Name: Producción de nanopartículas metálicas por ablación por láser pulsado en líquidos: una herramienta para estudiar las propiedades antibacterianas de las nanopartículas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas metálicas mediante ablación láser pulsada en líquidos para evaluar sus propiedades antibacterianas. Este método permite controlar tamaño y composición sin subproductos químicos peligrosos.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (NSF adjudica CMMI-0922946 a DB, CMMI-1300920 a DB y S.O&#39;M., Y CMMI-1531789 a S.O&#39;M., DB y EAK) y un Busch Biomedical Research Grant para EAK y S.O&#39;M.

1. Enfocar el láser de nanosegundos y medir la fluencia <ol><li> Ensamble el aparato de ablación colocando una barra de agitación magnética y una etapa de ablación porosa dentro de un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml. NOTA: La etapa de ablación consiste en una plataforma de acero inoxidable de 3,81 cm de diámetro y 1,6 mm de espesor con diez orificios de 0,65 cm de diámetro y seis orificios de 0,50 cm de diámetro taladrados en el patrón ilustrado en la Figura 1 . El propósito de estos orificios es permitir que el líquido se mueva a través del objetivo de manera que las partículas no se acumulen inmediatamente por encima del objetivo. Una mezcla insuficiente lleva a interacciones deletéreas entre el láser y las partículas ya formadas. Además, tres orificios roscados # 29 (8-32) están situados cerca del perímetro de la plataforma para aceptar tornillos de ajuste que sirven como patas para elevar la plataforma y proporcionar espacio para una barra de agitación magnética ( Figura 1A ). <ol><li> Coloque el vaso de precipitados en unAgitar la placa y poner la placa agitadora en una etapa de translación xy para permitir el movimiento del objetivo durante la ablación ( Figura 1A ). </li></ol></li><li> Ajuste el láser Nd: YAG para que funcione a la longitud de onda fundamental de 1.064 nm, con una duración de impulso de 5 ns y una frecuencia de repetición de impulsos de 10 Hz. Medir la energía por impulso con una potencia láser y medidor de energía. La energía requerida es 240-250 mJ. </li><li> Enfoque el haz debajo del objetivo en la etapa de ablación usando una lente convergente de longitud focal de 250 mm (NA = 0.05). NOTA: El haz entrante tiene un radio de 4,025 mm y se requiere una altura de lente de 161 mm para alcanzar el tamaño de punto deseado. El tamaño óptimo del punto se determina empíricamente. Se utiliza un tamaño de mancha mayor para reducir el efecto de blindaje por los NP presentes en solución. Esto se equilibra con el hecho de que el aumento del tamaño del punto requiere una mayor energía para mantener la fluencia adecuada. </li><li> Determine el tamaño del punto colocando un objetivo metálico (ver sectioN 2) en la platina y ablación con varios pulsos láser. Ver el objetivo ablated junto con una diapositiva de micrómetro en un microscopio de luz CCD equipado con cámara (objetivo 4X) para medir el tamaño del punto ( Figura 1A ). NOTA: Para el aparato aquí, el sistema de ablación produce un tamaño de mancha con un área media de 5,51 mm2. El tamaño del punto permanece en este intervalo para cada ablación. </li><li> Calcule la fluencia dividiendo la energía del pulso por el área del punto. Para el aparato aquí, la fluencia es de 4,80 J / cm2. </li></ol> 2. Síntesis de nanopartículas de plata por ablación con láser pulsado en líquido <ol><li> Pesar un objetivo plano de plata utilizando una microbalanza para obtener la masa pre-ablación. </li><li> Adherir el objetivo de plata a la fase porosa con cinta adhesiva de doble cara. Añadir 40 ml de líquido de ablación al vaso ( Figura 1A ). La altura del líquido por encima del objetivo es de 11 mm. NOTA: Ablación típica liqUides son soluciones acuosas que contienen SDS 60 mM o PVP 2 mM para aumentar la monodispersidad. </li><li> Bajo agitación constante, mueva la etapa xy motorizada controlada por ordenador en un patrón elíptico (dimensiones: eje mayor = 2,09 cm, eje menor = 0,956 cm, área = 1,57 cm2) a una velocidad de 0,42 cm / s y ablación de la diana Durante 20 - 40 min. NOTA: La concentración de NPs aumenta con tiempos de ablación más largos. Asegúrese de que la agitación es suficientemente vigorosa para mantener la concentración de NP uniforme en toda la solución para minimizar los efectos de blindaje 7 . </li></ol> 3. Caracterización de las nanopartículas metálicas <ol><li> Recoger la solución de nanopartículas del vaso de precipitados por decantación. Confirme la presencia de nanopartículas midiendo sus espectros de luz UV-visible (200-1,100 nm). NOTA: Los NPs tienen una absorción de pico a la longitud de onda de resonancia de plasmón superficial (SPR). Para la plata, el SPR está centrado a 400 nm. NP altamente concentradoLas soluciones requieren dilución antes de medir el espectro UV-VIS para asegurar que las lecturas de absorbancia permanezcan dentro del rango lineal del espectrofotómetro. </li><li> Medir el diámetro hidrodinámico de los NPs por dispersión de luz dinámica (DLS) utilizando un método de análisis de distribución numérica [ 29] . <ol><li> Diluir la solución de NP 1:40 en la solución de ablación y pipetear 1 mL en una cubeta de plástico de 1 cm. Utilizando un ángulo de medición de 180 ° , mida la dispersión de la luz a una longitud de onda de 633 nm para determinar el diámetro NP según la ecuación de