El uso de biosensores basados ​​en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con Alzheimer

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios tónicos y fásicos en el glutamato extracelular in vivo utilizando matrices de microelectrodos ligados a enzimas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como si los niveles de neurotransmisores extracelulares y la dinámica rápida de la liberación y eliminación de neurotransmisores están alterados en los estados de enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que las matrices de microelectrodos pueden medir cambios específicos en los neurotransmisores dentro de regiones discretas del cerebro, lo que lo convierte en un enfoque espacial y temporalmente preciso a la vez que mínimamente invasivo.

Holly Hunsberger y Ryan Heslin de mi laboratorio harán una demostración del procedimiento. Para comenzar este procedimiento, cubra un par de sitios de registro en un MEA con la enzima deseada y un par diferente de sitios de registro con la matriz de proteína inactiva. A continuación, extraiga la glutamato oxidasa o la matriz de proteínas con una jeringa Hamilton de 10 microlitros.

Presione suavemente el émbolo para dispensar una pequeña gota de solución en la punta de la jeringa. Para apuntar a los sitios de registro de MEA, bajo un microscopio de disección, aplique la solución a los sitios de registro apropiados contactando brevemente los sitios de registro con la gota de solución, que representa una capa. Configure un temporizador de un minuto entre las aplicaciones de recubrimiento y los sitios de grabación.

Ahora, coloque el electrodo de referencia a través de la abertura en el brazo de plástico. Baje el electrodo de referencia en un vaso de precipitados que contenga PBS y asegúrese de que no entre en contacto con la parte inferior del vaso de precipitados. A continuación, conecte el electrodo de referencia a la platina principal y conecte el MEA al mPD chapado en la platina principal.

Baje el MEA en el vaso de precipitados de la solución de modo que solo la punta del MEA quede sumergida en la solución. No sumerja la punta de MEA en líquido más allá de la burbuja negra. Si lo hace, puede dañar el MEA.

A continuación, seleccione el icono de galvanoplastia en el escritorio. En el menú de la herramienta de galvanoplastia, verifique que se hayan ingresado los ajustes correctos. Luego, seleccione el software de salida para finalizar la galvanoplastia.

Enjuague las puntas de los electrodos chapados en mPD con agua desionizada y guárdelas durante 24 horas antes de calibrar. En este procedimiento, encienda una almohadilla térmica a 37 grados centígrados y conecte la platina principal al sistema de control de grabación. A continuación, inserte la punta de MEA en 40 mililitros de PBS 0,5 molar agitado.

A continuación, conecte el electrodo de referencia a la platina principal. Mueva la punta del electrodo de referencia para asegurarse de que no haya burbujas de aire. Después de eso, abra el programa de grabación, asegúrese de que la configuración sea correcta, elija el número MEA, haga clic en Calibración y presione iniciar.

Espere de cinco a 10 minutos para el equilibrio y comience la calibración una vez que la línea de base se haya estabilizado. A continuación, seleccione Línea base y agregue 500 microlitros de ácido ascórbico. A continuación, seleccione Interferente una vez que la corriente haya alcanzado una nueva meseta estable.

Si el MEA está correctamente galvanizado, no se debe observar ningún cambio. A continuación, añade 40 microlitros de L-glutamato de 20 milimolares. Una vez que la corriente haya alcanzado una nueva meseta estable, marque la primera adición como analito.

Repita tres veces para un total de tres adiciones de glutamato. A continuación, añade 40 microlitros de dopamina. Y seleccione Sustancia de prueba.

Posteriormente, añade 40 microlitros de peróxido. Seleccione Sustancia de prueba y haga clic en el botón de parada una vez finalizada la calibración. En este paso, coloque la micropipeta en el centro entre los cuatro sitios de grabación de platino y móntela de 50 a 100 micrómetros por encima del MEA con cera pegajosa y arcilla para modelar.

Con un adaptador de CC, sujete el cable positivo rojo al cable plateado preparado en el lado del pin dorado y sujete el cable negativo negro al cátodo de baño de platino. A continuación, conecte el adaptador de CC y busque el proceso de enchapado correcto. Deben aparecer burbujas en el electrodo de baño y el electrodo de referencia debe volverse de un color gris plateado.

En este procedimiento, coloque al animal en el dispositivo estereotáxico y use las barras de los oídos para estabilizar su cabeza. Asegúrese de que el animal esté asegurado y que la cabeza no se mueva. Luego, aplique el ungüento para los ojos con un aplicador de algodón estéril.

Después de eso, afeita la cabeza con una recortadora. Y retire el pelaje cerca de las orejas con unas tijeras quirúrgicas pequeñas. Posteriormente, aplique yodo y luego alcohol en el cuero cabelludo tres veces alternativamente.

Después de esto, haga una incisión en el medio del cuero cabelludo y extienda la piel. Absorba la sangre con una punta de algodón estéril y aplique peróxido de hidrógeno para facilitar la aparición de bregma y lambda. Asegúrese de que la cabeza esté correctamente colocada midiendo la dorsal-ventral y la medial-lateral de bregma y lambda.

Establezca las coordenadas en bregma a cero y marque las coordenadas de destino. A continuación, perfore alrededor de la marca. Después, fije el MEA a la etapa principal.

Vuelva a llenar la pipeta con la primera solución deseada. Asegúrese de dejar un espacio en la pipeta sin solución para que se pueda examinar la solución que se está expulsando. A continuación, conecte el tubo a la micropipeta de vidrio.

Encuentre bregma con el MEA adjunto y establezca las coordenadas en cero. Mueva el MEA a las coordenadas deseadas y baje lentamente el MEA hasta que la punta toque el cerebro. A continuación, ponga a cero la coordenada dorsal-ventral y luego baje lentamente el MEA al cerebro.

Coloque el electrodo de referencia en una ubicación remota del MEA, de modo que todavía esté en contacto líquido con el cerebro para completar el circuito. En el programa de grabación, haga clic en el electrodo calibrado deseado y luego haga clic en realizar experimento para comenzar a grabar. Después de obtener una línea de base estable, ajuste el eyector de presión a 0.6 segundos y 0.5 psi y presione el botón rojo en el eyector de presión para expulsar.

Registre el tiempo y la presión, así como los tics de volumen movidos en la hoja de inyección y tome notas si es necesario. Después de eso, retire el MEA con la micropipeta conectada, enjuáguelo con agua desionizada y sumérjalo en PBS durante la noche hasta que desaparezca toda la sangre. En las regiones CA3 y CA1 del hipocampo, los niveles de glutamato tónico aumentaron significativamente en los ratones TauP301L tratados con el vehículo, un efecto atenuado por el tratamiento con riluzol.

Aquí, los registros representativos de referencia de la liberación de glutamato evocado por cloruro de potasio en el CA3 mostraron que el tratamiento con riluzol atenuó el aumento significativo en la amplitud de la liberación de glutamato observado en los ratones Vehicle-TauP301L. La aplicación local de cloruro de potasio produjo un aumento robusto de glutamato extracelular que volvió rápidamente a niveles tónicos. El aumento significativo del cloruro de potasio evocó la liberación de glutamato en los DG, CA3 y CA1 observados en los ratones TauP301L tratados con el vehículo después de la aplicación local de cloruro de potasio se atenuó con el tratamiento con riluzol.

Esta sección del hipocampo teñida de violeta cresilo confirma la ubicación de huellas de MEA en CA3 y CA1. Al intentar este procedimiento, es importante recordar los pasos de solución de problemas enumerados en el manuscrito. Por ejemplo, para reducir las señales ruidosas, recuerde conectar a tierra el sistema y seguir los pasos de manera oportuna.