Name: El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a fabricar dispositivos microfluídicos para medir la longevidad y fenotipos celulares en levaduras individuales. Este método permite rastrear células madre y sus marcadores moleculares simultáneamente.

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Esta investigación fue apoyada por el AG043080 de subvenciones de los NIH y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC), No. 11434001. Agradecemos a Lucas Waldburger por la revisión del manuscrito.

1. Molde de fabricación de obleas de silicio NOTA: La fotomáscara se ha diseñado con el software AutoCAD y fabricado por una empresa comercial. Este diseño contiene tres capas de diferentes patrones ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Archivo 1</a> ). Las alturas de la primera, segunda, y tercera capas son aproximadamente 4! M, 10 m, y 50! M, respectivamente. El molde oblea de silicio se ha creado a partir de la fotomáscara mediante litografía blanda 9, 10. <ol><li> Hornear una oblea de silicio a 200 ° C durante 10 min para evaporar el vapor de agua. revestimiento por centrifugación fotorresistente negativo SU-8 sobre la oblea de silicio. NOTA: revestimiento por centrifugación SU-8 3.005 a 5.000 rpm durante 30 s para generar la primera capa, SU-8 de 2010 a 3000 rpm durante 30 s para generar la segunda capa, y SU-8 3.025 a 2.000 rpm durante 30 s para generar el tercera capa. </li><li> Soft-hornear la oblea revestida antes de tque la transferencia de patrones. Alinear y exponer la oblea en el modo de &quot;contacto directo&quot; utilizando un alineador de máscara. NOTA: Soft-hornear la oblea durante 2 min a 95 ° C para la primera capa, 3 min a 95 ° C para la segunda capa, y 15 min a 95 ° C para la tercera capa. Utilice la dosis de exposición a 100 mJ / cm 2 para la primera capa, 130 mJ / cm 2 para la segunda capa, y 200 mJ / cm 2 para la tercera capa. </li><li> Después de la exposición, post-hornear la oblea y desarrollarla utilizando SU-8 desarrollador. Se seca la oblea usando una pistola de N 2 y difíciles de hornear la oblea a 200 ° C durante 30 min. NOTA: El molde oblea de silicio se fija a una placa de plástico 15 cm de diámetro Petri utilizando cinta scotch, con el lado de patrón hacia arriba. Por lo general, ponemos varias estructuras de chips idénticos en el mismo molde, lo que permite que varios chips de microfluidos para fabricar al mismo tiempo. Cada molde puede ser reutilizado muchas veces para fabricar chips de microfluidos. </li></ol> 2. microfluidosLa fabricación de chips <ol><li> Colocar un recipiente pesado limpia en una balanza y tarar la balanza. Verter 50 g de base de PDMS en la barca de pesaje. </li><li> Añadir 5 g de agente de curado PDMS a la embarcación pesaje (w / w proporción de 1:10 a la base de PDMS). NOTA: Este volumen se basa en un plato de 15 cm de diámetro Petri con el molde. Ajustar la cantidad de reactivo si se utiliza una placa de Petri de un tamaño diferente. </li><li> Se agita la base de PDMS y el agente de curado con una pipeta desechable. Comience desde el borde del recipiente pesado y poco a poco avanzar hacia el interior. Se agita a fondo durante varios minutos hasta pequeñas burbujas se forman en toda la mezcla; la mezcla completa es esencial para la polimerización de