Name: El uso de biosensores basados en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con Alzheimer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprende a medir glutamato tónico y fásico en el hipocampo de ratones transgénicos TauP301L usando matrices de microelectrodos enzimáticos. Este método minimamente invasivo permite monitorear alteraciones del neurotransmisor en modelos de enfermedad de Alzheimer.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Asociación de Alzheimer (MNR; NIRG-12-242187), WVU Facultad de Investigación del Senado Grant (MNR), y WVU PSCOR Subvención (MNR).

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GG es el único propietario de Quanteon, LLC que hace que el sistema de grabación-16 RÁPIDO utilizado para las mediciones de glutamato en este estudio. JEQ es un consultor pagado por Quanteon.

La técnica MEA permite la medición de la cinética rápida de la liberación de neurotransmisores y la absorción in vitro e in vivo. Por lo tanto, la tecnología produce una amplia variedad de salida de datos incluyendo los niveles de neurotransmisores tónicas, la liberación de neurotransmisores evocada, y el aclaramiento del neurotransmisor. Sin embargo, ya que el uso de los AMA es un procedimiento relativamente complejo, existen numerosos factores que pueden necesitar ser optimizado para el uso con éxito...

La medición de las alteraciones de neurotransmisores en el cerebro es una herramienta esencial para los neurocientíficos que estudian las enfermedades del sistema nervioso central (SNC) que a menudo se caracteriza por la desregulación del neurotransmisor. Aunque microdiálisis en combinación con cromatografía líquida de alta presión (HPLC / CE) ha sido el método más ampliamente utilizado para medir cambios en los niveles de neurotransmisores extracelulares 1, 2, 3, 4, la resolución espacial y temporal de las sondas de microdiálisis puede no ser ideal para los neurotransmisores , tales como glutamato, que están estrechamente regulada en el espacio extracelular 5, 6. Debido a los recientes avances en la genética y la formación de imágenes, hay métodos adicionales que se pueden utilizar para mapear glutamato in vivo. Uso de reporteros fluorescentes glutamato codificados genéticamente (iGluSnFR) unad de dos fotones de formación de imágenes, los investigadores son capaces de visualizar la liberación de glutamato por las neuronas y astrocitos tanto in vitro como in vivo 7, 8, 9. En particular, esto permite la grabación de un campo de visión más amplio y no interrumpe las conexiones intrínsecas del cerebro. Aunque estas nuevas técnicas ópticas permiten la visualización de la cinética de glutamato y la medición de respuestas evocadas sensoriales y la actividad neuronal, que carecen de la capacidad de cuantificar la cantidad de glutamato en el espacio extracelular en regiones discretas del cerebro. Un método alternativo es la matriz de microelectrodos ligado a enzimas (MEA) que puede medir selectivamente niveles de neurotransmisores extracelulares, tales como el glutamato, a través del uso de un esquema de registro por sí mismo se hace referencia. La técnica MEA se ha utilizado para estudiar las alteraciones en el glutamato extracelular siguientes cerebral traumáticalesión 10, 11, 12, el envejecimiento 13, 14, la tensión 15, 16, epilepsia 17, 18, enfermedad de Alzheimer 19, 20, y la inyección de un viral imitador 21 y representa una mejora sobre las limitaciones espaciales y temporales inherentes a microdiálisis. Mientras que microdiálisis restringe la capacidad de medir cerca de la sinapsis 22, 23, AAM tienen una alta resolución espacial que permite medidas selectivas de desbordamiento de glutamato extracelular cerca de sinapsis 24, 25. En segundo lugar, la resolución temporal baja de microdiálisis (1 - 20 min) limita la capacidad para investigar ladinámica rápida de la liberación de glutamato y el aclaramiento que se producen en la milésima de segundo a segundo rango 26. Debido a las diferencias en la liberación o el aclaramiento de glutamato pueden no ser evidentes en las medidas de tónico, descansando los niveles de glutamato, puede ser esencial que la liberación de glutamato y el aclaramiento medirse directamente. MEAs permiten para tales medidas debido a su alta resolución temporal (2 Hz) y bajos límites de detección (&lt;1 m). En tercer lugar, los AMA permiten examen de las modificaciones subregionales de neurotransmisores dentro de una región particular del cerebro, tales como el hipocampo de rata o de ratón. Por ejemplo, usando MEAs podemos dirigir por separado el giro dentado (DG), Cornu ammonis 3 (CA3) y Cornu ammonis 1 (CA1) del hipocampo, que están conectados a través de un circuito de trisynaptic 27, para examinar las diferencias subregionales en glutamato extracelular. Debido al tamaño de las sondas de microdiálisis (1 - 4 mm de longitud) y los daños causados por la implantación 28 &lt;/ sup&gt;, 29, las diferencias subregionales son difíciles de tratar. Además, los sistemas ópticos sólo permiten la estimulación a través de estímulos externos, tales como una estimulación de la barba o parpadeo de la luz, que no permite la estimulación subregional 7. Un beneficio final de los AMA sobre otros métodos es la capacidad para estudiar estas subregiones in vivo sin interrumpir sus conexiones extrínsecos e intrínsecos. A continuación, describimos cómo un sistema de grabación (por ejemplo, FAST16mkIII) en combinación con AAM, que consta de un microelectrodo de múltiples sitios a base de cerámica, se puede recubrir de forma diferencial en los sitios de registro para permitir a los agentes de interferencia para ser detectado y eliminado de la señal de analito. También demostramos estas matrices se pueden utilizar para los estudios basados en Amperometry de regulación de glutamato in vivo dentro de la DG, CA3, CA1 del hipocampo y subregiones de anestesiado RTG (TauP301L) 4510 ratones, un m comúnmente utilizadoouse modelo de la enfermedad de Alzheimer. Además, proporcionamos confirmación de la sensibilidad del sistema de MEA a la dinámica rápida de la liberación de glutamato y el aclaramiento mediante el tratamiento de los ratones con riluzol, un fármaco se muestra in vitro para disminuir la liberación de glutamato y aumentar la captación de glutamato 30, 31, 32, 33, y la demostración de estos respectivos cambios en vivo en el modelo de ratón TauP301L.