Stokes-Einstein: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/55416/55416eq1.jpg" /> Donde d es el radio hidrodinámico, k es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta, η es la viscosidad, y D el coeficiente de difusión traslacional o la velocidad del movimiento browniano. </li></ol></li><li> Confirmar el tamaño y la forma del NP usando el micro de transmisiónScopy (TEM) 30 . NOTA: El diámetro hidrodinámico medido usando DLS es mayor que el tamaño medido usando TEM debido a la capa de disolvente que rodea a los NPs. <ol><li> Diluir la solución de NP 1:40 en agua doblemente destilada para eliminar cualquier exceso de aditivos ( por ejemplo, SDS o PVP) que puedan interferir con la formación de imágenes. Dejar caer 2 μl de la solución sobre una rejilla metálica de cobre previamente recubierta con una película de carbono fino / fino (disponible comercialmente, véase la Lista de Materiales) y secar durante la noche a temperatura ambiente bajo vacío en un desecador. </li><li> Imagen de los NP para evaluar el tamaño y la forma como se describe en la referencia 30 . </li></ol></li><li> Para calcular la concentración de NP, desalojar cualquier PN sueltamente unido de la meta de metal ablated (paso 2.3) colocando el objetivo en un baño de agua de sonicación que contiene agua destilada durante 1 minuto. <ol><li> Secar el blanco bajo una corriente de aire comprimido durante 1 minuto. Medir la masa de la taRget en una microbalanza. Cuantificar la masa de NPs en solución como la diferencia de peso antes y después de la ablación, que se supone que es el resultado de la eyección de nanopartículas de metal en la solución. </li></ol></li></ol> 4. Post-irradiación <ol><li> Diluir los NP a una concentración máxima de 100 μg / mL en la misma solución de ablación que se utiliza en 2.2. Este límite de concentración es crítico para asegurar una irradiación uniforme. </li><li> Transferir 15-17 mL de los NPs diluidos a una cubeta de cuarzo que contiene una barra de agitación ( Figura 1B ). Coloque la cubeta en una placa de agitación magnética alineada paralelamente con el láser entrante. </li><li> Utilice un sistema de láser Nd: YAG para producir pulsos de láser de 25 ps 532 nm y una lente de distancia focal de 75 mm para enfocar el láser en el centro de la solución. Irradiar la solución durante 30 min a varias horas, dependiendo del tamaño deseado. NOTA: La energía total suministrada depende de la concentración de la solución y tDe irradiación y puede oscilar entre 0,5 mJ y 3,5 mJ. Para el aparato aquí, 30 minutos después de la irradiación de una muestra transparente, de baja concentración (&lt;50 μg / ml), se obtienen NP de plata con un diámetro de 10 nm. </li></ol> 5. Medición de las propiedades antibacterianas de las nanopartículas NOTA: Se probó la toxicidad de los NPs de plata tanto en Gram- positivos ( Bacillus subtilis ) como en Gram- negativos ( Escherichia coli ) 31 . El método se adapta fácilmente a cualquier especie; Sin embargo, la dosis eficaz de nanopartículas puede variar considerablemente y debe determinarse empíricamente. Aquí, E. coli se utiliza como el sistema modelo para la descripción del método. <ol><li> Cultivar cultivos de E. coli (cepa MG1655) durante la noche a 37 ° C en Luria Broth (LB) que contiene 10 g / L de triptona Bacto, 5 g / l de extracto de levadura y 10 g / l de cloruro sódico. Diluir los cultivos durante la noche a una densidad óptica (λ = 600Nm) de 0,01 en LB fresco. </li><li> Si se sintetizan los NPs en medios de ablación que contienen aditivos ( por ejemplo, SDS o PVP), a~nadir el producto quımico respectivo al LB de modo que la concentración permanezca constante al a~nadir los NPs. NOTA: Por ejemplo, en un experimento típico se cierra un blanco de plata en una solución de SDS 60 mM para producir una solución de 100 mu g / ml de NPs. Si la concentración final de NP en el medio de cultivo es de 10 μg / mL, preparar LB que contenga SDS 6 mM ( es decir, 1/10 de la concentración de SDS en el líquido de ablación). No hay ningún efecto negativo sobre el crecimiento de las bacterias cuando se usan estas concentraciones. Esto se muestra en el control -AgNP en la Figura 3 . </li><li> Añadir los NPs a los cultivos diluidos en concentraciones que oscilan entre 0-50 μg / mL y cultivar los cultivos con agitación a 37 ° C durante 2 h adicionales. Como control positivo de toxicidad, tratar E. coli con un antibiótico ( por ejemplo, 30 μg / ml de kanamYcin). </li><li> Después de la incubación de 2 h, diluir en serie las muestras de cultivo 1:10 en LB fresco y colocar 10 μL de gotas de cada dilución sobre placas de agar LB. Típicamente, las diluciones de 10 4 -10 8 veces son suficientes para ver colonias individuales. </li><li> Una vez que las gotitas han sido absorbidas, incubar las placas durante la noche a 37 ° C y contar las unidades formadoras de colonias (cfu) a la mañana siguiente. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los efectos antimicrobianos reproducibles de los NPs requieren una producción consistente de NPs con tamaños y concentraciones similares. Por lo tanto, es crítico para estandarizar los parámetros del láser incluyendo fluencia, longitud de onda, y duración del pulso. Si bien la dispersión dinámica de la luz es un método fácil y rápido para estimar el tamaño NP, la cuantificación precisa de la distribución de tamaños requiere una medición directa por TEM. Como cada haz de láser tiene características distintas en términos ...