PDMS. </li><li> Verter la mezcla lentamente en la placa de Petri; la mezcla debe cubrir completamente el molde oblea de silicio. </li><li> Coloque la placa de Petri en un vacío durante 10 minutos para eliminar todas las burbujas de aire de la mezcla de PDMS. Si las burbujas permanecen en la superficie de la mezcla, utilizar una pipeta para apagarlas. </li><li> Incubar el siliciomolde oblea con PDMS en un horno a 75 ° C durante aproximadamente 2 h. </li><li> Con cuidado, la capa de PDMS polimerizadas fuera del molde oblea de silicio, evitando cualquier daño a la construcción del molde oblea. Alternativamente, cortar los PDMS directamente desde el molde oblea de silicio con un mínimo margen de 5 mm alrededor del patrón usando una hoja de afeitar industrial de un solo borde; suavemente pelar la capa de PDMS fuera del molde oblea. </li><li> Coloque la capa de PDMS en el banco con el lado patrón hacia arriba. Extraer con cuidado el chip individuo con una hoja de afeitar industrial de un solo borde, manteniendo un margen adecuado desde el borde de cada solo chip para evitar el daño de la construcción. </li><li> Con el lado de patrón hacia arriba, utilizar una pluma punzón (0,75 mm ID) para perforar agujeros directamente hacia abajo a través de los círculos de entrada y de salida en cada lado de los canales. NOTA: Estos agujeros crean la vía para el flujo del medio. Por lo tanto, es crucial que pasar por los círculos y perforar todo el camino a través de la capa de PDMS. Asegurate quequitar las columnas de PDMS del agujero. </li><li> Comprobar cada agujero perforado mediante la inserción de la aguja de pluma punzón de nuevo en el agujero. Asegúrese de que la aguja pueda salir por el otro lado, lo que indica que no hay ninguna obstrucción. Aplique cinta a la superficie de patrón, a continuación, pelar suavemente de la cinta para limpiar las partículas de polvo. Repita este paso al menos tres veces. Deja un trozo limpio de cinta adhesiva sobre el PDMS para mantener la esterilización. </li><li> Repita este procedimiento en el lado opuesto del PDMS y dejar el último trozo de cinta en también. </li><li> Preparar una cubierta de vidrio 24 mm x 30 mm con un espesor de 0.13-0.17 mm. Pulverizar 70% de etanol en el cristal y seco con eliminador de polvo para esterilizar la superficie; Además, el vidrio se puede lavar con agua esterilizada en autoclave y se secó con eliminador de polvo. </li><li> Transferir el vidrio de cubierta y PDMS a una placa de plástico. Retire la cinta adhesiva desde el PDMS y colocar la superficie con el dibujo hacia arriba. Evitar cualquier contacto con la superficie de patrón durante la transferencia. </li><li&gt; Coloque la placa de plástico en la máquina de plasma. Aplicar el tratamiento con plasma de oxígeno a los PDMS y el vidrio de cubierta para hacer que las superficies hidrófilas con los siguientes parámetros de operación: la exposición, 75 s; estabilización de los gases, 20 cc / min; presión, 200; y el poder, 100 W. </li><li> Colocar con cuidado el PDMS en el cristal de cubierta, que conecta las dos superficies hidrófilas (las superficies que se enfrentan hacia arriba durante el tratamiento de plasma). Asegúrese de que no hay burbujas de aire entre el PDMS y la cubierta de vidrio. </li><li> Incubar el chip de PDMS en un horno a 