Ahora prepare una superficie de vidrio para la base del dispositivo. Seleccione la pieza de cubreobjetos de 24 milímetros por 30 milímetros con un grosor de entre 13 y 17 milímetros.

Rocíe etanol al 70% sobre el vidrio y séquelo con un removedor de polvo para esterilizar la superficie. A continuación, transfiera el cubreobjetos y el PDMS a una placa de plástico. Retire la cinta adhesiva del PDMS y coloque el lado del patrón hacia arriba en la placa, sin entrar en contacto con la superficie superior.

A continuación, transfiera la placa a una cámara de plasma. Aplique un tratamiento de plasma de oxígeno al PDMS y al vidrio de cobertura para hacer que las superficies sean hidrófilas. A continuación, retire la placa de la cámara de plasma y conecte con cuidado las superficies tratadas con plasma del PDMS en un cubreobjetos.

Asegúrese de que no haya burbujas de aire entre el PDMS y el cubreobjetos. Finalmente, transfiera el dispositivo a un horno y hornee a 75 grados centígrados durante al menos dos horas. Sumerja los tubos de entrada y salida en una solución de etanol al 70% un día antes de la preparación del chip PDMS.

Al día siguiente, llene una jeringa de cinco mililitros con agua esterilizada en autoclave y lave cada tubo colocando el tubo en la jeringa y enjuagando el tubo con agua. Repita el paso de lavado al menos tres veces para eliminar el etanol residual. A continuación, examine los canales PDMS bajo un microscopio óptico.

Usando un objetivo 10 X, asegúrese de que las estructuras sean consistentes e intactas. Estabilice el chip PDMS intacto en la plataforma del microscopio con cinta adhesiva. Asegure una jeringa de cinco mililitros cargada con agua estéril a una bomba de jeringa e inserte los tubos de entrada y salida correspondientes en el dispositivo.

Ajuste el caudal a 750 microlitros por hora y enjuague el chip durante unos 10 minutos. Observe los canales para asegurarse de que se eliminen las burbujas de aire. Si quedan burbujas después del enjuague de 10 minutos, ajuste manualmente la velocidad para eliminar las burbujas.

Transfiera un mililitro de una muestra de levadura preparada a dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue las muestras durante cinco minutos a 3.000 veces G. Retire la mayor parte del sobrenadante de cada tubo y combine el resto para formar una muestra de 5 mililitros. Con la muestra de levadura ya lista, retire los tubos de entrada del chip PDMS. Invierta manualmente la bomba de jeringa para aspirar una pequeña burbuja de aire de uno a dos centímetros de longitud, cada tubo de entrada, y luego aspire los cultivos celulares.

A continuación, vuelva a insertar el tubo de entrada en el chip PDMS y reinicie la bomba para cargar las celdas a una velocidad de 750 microlitros por hora. Deje la bomba de jeringa encendida durante 10 minutos y luego examine la progresión de la carga celular bajo el microscopio. Una carga exitosa atrapará las celdas debajo de más del 60% del pilar de suspensión.

Para mantener las células de levadura, cambie la solución de la jeringa por una solución nutricional y ajuste la velocidad a 400 microlitros por hora. El fenotipo de vida útil de la levadura se puede obtener contando el número de yemas producidas por cada célula madre atrapada y estimando el estimador de Kaplan-Meier. Usando este protocolo, el dispositivo atrapa con frecuencia células hijas frescas que brotaron de las células ya atrapadas.

A continuación, estas células se convierten en células madre frescas que pueden identificarse mediante un software de análisis de imágenes posterior. Estas células madre frescas proporcionan una medición más precisa de la vida útil. En este experimento, la vida media de las células madre frescas fue ligeramente más larga, en unas dos generaciones.

Además del número de yemas, el intervalo de tiempo entre dos eventos sucesivos de gemación se puede extraer de los datos de imagen. La brotación se ralentiza drásticamente hacia el final de su vida útil, lo que indica el estado poco saludable de estas células envejecidas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe usar un chip recién hecho para ayudar a evitar burbujas y aumentar la concentración de células para mejorar la eficiencia de la carga de células cuando sea necesario.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del envejecimiento de levaduras exploraran los cambios moleculares tempranos que son causales del fenotipo de envejecimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer este dispositivo microfluídico y cómo usarlo para medir la vida útil y los fenotipos celulares en células individuales.