<table><tbody><tr><td>FAST-16mkIII-8 canal</td><td>Quanteon</td><td>16mkIII</td><td></td></tr><tr><td>Matrices de microelectrodos</td><td>CenMet</td><td>W4 o 8-TRK</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-3059</td><td>10 g (caduca después de 1 mes)</td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-6257</td><td>100 mL (caduca a los 6 meses)</td></tr><tr><td>Glutamato oxidasa</td><td>US Biological o Sigma Aldrich</td><td>G4001-01 o 100646</td><td>50 UI (caduca a los 6 meses)</td></tr><tr><td>Jeringas Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>#80383</td><td>2 jeringas</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>UN1230</td><td>4 L</td></tr><tr><td>clorhidrato de m-fenilendiamina (mPD)</td><td>ACROS Organics</td><td>1330560250</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Electrodos de referencia (RE-5B)</td><td>BAS</td><td>MF-2079</td><td>3 electrodos</td></tr><tr><td>Alimentado por batería Magnético placa de agitación</td><td>Cole-parmer</td><td>EW-04804-01</td><td>Se puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1626</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>TCI</td><td>50-81-7</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Clorhidrato de dopamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>62-31-7</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Ácido perclórico</td><td>VWR</td><td>UN2920</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Cloruro de postásico</td><td>VWR</td><td>7447-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>VWR</td><td>7647-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>MP</td><td>153502</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>BDH</td><td>1310732</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Pipetas de expulsión a presión de vidrio</td><td>CenMet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera pegajosa</td><td>Kerrlab</td><td>625</td><td>Se puede comprar a diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Microjeringa</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Arcilla para modelar</td><td>WalMart</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de AM de alambre de plata</td><td></td><td>#786500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>BDH</td><td>7647010</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Alambre de platino</td><td>AM Systems</td><td>778000</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de soldadura</td><td>Lowes o Home Depot</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Multímetro</td><td>WalMart</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Dispositivo</td> <td>estereotáxicoStoelting</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Digital Lab Standard</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Meiji Microscopio EMZ</td><td>Meiji</td><td>EMZ-5</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Dremel</td><td>Micro</td><td></td></tr><tr><td>Metricide</td><td>Metrex</td><td>102800</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>VWR</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Tijeras de cirugía</td><td>VWR</td><td></td><td>Se pueden comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón estériles</td><td>Puritan</td><td>25806</td><td>Se pueden comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Ungüento para los ojos</td><td>Puralube Ungüento para veterinarios Obtener</td><td></td><td>del veterinario</td></tr><tr><td>Hisopos de yodo</td><td>VWR</td><td>S48050</td><td>Se pueden comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Hisopos con alcohol Farmacia</td><td>local</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Cortina de cirugía estéril</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Solución salina estéril</td><td>Teknova</td><td>S5815</td><td>Puede hacer su propia solución usando filtros</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (3%)</td> <td>Farmacia</td><td></td> local <td>Puede comprar de diferentes proveedores</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>WalMart</td><td></td><td>Puede comprar de diferentes proveedor</td></tr></tbody></table>

el uso de biosensores basados ​​en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con alzheimer