Las nanopartículas (NPs) se definen generalmente como partículas que tienen al menos una dimensión que es menor de 100 nm de longitud. Los métodos químicos tradicionales de síntesis de NP típicamente requieren agentes reductores peligrosos, tales como borohidruros e hidracinas. Por el contrario, la ablación con láser de dianas metálicas sólidas sumergidas en un medio líquido (ablación por láser pulsado en líquidos - PLAL) proporciona una ruta respetuosa con el medio ambiente para la síntesis de NP que satisface los 12 Principios de Química Verde 1 , 2 . En PLAL, un objetivo metálico sumergido es irradiado por pulsos láser repetidos. A medida que el láser ablaza el objetivo, se libera un denso plumaje de racimos atómicos y vapor en el medio líquido en el que las NP se unen rápidamente. Los NP producidos por PLAL se dispersan finamente en un medio acuoso y el tamaño, la polidispersidad y la composición de los NPs pueden ser fácilmente controlados variando el líquido de ablación acuoso así como el par de láserAmperios 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Las características de las nanopartículas se pueden ajustar ajustando una serie de parámetros del láser, incluyendo: fluencia, longitud de onda y duración del pulso (revisado en la referencia 7 ). La fluencia del láser se calcula como la energía del pulso dividida por el área del punto del laser en la superficie del objetivo. Los efectos precisos de la fluencia sobre el tamaño y la polidispersidad de los PN son algo controvertidos. En general, se ha demostrado que para los sistemas de láser pulsado &#39;largo&#39; y &#39;ultra-corto&#39; existen regímenes de fluencia baja y alta que producen tendencias negativas y positivas de tamaño, respectivamente 8 , 9 , 10 , 11 . Tamaño NP distributiOns se pueden medir empíricamente utilizando técnicas tales como la dispersión dinámica de la luz y la microscopía electrónica de transmisión (TEM), como se describe a continuación. La elección de la longitud de onda del láser puede afectar a los mecanismos físicos por los que se forman los NPs. A menor longitud de onda (ultravioleta), los fotones de alta energía son capaces de romper enlaces interatómicos [ 12] . Este mecanismo de foto-ablación es un ejemplo de una síntesis de NP de arriba hacia abajo porque da como resultado la liberación de fragmentos ultra pequeños de material que tienden a producir muestras más polidispersas mayores al apagarse en el líquido de inmersión 12 , 13 , 14 . En contraste, la ablación del infrarrojo cercano (λ = 1.064 nm) produce un mecanismo de síntesis de abajo hacia arriba dominado por la ablación plasmática 12 . La absorción del láser por el blanco libera electrones que chocan con, y posteriormente liberan, los electrones unidos. Como cOllisions aumentan, el material se ioniza, encendiendo así un plasma. El líquido circundante confina el plasma, aumenta su estabilidad, y aumenta aún más la absorción 12 . A medida que el plasma en expansión se enfría por el líquido de confinamiento, los NPs se condensan con diversas geometrías 4 , 12 , 15 . La elección de la duración del impulso láser puede afectar aún más el proceso de formación NP. Los láseres de pulsos largos de uso frecuente, con duraciones de pulso superiores a unos cuantos picosecondos, incluyen todos los láseres pulsados ​​de mili, micro, nano y algunos picosecondos. En este régimen de anchura de impulso, la duración del impulso del láser es más larga que el tiempo de equilibrio electrón-phonon, que es típicamente del orden de unos cuantos picosegundos 4 , 16 , 17 , 18 , 19. Esto da lugar a la fuga de energía en el medio de ablación circundante ya la formación de NPs por mecanismos térmicos tales como emisión termiónica, vaporización, ebullición y fusión 1 , 20 . La actividad antibacteriana de NPs está fuertemente influenciada por el tamaño de partícula 21 , 22 , 23 , 24 . Con el fin de mejorar la reducción de tamaño y la monodispersidad, los NPs pueden ser irradiados una segunda vez usando un láser de una longitud de onda cerca de la resonancia de plasmón superficial (SPR) de la NP. La radiación láser incidente es absorbida por el NP a través de la excitación del SPR. La fragmentación del NP puede ocurrir por evaporación térmica 25 , 26 o explosión de Coulomb 27 , 28 . La fotoexcitación planteaLa temperatura del NP por encima del punto de fusión, dando como resultado el desprendimiento de la capa externa de la partícula. Se ha demostrado que la adición de agentes como la polivinilpirrolidona (PVP) o el dodecilsulfato de sodio (SDS) a la solución puede mejorar en gran medida los efectos post-irradiación [ 5] . El impacto de la adición de varios solutos se ha descrito en varios informes 1 , 4 , 6 . La facilidad de manipulación de las características NP por PLAL proporciona un nuevo método para desarrollar nuevos antimicrobianos basados ​​en NP.