75 ° C durante al menos 2 h. NOTA: microfluídica deficientes pueden causar fugas de líquido en el microscopio durante el experimento. Por lo tanto, es importante comprobar el enlace entre el PDMS y el vidrio de cubierta levantando ligeramente el PDMS de los bordes con pinzas. levantando suavemente el PDMS no debe separarlo de la cubierta de vidrio, lo que indica una unión exitosa. </li></ol> 3. Preparación para el Experimento <ol><li&gt; Preparación del tubo. <ol><li> Sumergir los tubos de entrada y salida en solución de etanol al 70% por separado 1 día antes de la preparación de chips PDMS. </li><li> Llene una jeringa de 5 ml con agua tratada en autoclave para lavar los tubos. Lavar cada tubo conectando el tubo de la jeringa y el lavado del tubo con agua. </li><li> Repetir la etapa de lavado al menos 3 veces para limpiar los residuos de etanol. </li></ol></li><li> Examinar los canales de PDMS bajo un microscopio óptico con un objetivo de 10X para asegurarse de que la estructura es coherente e intacto. Estabilizar el chip de PDMS en la plataforma de microscopio usando cinta adhesiva. NOTA: Haga varias fichas en un momento en el paso 2 para asegurar que no son chips de copia de seguridad, especialmente si haciendo que el dispositivo por primera vez. </li><li> Llene una jeringa de 5 ml con agua tratada en autoclave. Fije la jeringa a una bomba de jeringa e insertar los tubos de entrada y salida correspondientes. Ajuste la velocidad de lavado a 750 l / h para enjuagar el chip durante aproximadamente 10 min. Las burbujas de aire en los canales de ramificacióndeben ser lavados durante este período; Si hay burbujas restantes, ajustar manualmente la velocidad para eliminar las burbujas. </li><li> preparación de la muestra de levadura. <ol><li> Transferencia de 1 ml de muestra de levadura preparada (OD 600 0.6-0.8) en dos tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y se centrifuga durante 5 min a 3.000 x g. </li><li> Eliminar la mayoría del sobrenadante de cada tubo y combinar el resto para formar una muestra de 0,5 ml. </li></ol></li><li> Pausa la bomba de jeringa y retirar los tubos de entrada del chip PDMS. </li><li> retroceder manualmente la bomba de jeringa para aspirar una pequeña burbuja de aire (1 a 2 cm de longitud) en cada tubo de entrada. Pasar a aspirar la muestra de levadura; la burbuja de aire se mostrará el límite de la muestra e indicar la cantidad de muestra que se ha dibujado. NOTA: Evitar que aspira la muestra en la jeringa. </li><li> Introducir el tubo de entrada de nuevo en el chip de PDMS y reinicie la bomba para cargar las células a una velocidad de 750 l / h. </li><li> Deje la jeringa bomba durante 10 min lan y examinar la progresión carga de las células bajo el microscopio; una carga exitoso células trampa bajo más de un 60% de suspender pilar. </li><li> Cambiar a solución nutrición y ajustar la velocidad de 400 l / h para el cultivo celular. </li><li> Seleccione posiciones de observación para el microscopio. NOTA: Para las mediciones de vida útil, las imágenes fueron tomadas una vez cada 15 minutos mediante un microscopio óptico con un objetivo de 40x. Para el análisis informador fluorescente, imágenes fueron tomadas una vez cada 15 min por un microscopio de fluorescencia con un objetivo de aceite 60X. </li></ol>

