La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

El objetivo general de este protocolo es identificar un epítopo lineal de células B reconocido por un anticuerpo monoclonal mediante proteínas recombinantes truncadas en serie y análisis por escaneo de péptidos mediante hibridación en punto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la interacción molecular entre el antígeno y el anticuerpo. Las principales ventajas de esta técnica son su simplicidad y eficiencia.

El epítopo identificado puede utilizarse posteriormente en investigaciones más completas, como en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. El procedimiento será demostrado por Chien-Wen Chen, un posdoctorado de mi laboratorio. Para comenzar, cultive células híbridas monoclonales RGM56 de ratón en un medio libre de suero híbrido.

Mantenga los cultivos celulares en matraces T de 175 a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Después de cinco días de incubación, recoja el medio de cultivo una vez que haya adquirido un color amarillo y centrifugue el sobrenadante a 4.500 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, deseche el sedimento de restos celulares para obtener el anticuerpo en solución.

A continuación, agregue dos mililitros de una suspensión al 50% de proteína G a una columna de cinco mililitros y equilibre la resina con 10 mililitros de PBS frío con hielo, lo que equivale a 10 volúmenes de resina precargada. Aplique 200 mililitros de la solución de anticuerpo previamente preparada sobre la columna equilibrada y deseche la fracción que atraviesa la columna. Lave la columna dos veces usando 10 mililitros de PBS frío con hielo.

Finalmente, para eluir el anticuerpo de la resina, añada 10 mililitros de solución de glicerina milimolar a pH 2,7 a la columna. Recoja fracciones de 900 microlitros en tubos de microcentrifugado previamente llenos con 100 microlitros de tampón de neutralización 10X. Almacene el anticuerpo purificado en solución de glicerol al 50 % suplementada con azida sódica a menos 20 grados Celsius.

Prepare los constructos y transforme células E.coli BL21 según se describe en el protocolo escrito. Luego, transfiera una colonia individual a un tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros de caldo LB suplementado con 100 microgramos por mililitro de ampicilina y tape el tubo de forma no hermética. Incube el cultivo a 37 grados Celsius con agitación a 150 RPM.

Monitore la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros. Cuando alcance aproximadamente 0,6, enfríe el cultivo a 25 grados Celsius. Luego, agregue IPTG a una concentración final de 0,4 milimolar para inducir la expresión de la proteína recombinante.

Incube la cultura durante otras cuatro horas a 25 grados Celsius con agitación de 200 RPM. Después de la incubación, transfiera un mililitro de la cultura bacteriana a un tubo de microcentrifugado. Centrifugue las células a 12.000 ×g durante un minuto y deseche el sobrenadante.

Pipetee hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta y resuspenda el botón celular en 100 microlitros de tampón de desnaturalización. Mezcle la suspensión resultante mediante vortexado enérgico para obtener una muestra lista para usar de proteína recombinante. Para continuar con la hibridación en punto, disuelva cada péptido sintético en DMSO para obtener soluciones de 10 miligramos por mililitro.

Luego, active la membrana de PVDF en metanol durante dos minutos y equilibre con tampón Towbin modificado durante otros dos minutos. Enjuague un trozo de papel de cromatografía con tampón Towbin modificado y coloque la membrana de PVDF equilibrada sobre él. Deje reposar la membrana hasta que el tampón desaparezca de su superficie.

Utilizando una punta de 10 microlitros, agregue dos microlitros de cada muestra de péptido o proteína recombinante sobre la membrana y deje secar al aire durante 10 minutos. Colocar un símbolo sobre la membrana es el paso más crítico en este protocolo. Cargar una cantidad precisa de muestra en un área pequeña de la membrana de PVDF requiere una atención cuidadosa.

A continuación, bloquee la membrana en tampón TBST suplementado con leche descremada al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Diluya el anticuerpo monoclonal RGM56 en tampón TBST suplementado con leche descremada al 5%. Y agregue la solución de anticuerpo a la membrana.

Incube la membrana a 37 grados Celsius durante una hora con agitación suave. Después de la incubación, retire la solución de anticuerpo y lave la membrana dos veces con tampón TBST durante cinco minutos con agitación suave.

Luego, añada a la membrana la solución del anticuerpo secundario diluido en tampón TBST con leche descremada al 5%. Incube la membrana durante una hora a 37 grados Celsius con agitación suave. Tras la incubación, deseche la solución de anticuerpo y lave la membrana en tampón TBST dos veces durante cinco minutos con agitación suave.

Luego, desarrolle la membrana con la solución de sustrato a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad. Cuando aparezca la señal, detenga la reacción lavando la membrana con agua doblemente destilada. Después de secar la membrana al aire, capture la imagen del dot blot mediante un sistema de imágenes.

Finalmente, mediante el uso de un software de análisis de imágenes, mida la intensidad de cada punto del inmunotransferencia sobre tira. Se presenta aquí la proteína completa del virus de la necrosis nerviosa, que comprende los aminoácidos del uno al 338, junto con sus variantes truncadas en forma serial. Para confirmar la expresión de las proteínas en las células bacterianas transformadas, se realizó un análisis por inmunotransferencia sobre tira utilizando un anticuerpo anti-6XHis, lo que mostró la presencia de todas las proteínas bajo estudio.

Luego, las proteínas recombinantes se analizaron mediante hibridación en punto, utilizando el anticuerpo monoclonal RG-M56. El análisis reveló que el epítopo proteico reconocido por el anticuerpo se encuentra en el péptido 195 a 338. Finalmente, se identificó un epítopo compuesto por 20 u ocho residuos de aminoácidos mediante escaneo de péptidos.

El escaneo con alanina mostró que las sustituciones de residuos de valina en las posiciones 197 y 199, así como una cisteína en la posición 201, abolieron la capacidad de unión del epítopo y la hibridación en inmunotransferencia sobre membrana. De manera similar, se observó una afinidad de unión disminuida en el análisis de intensidad de unión, lo que confirma que los residuos identificados son esenciales para la unión del epítopo al anticuerpo monoclonal RGM56. Esta técnica de identificación de péptidos puede utilizarse para desarrollar fármacos terapéuticos peptídicos o medicamentos peptídicos.