<table><tbody><tr><td>Láser Nd:YAG de nanosegundos</td><td>Ekspla</td><td>NL303</td><td></td></tr><tr><td>Platina de escaneo xy motorizada</td><td>Espectrofotómetro</td> UV-VIS Standa <td>8MTF</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>Cary 60</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de dispersión de luz dinámica</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer ZS 90</td><td></td></tr><tr><td>Microbalanza</td><td>Maktek</td><td>TM 400</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Zeiss</td><td>EM 902</td><td></td></tr><tr><td>Blanco de lámina de plata</td><td>Alfa Aesar</td><td>12127</td><td></td></tr><tr><td>Lente de distancia focal de 250 mm</td><td>Edmund Optics</td><td>69-624</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas TEM de cobre</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>Cu-400LD</td><td>Rejilla recubierta de encaje/película delgada</td></tr><tr><td>E. coli MG1655</td><td>ATCC</td><td>47076</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptona</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td></td></tr><tr><td>Disco de acero inoxidable (para la etapa de ablación)</td><td>Metal Remnants, Inc.</td><td>N/A</td><td>1,5 pulgadas de diámetro, calibre 16</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540G</td><td></td></tr><tr><td>Barra agitadora magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57</td><td></td></tr><tr><td>Placa agitadora magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49SH</td><td></td>Medidor láser de</tr><tr><td>energía y potencia</td><td>Cinta</td> de carbono <td>1098579</td><td></td>coherente</tr><tr><td></td><td>Shinto Chemitron Co. Ltd.</td><td>Cinta STR Baño</td><td></td></tr><tr><td>de agua sónico</td><td>Branson</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Compresor de aire</td><td>GMC</td><td>Syclone 3010</td><td>Para el secado Objetivo de ablación</td></tr><tr><td>Lente de distancia focal de 75 mm</td><td>Edmund Optics</td><td>34-096 Lente de</td><td>enfoque para post-irradiación</td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo</td><td>Precision Cells Inc</td><td>21UV40</td><td>Trayectoria de luz de 50 mm (para post-irradiación)</td></tr><tr><td>Kanamicina</td>Microscopio óptico <td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>50i</td><td>Este microscopio se utiliza para enfocar el láser en la etapa de ablación. Este modelo en particular ya no está disponible, pero cualquier microscopio óptico con un objetivo 4X funcionará.</td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>AmScope</td><td>MT5000-CCD</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de micrómetro</td><td>Ted Pella</td><td>2280-70</td><td></td></tr></tbody></table>