<ol><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
<li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143(2013).</li>
<li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/16/2/012/meta">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li>
<li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast%3A+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p%2FMsn4p+and+Hsf1p+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li>
<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El dispositivo de PDMS necesita ser recién hecho. De lo contrario, las burbujas de aire causadas por la inserción de tubos en el dispositivo serán difíciles de eliminar. Paso 3.4 es importante para mejorar la eficiencia de carga de células mediante la concentración de las células. Para aumentar el rendimiento del experimento, de 4 a 6 módulos en el mismo chip PDMS conectados a independiente bombas que operan normalmente se utilizan para realizar de 4 a 6 experimentos diferentes (diferentes cepas o composiciones de medio...

La levadura en ciernes es un poderoso organismo modelo en la investigación del envejecimiento. Sin embargo, un ensayo de vida útil convencional en levaduras se basa en la microdisección, que no sólo es un trabajo intensivo sino también bajo rendimiento 1, 2. Además, el enfoque de microdisección tradicional no proporciona una vista detallada de diversas características celulares y moleculares en las células madre individuales a medida que envejecen. El desarrollo de dispositivos microfluídicos ha permitido un procedimiento automatizado para medir la vida útil de la levadura, así como de seguir los marcadores moleculares y diferentes fenotipos celulares a lo largo de la vida útil de las células madre 3, 4, 5, 6, 7, 8. Después de células de levadura se cargan en un dispositivo de microfluidos, pueden ser rastreados bajo un microscopio usando el tiempo-vueltas automáticase imágenes. Con la ayuda de la formación de imágenes herramientas de procesamiento, diferentes fenotipos celulares y moleculares se pueden extraer 3, 6, 8, incluyendo la vida útil, el tamaño, el reportero fluorescente, la morfología celular, la dinámica del ciclo celular, etc., muchos de los cuales son difíciles o imposibles de obtener mediante el método tradicional de microdisección. Dispositivos de microfluidos han ganado importancia en la investigación de levadura envejecimiento, ya que su desarrollo con éxito hace unos años, 3, 4, 6, 7. Varios grupos han publicado posteriormente en variaciones de los diseños anteriores 5, y muchos laboratorios de levadura han empleado dispositivos de microfluidos para su estudio. En un cultivo de células sometidos a crecimiento exponencial, el número de células madre de edad que están disponibles para la observación es miniscuLe. Por lo tanto, el principio de diseño general del dispositivo de microfluidos para mediciones de vida útil es conservar las células madre y para eliminar las células hijas. Uno de estos diseños hace uso del hecho de que la levadura se somete a la división celular asimétrica. Las estructuras de las células madre de la trampa voluntad dispositivo más grandes y permitir que las células hijas más pequeñas para ser lavados. El chip microfluídico descrito en este artículo utiliza una almohadilla de polidimetilsiloxano suave (PDMS) (columnas Pensile verticales) a las células madre trampa (Figura 1). Dispositivos de diseño similar se ha informado anteriormente 3, 4, 6, 7. Este protocolo utiliza un procedimiento más sencillo para fabricar dispositivos microfluídicos y un método de la celda de carga sencilla que está optimizado para los experimentos de imagen de lapso de tiempo. Uno de los parámetros clave en el dispositivo de microfluidos es la anchura de las almohadillas de PDMS utilizados para células trampa madre. nuestra device utiliza almohadillas más amplios que pueden mantener más células madre en cada almohadilla, incluyendo una fracción significativa de células madre frescas que pueden rastrearse a lo largo de su vida útil. Además de las mediciones de vida útil, este protocolo es útil para los experimentos de imagen única célula de lapso de tiempo cuando las células necesitan ser rastreado por muchas generaciones o cuando una observación a lo largo de toda la vida útil es necesario.

<table><tbody><tr><td>3'' < 111> oblea de silicona</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Serie 2000 y 3000</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&reg; 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Incluye base de elastómero de silicona Sylgard y agente de curado</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&trade; punzón (diámetro interno 0,75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>29002513</tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&reg; cubreobjetos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch Tape</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Hojas de afeitar</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>etanol puro, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa BD de 5 mL (Luer-Lock&trade; Consejo)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Tubería de pared estándar de PTFE (100 pies, tamaño AWG: 22, ID nominal: 0.028)</td><td>Compañía de suministro</td><td>de componentes SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>Surtido de agujas</td><td>Compañía de suministro de componentes</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Horno de laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Nikon TE2000 con objetivo de 40X y 60X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 con objetivo de 40X y 60X</td> Bomba de jeringa <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de dispositivos de microfluidos para medir lifespan y celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

La levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae es un organismo modelo importante en la investigación del envejecimiento. Los estudios genéticos han revelado muchos genes con efectos conservados en la esperanza de vida de todas las especies. Sin embargo, las causas moleculares del envejecimiento y la muerte siguen siendo difíciles de alcanzar. Para obtener una comprensión sistemática de los mecanismos moleculares que subyacen al envejecimiento de la levadura, necesitamos métodos de alto rendimiento para medir la vida útil y cuantificar varios fenotipos celulares y moleculares en células individuales. Anteriormente, desarrollamos dispositivos microfluídicos para rastrear las células madre de levadura en ciernes a lo largo de su vida útil mientras eliminamos las células hijas recién nacidas. Este artículo presenta un método para la preparación de chips microfluídicos y para la configuración de experimentos microfluídicos. Se pueden utilizar múltiples canales para rastrear simultáneamente las células en diferentes condiciones o de diferentes cepas de levadura. Una configuración típica puede rastrear cientos de células por canal y permitir imágenes de microscopio de alta resolución durante toda la vida útil de las células. Nuestro método también permite la caracterización detallada de la vida útil, los marcadores moleculares, la morfología celular y la dinámica del ciclo celular de células individuales. Además, nuestro dispositivo microfluídico es capaz de atrapar una cantidad significativa de células madre frescas que se pueden identificar mediante el análisis de imágenes posteriores, lo que permite medir la vida útil con mayor precisión.