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

alteración de neurotransmisores es a menudo un componente clave de las enfermedades del sistema nervioso central (SNC), que juega un papel en la patología subyacente de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, la depresión y la ansiedad. Tradicionalmente, microdiálisis ha sido la técnica más común (alabado) para examinar los cambios de neurotransmisores que se producen en estos trastornos. Pero debido a microdiálisis tiene la capacidad de medir cambios lentos 1-20 minutos a través de grandes áreas de tejido, tiene la desventaja de invasividad, potencialmente destruyendo conexiones intrínsecas dentro del cerebro y una capacidad de muestreo lento. Una técnica relativamente nueva, la matriz de microelectrodos (MEA), tiene numerosas ventajas para la medición de cambios de neurotransmisores específicos dentro de las regiones discretas del cerebro que se producen, lo que para un enfoque espacial y temporalmente precisa. Además, utilizando los AMA es mínimamente invasiva, permitiendo para la medición de las alteraciones de neurotransmisores en vivo. En nuestro laboratorio, HÅHe sido específicamente interesados ​​en los cambios en el neurotransmisor, glutamato, relacionado con la patología de la enfermedad de Alzheimer. Como tal, el método descrito aquí se ha utilizado para evaluar posibles perturbaciones del hipocampo en glutamato en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer. Brevemente, el método utilizado consiste en el recubrimiento de un microelectrodo multi-sitio con una enzima muy selectivo para el neurotransmisor de interés y el uso de sitios de autorreferencia para restar el ruido y los interferentes de fondo. Después de sembrar y de calibración, el MEA puede ser construido con una micropipeta y se baja en la región del cerebro de interés utilizando un dispositivo estereotáxico. Aquí, el método descrito implica anestesiar RTG (TauP301L) 4510 ratones y el uso de un dispositivo estereotáxico para orientar con precisión sub-regiones (DG, CA1 y CA3) del hipocampo.

Mientras que esta tecnología se puede utilizar para medir las alteraciones en la señalización glutamatérgica en muchos tipos de modelos animales, tales como lesión cerebral traumática, el envejecimiento, el estrés y la epilepsia, aquí se demuestra cómo la tecnología MEA puede ser utilizado para examinar alteraciones glutamatérgicas en modelo de ratón transgénico de tauopatía humano 19, 20. El RTG (TauP301L) 4510 ratón expresa la ...

A continuación, describimos la configuración, software de navegación, y el análisis de datos de un método espacial y temporalmente precisa de medir tónico y cambios extracelulares de glutamato fásicas in vivo usando matrices de microelectrodos ligados a enzimas (MEA).

El uso de biosensores basados ​​en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con Alzheimer

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios tónicos y fásicos del glutamato extracelular in vivo mediante matrices de microelectrodos acoplados a enzimas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como si los niveles de neurotransmisores extracelulares y la dinámica rápida de liberación y eliminación de neurotransmisores se alteran en estados patológicos. La principal ventaja de esta técnica es que las matrices de microelectrodos pueden medir cambios específicos de neurotransmisores dentro de regiones cerebrales discretas, lo que la convierte en un enfoque preciso espacial y temporalmente, además de ser mínimamente invasiva.El procedimiento será demostrado por Holly Hunsberger y Ryan Heslin de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, recubra un par de sitios de registro en un MEA con la enzima deseada y un par diferente de sitios de registro con la matriz proteica inactiva. Luego, aspire la glutamato oxidasa o la matriz proteica utilizando una jeringa Hamilton de 10 microlitros.Presione suavemente el émbolo para dispensar una pequeña gota de solución en la punta de la jeringa. Para dirigirse a los sitios de grab

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Transgénicos (Tg) los modelos de ratón de Alzheimer proporcionan una excelente oportunidad para investigar cómo y por qué los niveles de Aß y tau en el cambio CSF ​​conforme progresa la enfermedad en pacientes humanos. Este sentido, demuestran una refinada técnica de punción cisterna magna para el muestreo de LCR de serie del ratón.