producción de nanopartículas metálicas por ablación por láser pulsado en líquidos: una herramienta para estudiar las propiedades antibacterianas de las nanopartículas

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

La aparición de bacterias resistentes a múltiples fármacos es una preocupación clínica global que lleva a algunos a especular sobre nuestro regreso a una era &quot;pre-antibióticos&quot; de la medicina. Además de los esfuerzos para identificar nuevos fármacos antimicrobianos de moléculas pequeñas, ha existido un gran interés en el uso de nanopartículas de metal como revestimientos para dispositivos médicos, vendajes de heridas y envases de consumo, debido a sus propiedades antimicrobianas. La gran variedad de métodos disponibles para la síntesis de nanopartículas da como resultado un amplio espectro de propiedades químicas y físicas que pueden afectar la eficacia antibacteriana. Este manuscrito describe el método pulsátil de ablación con láser en líquidos (PLAL) para crear nanopartículas. Este enfoque permite el ajuste fino del tamaño, la composición y la estabilidad de las nanopartículas utilizando métodos de post-irradiación, así como la adición de tensioactivos o excludentes de volumen. Mediante el control del tamaño de partícula y la composición, una amplia gama de propiedades físicas y químicas de nanopa de metalSe pueden explorar los ritos que pueden contribuir a su eficacia antimicrobiana abriendo así nuevas vías para el desarrollo antibacteriano.