Después de los experimentos, la vida útil de las células y muchos fenotipos celulares y moleculares se pueden extraer de las imágenes de lapso de tiempo grabados. Puesto que hay un número de diferentes características que se pueden extraer de cada celda, el primer paso del análisis es para anotar las células y eventos, incluyendo las posiciones y los límites de las células y la sincronización de los diversos eventos que se está realizando el seguimiento, tales como los acontecimientos en...

Este artículo presenta un protocolo optimizado para la producción de chips de microfluidos y la configuración de los experimentos de microfluidos para medir la vida útil y los fenotipos celulares de células de levadura individuales.

El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

El objetivo general de este experimento consiste en fabricar un dispositivo microfluídico especializado y utilizarlo para medir la longevidad y los fenotipos celulares de una sola célula de levadura. Este método puede ayudar a responder algunas preguntas clave en el campo del envejecimiento de levaduras, como por qué las células madre envejecen y mueren, y cuáles son los primeros eventos moleculares que impulsan la pérdida de la homeostasis celular y, eventualmente, el envejecimiento y la muerte celular. La principal ventaja de esta técnica es que podemos rastrear las células madre, su longevidad y diversos marcadores moleculares al mismo tiempo, lo que nos permite identificar eventos moleculares que se correlacionan con la longevidad.Aunque este método puede proporcionar información sobre el envejecimiento de levaduras, también puede aplicarse a otras áreas, como el monitoreo de respuestas secundarias a la participación que requiere verificación celular durante muchas generaciones. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la fabricación de dispositivos microfluídicos, la carga de células y la configuración del microscopio requieren mucha práctica para realizarse con éxito. Una demostración previa de este método es fundamental, ya que resulta difícil cargar adecuadamente el dispositivo microfluídico con levaduras.Para comenzar, fabrique un molde de oblea de silicio para el dispositivo utilizando técnicas estándar, como se describe en el protocolo de texto adjunto. Colóquelo con la cara estructurada hacia arriba en una placa de Petri de 15 centímetros. Sujete el molde sobre la placa de Petri con cinta adhesiva.A continuación, coloque un recipiente de pesaje limpio sobre una balanza y taree la balanza. Vierta 50 gramos de la base de PDMS en el recipiente de pesaje y luego agregue cinco gramos del agente de curado de PDMS. Mezcle la base de PDMS y el agente de curado con una pipeta desechable.Comience desde el borde del recipiente de pesado y muévase lentamente hacia el interior. Mezcle bien durante varios minutos hasta que se formen pequeñas burbujas en toda la mezcla. Vierta lentamente la mezcla en la placa de Petri, de modo que cubra completamente el molde de oblea de silicio.Luego, coloque la placa de Petri en vacío durante 10 minutos para eliminar todas las burbujas de aire de la mezcla de PDMS. Si quedan burbujas en la superficie de la mezcla una vez retirada del vacío, utilice una pipeta para expulsarlas. A continuación, hornee el dispositivo a 75 grados Celsius durante dos horas.Una vez enfriado nuevamente a temperatura ambiente, corte cuidadosamente a través del PDMS alrededor del molde y luego desprenda suavemente la capa de PDMS polimerizado del molde de oblea de silicio, evitando cualquier daño a la estructura del molde. Coloque la capa de PDMS sobre la mesa con el lado del patrón hacia arriba. Corte cuidadosamente cada chip individual con una cuchilla industrial de filo único, dejando un margen adecuado desde el borde de cada chip para evitar dañar la estructura.Con el lado del patrón hacia arriba, utilice un punzón para perforar agujeros directamente hacia abajo a través de los círculos de entrada y salida en cada lado de los canales. Verifique cada agujero insertando nuevamente la aguja del punzón en el orificio. Asegúrese de que la aguja pueda salir por el otro lado, lo que indica que no hay obstrucciones.A continuación, use la cinta para eliminar partículas de polvo y residuos de la superficie superior. Repita este paso al menos tres veces y deje un trozo limpio de cinta adhesiva Scotch sobre el PDMS para mantener una superficie libre de polvo. Luego, gire el dispositivo y repita este procedimiento en la cara opuesta del PDMS.Deje también el último trozo de cinta adhesiva en este lado. Ahora prepare una superficie de vidrio para la base del dispositivo. Seleccione el trozo de cubreobjetos de 24 milímetros por 30 milímetros con un espesor entre 13 y 17 milímetros.Rocíe etanol