El uso de un análisis de biosensores conductimétricos β-lactamase-base para detectar las interacciones biomoleculares

El objetivo general de este ensayo conductimétrico de biosensores es detectar interacciones biomoleculares, utilizando la tecnología híbrida de betalactamasa. Describimos un método para detectar interacciones antígeno-anticuerpo, utilizando una proteína betalactamasa quimérica. El principio de este método se basa en la detección de la unión mediante la medición de la liberación de protones de la actividad de la betalactamasa.

La principal ventaja de esta técnica frente a un inmunosensor convencional es el uso de una betalactamasa quimérica, que permite realizar ensayos sensoriales más baratos y rápidos mediante el uso de una proteína híbrida para detectar los analitos La demostración del procedimiento correrá a cargo de Mathieu Dondelinger, investigador graduado. Comience este procedimiento con la preparación de la muestra de proteína y la solución como se describe en el protocolo de texto. Prepare el electrodo reutilizable sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenga 300 microlitros por pocillo de solución de preparación de electrodos durante dos minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente.

Repita este paso tres veces. Luego, enjuague los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos que contiene 300 microlitros por pocillo de agua destilada durante dos minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente. Para regenerar los electrodos, sumerja las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenga 300 microlitros por pocillo de solución de regeneración durante la noche a cuatro grados Celsius o una hora a temperatura ambiente.

Luego, realice tres lavados de los electrodos sumergiendo las puntas en pocillos de una placa de 96 pocillos que contiene 300 microlitros por pocillo de solución salina tamponada con fosfato. Realice cada lavado durante dos minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente. Cubra la lisozima de clara-huevo-gallina sobre la superficie de polianilina del electrodo depositando una gota de 15 microlitros de 40 microgramos por mililitro de HEWL preparado en tampón de fosfato sobre la superficie del electrodo.

Incubar el electrodo una hora a temperatura ambiente. A continuación, realice tres lavados de los electrodos con tampón de fosfato sumergiendo las partes del electrodo de los chips del sensor en un pocillo de una placa de 96 pocillos que contiene 300 microlitros por pocillo de tampón de fosfato. Realice cada lavado durante dos minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente.

Sature los electrodos agregando una gota de 30 microlitros de la solución de bloqueo sobre la superficie del electrodo. Incubar durante una hora a temperatura ambiente. Luego, lave tres veces como antes.

Diluir las soluciones BlaP-cAb-Lys3 o BlaP hasta 20 microgramos por mililitro en tampón aglutinante. A continuación, aplique una gota de 15 microlitros de esta solución diluida sobre los electrodos. Incubar los electrodos durante una hora a temperatura ambiente.

Después de la reacción de antígeno nanocuerpo, lave los electrodos tres veces con solución de lavado. A continuación, lave los electrodos del sensor en el tampón de detección sumergiendo los electrodos en un pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga 300 microlitros por pocillo de tampón de detección. E incubar brevemente durante un minuto.

Para la detección, conecte el multímetro digital a la computadora. Luego, conecte el chip del sensor al multímetro digital a través de la parte del circuito de cobre. Inicie la respuesta del sensor aplicando una gota de 50 microlitros de solución de bencilpenicilina de cuatro milimolares en los electrodos marcados positivamente.

Aplique una gota de 50 microlitros de la solución de detección en los electrodos marcados con negativos para que sirvan como control negativo. Controle los valores conductométricos con el multímetro digital conectado durante 30 minutos. Visualice los datos en tiempo real directamente en la pantalla o exporte los datos digitales como un archivo de texto.

Estos datos brutos se pueden trazar para crear una salida gráfica que represente las mediciones de los cambios de conductividad entre los electrodos de referencia y de muestra en función del tiempo. Para construir la proteína quimérica, se utilizó la betalactamasa de clase A BlaP como proteína transportadora. Aquí, los residuos catalíticos se presentan en rojo.

El sitio de inserción ubicado en un bucle expuesto al solvente se indica en amarillo. El fragmento de anticuerpo camélido denominado cAb-Lys3 se insertó en BlaP. La proteína quimérica resultante, BlaP-cAb-Lyse3, es capaz de unirse a HEWL mientras se conserva la actividad de la betalactamasa.

El HEWL se inmovilizó en un electrodo codificado por polianilina antes de cargar BlaP-cAb-Lys3. La liberación de protones tras la hidrólisis de la bencilpenicilina por la proteína quimérica inmovilizada induce cambios en la conductividad que pueden ser interpretados por el usuario. Los sensores contienen ocho chips organizados en cuatro pares.

Cada chip incluye tres electrodos, un electrodo de trabajo recubierto de polianilina, un electrodo de referencia y un contraelectrodo. Para cada par, el chip etiquetado como negativo corresponde a un control negativo, mientras que el chip etiquetado como positivo corresponde a la muestra analizada. Aquí se muestran las mediciones de conductancia que muestran la interacción específica de BlaP-cAb-Lys3 con HEWL.

Los cambios en la conductividad son el resultado de la liberación de protones inducida por la hidrólisis del antibiótico por la betalactamasa quimérica inmovilizada. No se pudo detectar ninguna unión para el control negativo, betalactamasa nativa BlaP. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 1/2 día si se realiza correctamente y se optimizan las condiciones experimentales.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la inserción de un fragmento de anticuerpo en BlaP es un desafío. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de los datos generados dependerá de la funcionalidad de la betalactamasa quimérica. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos que permitan la cuantificación de la interacción detectada con el fin de determinar la constante de asociación de equilibrio de esta interacción.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los biosensores inmunes exploraran las interacciones moleculares en varias muestras que van desde organismos vivos hasta diferentes entornos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la detección de numerosas biomoléculas, ya que la tecnología de betalactamasas quiméricas es una herramienta versátil para funcionalizar cualquier anticuerpo o un fragmento de proteína en la red. Por lo tanto, podría utilizarse para desarrollar herramientas de diagnóstico baratas y rápidas en numerosos campos, como la salud humana y animal.