Usando dianas de plata, se generan los parámetros láser descritos anteriormente y SDS 60 mM en el líquido de ablación, NPs de plata con la característica de absorbancia UV-VIS en el SPR ( Figura 2A ). Las mediciones TEM y DLS revelan un diámetro medio de NP de aproximadamente 25 nm antes de la irradiación posterior ( Figura 2B ). La ablación del blanco de plata durante 30 min produce típicamente una concentración de NP de 200 m...

Las propiedades antimicrobianas de los metales como el cobre y la plata se han reconocido durante siglos. Este protocolo describe la ablación por láser pulsada en líquidos, un método de sintetizar nanopartículas de metal que proporciona la capacidad de afinar las propiedades de estas nanopartículas para optimizar sus efectos antimicrobianos.

Producción de nanopartículas metálicas por ablación por láser pulsado en líquidos: una herramienta para estudiar las propiedades antibacterianas de las nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

El objetivo general de este procedimiento es producir coloides de nanopartículas con control sobre su tamaño y composición, con el fin de evaluar sus propiedades antibacterianas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo de nanopartículas antimicrobianas, incluyendo el impacto de características específicas de las nanopartículas, como tamaño, forma y composición, sobre la toxicidad. La principal ventaja de esta técnica es la producción sencilla de nanopartículas a partir de diversos sistemas de materiales, realizada en ausencia de subproductos químicos potencialmente peligrosos.Matthew Ratti, un estudiante de pregrado, y Julianne Griepenburg, un miembro del personal docente en Rutgers Camden, demostrarán este experimento. Arme el aparato de ablación colocando una barra magnética de agitación y una etapa porosa de ablación dentro de un vaso de precipitados de vidrio de 50 mililitros. Coloque el vaso de precipitados sobre una placa magnética de agitación y sitúe la placa sobre una etapa de traslación XY para permitir el movimiento del objetivo durante la ablación.Configure el láser Nd:YAG para que funcione en la longitud de onda fundamental de 1.064 nanómetros, con una duración de pulso de cinco nanosegundos y una frecuencia de repetición de 10 hercios. Mida la energía por pulso con un medidor de potencia y energía láser. Enfoque el haz debajo del blanco en la etapa de ablación utilizando una lente convergente de longitud focal de 250 milímetros.Para la síntesis de nanopartículas de plata, primero pese un blanco plano de plata utilizando una microbalanza para obtener la masa previa a la ablación. Luego, adhiera el blanco de plata al soporte poroso utilizando cinta de carbono de doble cara. Añada 40 mililitros de líquido de ablación al vaso de precipitados.La altura del líquido sobre el objetivo es de 11 milímetros. Determine el tamaño del punto ablandando el objetivo de plata con varios pulsos láser. Para medir el tamaño del punto, observe el objetivo ablacionado junto con una regla micrométrica en un microscopio óptico equipado con una cámara CCD.Para sintetizar las nanopartículas de plata, mueva la platina motorizada controlada por computadora en un patrón elíptico a una velocidad de 0,42 centímetros por segundo bajo agitación constante y ablate el blanco durante 20 a 40 minutos. Recoja la solución de nanopartículas del vaso de precipitados mediante decantación. Confirme la presencia de nanopartículas midiendo sus espectros de luz ultravioleta-visible.Mida el diámetro hidrodinámico de las nanopartículas utilizando dispersión dinámica de luz, diluyendo la solución de nanopartículas de 1 a 40 en la solución de ablación. Se requiere un volumen total de un mililitro de la solución diluida cuando se utiliza una cubeta de plástico de un centímetro. Utilizando un ángulo de medición de 180 grados, mida la dispersión de luz a una longitud de onda de 633 nanómetros para determinar el diámetro de las nanopartículas según la ecuación de Stokes-Einstein.Confirme el tamaño y la forma de las nanopartículas mediante microscopía electrónica de transmisión diluyendo primero la solución de