al 70 % sobre el vidrio y séquelo con un eliminador de polvo para esterilizar la superficie. Luego, transfiera el cubreobjetos y el PDMS a una placa de plástico. Retire la cinta adhesiva del PDMS y coloque el lado del patrón hacia arriba en la placa, sin tocar la superficie superior.Luego, transfiera la placa a una cámara de plasma. Aplique un tratamiento con plasma de oxígeno al PDMS y al cubreobjetos para hacer las superficies hidrofílicas. A continuación, retire la placa de la cámara de plasma y conecte cuidadosamente las superficies tratadas con plasma del PDMS al cubreobjetos.Asegúrese de que no haya burbujas de aire entre el PDMS y el vidrio de cubierta. Finalmente, transfiera el dispositivo a un horno y caliente a 75 grados Celsius durante al menos dos horas. Sumerja los tubos de entrada y salida en una solución de etanol al 70 % un día antes de la preparación del chip de PDMS.Al día siguiente, llene una jeringa de cinco mililitros con agua autoclavada y lave cada tubo colocando el tubo sobre la jeringa y enjuagándolo con agua. Repita el paso de lavado al menos tres veces para eliminar el etanol residual. A continuación, examine los canales de PDMS bajo un microscopio óptico.Utilizando un objetivo de 10 X, asegúrese de que las estructuras sean consistentes e intactas. Estabilice el chip de PDMS intacto sobre la plataforma del microscopio utilizando cinta adhesiva Scotch. Sujete una jeringa de cinco mililitros cargada con agua estéril a una bomba de jeringa e inserte los tubos de entrada y salida correspondientes en el dispositivo.Establezca el caudal en 750 microlitros por hora y enjuague el chip durante aproximadamente 10 minutos. Observe los canales para asegurarse de que todas las burbujas de aire sean eliminadas. Si después del enjuague de 10 minutos quedan burbujas, ajuste manualmente la velocidad para eliminarlas.Transfiera un mililitro de una muestra de levadura preparada a dos tubos de microcentrifugado de 1,5 mililitros y centrifugue las muestras durante cinco minutos a 3.000 × g. Retire la mayor parte del sobrenadante de cada tubo y combine los restos para formar una muestra de 5 mililitros. Con la muestra de levadura ya lista, retire los tubos de entrada del chip de PDMS. Invierta manualmente la bomba de jeringa para aspirar una pequeña burbuja de aire de uno a dos centímetros de longitud en cada tubo de entrada y luego aspire los cultivos celulares.Luego, inserte el tubo de entrada nuevamente en el chip de PDMS y reinicie la bomba para cargar las células a una velocidad de 750 microlitros por hora. Deje la bomba de jeringa encendida durante 10 minutos y luego examine el progreso de la carga celular bajo el microscopio. Una carga exitosa atrapará células bajo más del 60 % de los pilares de suspensión.Para mantener las células de levadura, cambie la solución en la jeringa a una solución nutritiva y ajuste la velocidad a 400 microlitros por hora. El fenotipo de longevidad de la levadura se puede obtener contando el número de brotes producidos por cada célula madre atrapada y estimando el estimador de Kaplan-Meier. Mediante este protocolo, el dispositivo atrapa frecuentemente células hijas nuevas que brotaron de las células ya atrapadas.Estas células luego se convierten en nuevas células madre que pueden identificarse mediante software de análisis de imágenes posterior. Estas nuevas células madre proporcionan una medición de longevidad más precisa. En este experimento, la longevidad promedio de las nuevas células madre fue ligeramente mayor, aproximadamente en dos generaciones.Además del número de brotes, se puede extraer de los datos de imagen el intervalo de tiempo entre dos eventos sucesivos de brotación. La formación de brotes se ralentiza considerablemente hacia el final de su vida útil, lo que indica el estado no saludable de estas células envejecidas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar siempre un chip recién preparado para ayudar a evitar la formación de burbujas, y aumentar la concentración de células con el fin de mejorar la eficiencia de carga celular cuando sea necesario.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del envejecimiento de la levadura exploraran los primeros cambios moleculares que son causales del fenotipo de envejecimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar este dispositivo microfluídico y de cómo utilizarlo para medir la longevidad y los fenotipos celulares en células individuales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Envejecimiento cronológico en la levadura se refiere a la pérdida de la viabilidad celular asociado con el tiempo en la fase estacionaria. Aquí se describe un método de alto rendimiento para determinar cuantitativamente la levadura abarcan la vida cronológica.