Una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón

Una de las características patológicas de la EA es la formación de placas de proteína amiloide β neuríticas positivo. En este protocolo se describen dos métodos de detección de placas neuríticas en ratones transgénicos modelo de AD: la detección inmunohistoquímica utilizando el método ABC y DAB y detección fluorescente utilizando el método de tinción thioflavin S.

La detección de placas neuríticas en el modelo de la enfermedad de Alzheimer ratón

En este video, una matriz de electrodos múltiples (MEA) recubierta con glutamato oxidasa se implanta en el tejido cerebral de un ratón anestesiado. La solución de glutamato se inyecta en el espacio extracelular donde el MEA detecta los niveles de glutamato, lo que permite el seguimiento en tiempo real de la absorción de glutamato por parte de los astrocitos.

Monitorización de glutamato en tiempo real in vivo mediante una matriz de microelectrodos recubierta de enzimas

Se describe aquí un enfoque de detección de comportamiento escalonado que puede usarse para detectar compuestos que exhiben eficacia in vivo en comportamientos motores cognitivos y funcionales en modelos de ratón transgénicos de  beta - amiloidosis y tauopatía. Estos métodos se optimizan para examinar los compuestos para la actividad en tareas de memoria de trabajo y de corto plazo.

Evaluación de la Alternancia Espontánea, el Reconocimiento de Objetos Novelos y la Clasificación de Miembros en Modelos de Ratón Transgénico de la Neuropatología Amiloide-β y Tau

Este documento detalla el uso de grabaciones de potencial fijo amperométrico utilizando electrodos de fibra de carbono y la tecnología de biosensores enzimáticos para medir la liberación de dopamina y glutamato con alta resolución temporal durante el comportamiento natural de gratificante en el hamster hembra.

Medición In Vivo cambios en los neurotransmisores extracelulares durante naturalmente gratificante comportamientos en hámsteres sirios femeninos

Presentamos un protocolo para evaluar el equilibrio entre la liberación de glutamato y el aclaramiento en sinapsis glutamatérgicas corticostriatales en rodajas agudas de ratones adultos. Este protocolo utiliza el sensor fluorescente iGluu para la detección de glutamato, una cámara sCMOS para la adquisición de señal y un dispositivo para la iluminación láser focal.

Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

Aquí presentamos un protocolo para medir los flujos in vitro ca2+ en las neuronas de cerebro medio y sus efectos aguas abajo en la caspasa-3 utilizando cultivos primarios de cerebro medio ratón. Este modelo se puede emplear para estudiar los cambios fisiopatológicos relacionados con la actividad anormal de Ca2+ en las neuronas de cerebro medio, y para detectar nuevas terapias en busca de propiedades anti-apoptóticas.

Cuantificación de los flujos espontáneos de Ca2+ y sus efectos aguas abajo en las neuronas primarias de cerebro medio de ratón

Describimos un protocolo para evaluar las curvas dosis-respuesta para la estimulación extracraneal en términos de medidas del campo eléctrico cerebral y un biomarcador relevante: flujo sanguíneo cerebral. Dado que este protocolo implica la colocación de electrodos invasivos en el cerebro, se necesita anestesia general, y se prefiere la respiración espontánea en lugar de la respiración controlada.

Colocación de electrodos estimulantes extracraneales y medición del flujo sanguíneo cerebral y campos eléctricos intracraneales en ratones anestesiados

Una de las características de la enfermedad de Alzheimer es la elevación de...

Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo

Se establecieron modelos de ratón de leucomalacia periventricular (LPV), la lesión cerebral predominante en los bebés prematuros se caracteriza por lesiones de sustancia blanca periventricular. Hipoxia / isquemia con / sin infección sistémica son las causas principales de la FPV. La ligadura de carótida unilateral y la exposición hipoxia con / sin inyección de lipopolisacárido crea PVL-como lesiones en los ratones P6.

Los modelos de ratón de la Retinopatía

Aprende a medir glutamato tónico y fásico en el hipocampo de ratones transgénicos TauP301L usando matrices de microelectrodos enzimáticos. Este método minimamente invasivo permite monitorear alteraciones del neurotransmisor en modelos de enfermedad de Alzheimer.

El uso de biosensores basados ​​en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con Alzheimer

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