nanopartículas de 1 a 40 en agua doblemente destilada para eliminar cualquier aditivo en exceso que pueda interferir con la obtención de imágenes. Luego, coloque dos microlitros de la solución sobre una rejilla de cobre para MET previamente recubierta con una película delgada de carbono Lacey. Seque la rejilla durante la noche a temperatura ambiente bajo vacío en un desecador antes de obtener imágenes de las nanopartículas según se indica en el protocolo del texto.Para calcular la concentración de nanopartículas, desprenda cualquier nanopartícula débilmente adherida del blanco metálico ablacionado colocando el blanco en un baño ultrasónico con agua destilada durante un minuto. Seque el blanco bajo una corriente de aire comprimido durante un minuto. Luego, mida la masa del blanco en una microbalanza.Diluya las nanopartículas hasta una concentración máxima de 100 microgramos por mililitro en la misma solución de ablación. Transfiera de 15 a 17 mililitros de las nanopartículas diluidas a una cubeta de cuarzo que contenga una barra de agitación. Utilice un sistema láser de Nd-YAG para generar pulsos láser de 25 picosegundos y 532 nanómetros.Asimismo, utilice un objetivo con una longitud focal de 75 milímetros para enfocar el láser en el centro de la solución. Irradie la solución durante 30 minutos hasta varias horas, dependiendo del tamaño deseado. Para medir las propiedades antibacterianas de las nanopartículas, primero cultive cultivos de E.coli durante la noche y luego dilúyalos hasta una densidad óptica de 0,01 en LB fresco. Si las nanopartículas se sintetizaron en un medio de ablación que contiene aditivos, añada el producto químico respectivo al LB, de modo que la concentración permanezca constante al agregar las nanopartículas.A continuación, agregue las nanopartículas a los cultivos diluidos en concentraciones que varían desde cero hasta 50 microgramos por mililitro. Incube los cultivos con agitación a 37 grados Celsius durante dos horas adicionales. Tras la incubación de dos horas, diluya seriamente las muestras de cultivo uno a diez en LB fresco y aplique gotas de 10 microlitros de cada dilución sobre placas de agar LB.Una vez que las gotas hayan sido absorbidas, incubar las placas durante la noche a 37 grados Celsius. A la mañana siguiente, contar las unidades formadoras de colonias. Aquí, las nanopartículas producidas por ablación con láser pulsado en líquidos se caracterizan mediante sus espectros de absorción.El espectro de luz ultravioleta visible de las nanopartículas de plata muestra un pico característico en la longitud de onda de resonancia del plasmón superficial de 400 nanómetros. Para caracterizar aún más las nanopartículas, se mide su distribución de tamaño mediante microscopía electrónica de transmisión. Tratar bacterias, como E.coli, con nanopartículas reduce la viabilidad, según se determina midiendo las unidades formadoras de colonias.Las células fueron tratadas con kanamicina como control positivo. Tenga en cuenta que las células que no recibieron nanopartículas de plata se cultivaron en presencia de SDS seis milimolar para asegurar que los tensioactivos no provocaran toxicidad de forma independiente. Una vez dominada la técnica, las nanopartículas pueden producirse y caracterizarse en cuatro a cinco horas.La evaluación de la toxicidad antibacteriana de las nanopartículas requiere 24 horas adicionales. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la consistencia entre lotes exige una atención cuidadosa a los detalles, como la energía del pulso y la posición del lente. No olvide que este trabajo puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso adecuado de protección ocular, durante la realización de este procedimiento.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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Bioengineering

Bioingeniería

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Producción de nanopartículas metálicas por ablación por láser pulsado en líquidos: una herramienta para estudiar las propiedades antibacterianas de las nanopartículas

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