Cuantificar cronológico levadura Duración de la vida por consecuencia de células envejecidas

En este artículo presentamos un protocolo general para la medición de la duración de la vida replicativa de las células madre de la levadura.

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

Aquí se describe un conjunto de ensayos de mutación del ADN que se pueden combinar con el modelo cronológico levadura vida a estudiar los genes / vías que regulan o contribuir a la inestabilidad del ADN genómico durante el envejecimiento.

El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad

Se presenta un método simple para producir los dispositivos de microfluidos capaces de aplicar similares condiciones dinámicas a múltiples cepas distintas, sin la necesidad de una sala limpia o litografía blanda.

Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

Se describe aquí la operación de un dispositivo de microfluidos que permite imágenes microscópicas continua y de alta resolución de las células de levadura en ciernes individuales durante su completa replicativa y / o cronológico vida útil.

Continua observación microscópica de alta resolución de replicativa envejecimiento en la levadura en ciernes

Se presenta un protocolo sencillo para obtener películas de microscopía de fluorescencia de las células de levadura en crecimiento, y un paquete de software basado en GUI para extraer los datos de series de tiempo de una sola célula. El análisis incluye linaje automático y la asignación por división de tiempo integrado con inspección visual y manual de conservación de los datos de seguimiento.

La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

En este protocolo se introduce la fabricación, configuración y operación básica de un biorreactor de picolitros microfluídico (PLBR) para el análisis de microorganismos procariotas de una sola célula. Se analizaron microorganismos de relevancia industrial como prueba de principio, lo que permitió conocer la tasa de crecimiento, la morfología y la heterogeneidad fenotípica durante ciertos períodos de tiempo, lo que difícilmente es posible con los métodos convencionales.

Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

Presentamos un método para cuantificar los fenotipos de crecimiento de células de levadura individuales a medida que crecen en colonias en medios sólidos usando microscopía de lapso de tiempo denominada Evaluación de Duplicación de células vivas de levaduras (ODELAY). La heterogeneidad de la población de células genéticamente idénticas que crecen en colonias puede observarse y cuantificarse directamente.

ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

Se presenta un método para el análisis de microfluídica de linajes de células bacterianas individuales utilizando Bacillus subtilis como ejemplo. El método supera las deficiencias de los tradicionales métodos analíticos en Microbiología por lo que permite la observación de cientos de generaciones de celular bajo condiciones de crecimiento muy uniforme y controlable.

Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis

Aquí hay un protocolo para identificar interacciones genéticas a través de una mayor pantalla supresora de número de copia en Saccharomyces cerevisiae. Este método permite a los investigadores identificar, clonar y probar supresores en mutantes de levadura de corta duración. Probamos el efecto del aumento del número de copia de SIR2 en la vida útil en un mutante nulo de autofagia.

Una pantalla supresora para la caracterización de los vínculos genéticos que regulan la vida cronológica en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a fabricar dispositivos microfluídicos para medir la longevidad y fenotipos celulares en levaduras individuales. Este método permite rastrear células madre y sus marcadores moleculares simultáneamente.

El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

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