Cribados genéticos
Pantallas genéticas son herramientas críticas para definir funciones de los genes y entendiendo las interacciones del gene. Pantallas implican típicam…
Pantallas genéticas son herramientas importantes para la identificación de genes y mutaciones responsables de fenotipos de interés y para entender cómo los genes funcionan en procesos biológicos. Pantallas se realizan en diversos sistemas modelo, como moscas, gusanos, plantas y cultivo celular y han conducido al descubrimiento de nuevos caminos celulares y potenciales dianas farmacológicas para enfermedades humanas.
Este video proporciona una visión general de los diferentes tipos de pantallas genéticas, explicar dos protocolos generales para pantallas en gusanos nematodos y muestran que algunas pantallas de formas se aplican en los laboratorios de hoy.
En primer lugar, vamos a echar un vistazo a qué pantallas genéticas son y lo que podemos aprender de ellos.
Pantallas genéticas se basan en genética ya sea adelante o atrás. En un avance o "clásica" pantalla genética, las mutaciones son generadas al azar en el ADN de un organismo con la radiación o productos químicos conocidos como mutágenos. Bases adicionales pueden también insertarse en el ADN mediante, por ejemplo, secuencias conocidas como transposones, que pueden integrar en diferentes posiciones dentro del genoma y alterar la función de genes en el cual Inserte. Estos tipos de inserciones se juntan a menudo con los reporteros fluorescentes para habilitar la detección directa de microorganismos mutados. Cuando un mutante para mostrar un fenotipo de interés, el gen desconocido que era transformado se puede traz a un cromosoma y secuenciado.
El enfoque opuesto a la proyección es una pantalla genética inversa, donde los investigadores alteran la expresión de muchos genes candidatos y luego buscan fenotipos mutantes resultantes de estas manipulaciones.
Además de "pérdida de función" mutaciones que alteran la actividad de un gen, pantallas genéticas pueden basarse también en mutaciones "ganancia de función", que causan la expresión de un gen o funcionalidad para aumentar. Esto puede lograrse insertando aleatoriamente elementos regulatorios del gen en el genoma, que conduciría a la sobreexpresión de un gen que se inserta el elemento arriba de.
Alternativamente, en un método llamado "proyección de expresión", los investigadores hacen uso de las bibliotecas de plásmidos que contienen las secuencias de la proteína-codificación de varios genes e introducir en las células los genes donde se expresará muy. Fenotipos resultantes pueden utilizarse entonces para entender la función del gene.
Para descubrir más información acerca de un gen conocido o mutación, pueden usarse filtros de modificador. Una pantalla de supresor comienza con un mutante caracterizado e identifica mutaciones adicionales que el fenotipo mutante menos severa. Una mutación supresora encontró en el mismo gen como la mutación original se denomina "intragénicas," mientras que una mutación supresora en un gen distinto se considera "extragenic."
Por el contrario, pantallas potenciador identifican mutaciones adicionales que aumentan la severidad de un fenotipo mutante. Estos pueden ser útiles para determinar los genes que son redundantes o pueden interactuar funcionalmente. Si la combinación de dos o más mutaciones resultado grave retraso del crecimiento o incluso la muerte, la afección se denomina "enfermedad sintética o letalidad". Una pantalla para las mutaciones letales o enfermas sintético revela genes que funcionan en redundantes, pero esencial, vías biológicas. Esto es especialmente útil, por ejemplo, en la identificación de varios productos génicos que pueden ser objeto simultáneamente con fármacos para destruir las células cancerosas.
Ahora que usted comprende algunas estrategias de cribado genético común, vamos a ver un protocolo general para una pantalla hacia delante en un organismo modelo popular, el gusano del nematodo.
En este ejemplo, mutagénesis química se llevará a cabo con Metanosulfonato de etilo o el ccsme, que funciona mediante la modificación química de nucleótidos de guanina, pudiendo llegar a par inapropiadamente con timina en posteriores rondas de replicación del ADN. Ya que EMS es un mutágeno y carcinógeno posible, debería tratarse sólo al usar una doble capa de guantes y trabajo debe llevarse a cabo en una campana de humos.
Para empezar, gran número de gusanos en la última etapa larvaria es seleccionado, lavado y recogido. EMS se añaden a los gusanos y los gusanos se incuban durante varias horas inducir mutaciones. Después de mutagénesis, EMS debe ser quitado de los gusanos e inactiva con hidróxido de sodio. Gusanos son entonces lavados varias veces en medio de cultivo y revestidos en placas de agar.
Siguiente, sano-mirando gusanos son transferidos a nuevas placas recién sembradas con bacterias como fuente de alimento y permite reproducir. Segunda generación progenie puede ser examinada visualmente para fenotipos mutantes, tales como defectos locomotores.
Ahora, vamos a ir a través de un protocolo para una pantalla de genética reversa en nematodos.
Un enfoque común para efectuar reversas pantallas en gusanos es alimentar a los animales una biblioteca de bacterias expresan ARN bicatenario, uno por cada cepa bacteriana, que se golpea abajo la expresión de un gen candidato cada en los gusanos. Estas bibliotecas están a menudo disponibles en el mercado y pueden ser el cultivadas para su uso en pantallas.
Para empezar, se cultivan solo colonias de bacterias que contiene clones de la biblioteca individual, y se induce la producción de RNA de doble hebra. Culturas son vistas en pocillos distintos de una placa con medio de cultivo de nematodos y deja secar en una campana de humos estéril.
A continuación, gusanos son plateados en las bacterias y permite alimentar en una cámara humidificada durante tres o cuatro días. Rápidamente se pueden observar fenotipos mutantes, en los gusanos originales que colocan en las placas de alimentación, o en la progenie de primera generación.
Ahora que ya has visto cómo hacia adelante y reversas pantallas genéticas se llevan a cabo, vamos a discutir algunas de sus aplicaciones actuales.
Algunas pantallas genéticas se utilizan para ayudar a los científicos a identificar proteínas que interaccionan físicamente o función en la misma vía molecular. En este experimento, los científicos idearon una pantalla basada en microscopía de alto rendimiento para descubrir nuevos receptores transmembranales que activan una molécula de señalización especial. Por overexpressing una variedad de genes en células de riñón embrionario humano que contiene la fluorescencia etiquetada señalización proteínas, fueron capaces de monitor que receptores afectan localización subcelular de la proteína.
Otra aplicación del screening genético es la caracterización de las interacciones entre medicamentos gen. Aquí, una biblioteca de levadura mutada se generó mediante mutagénesis al azar a gran escala con inserciones de transposones. Cada cepa mutante se cultivaba entonces en presencia de una droga. El crecimiento de cada cepa fue cuantificada usando PCR seguida de microarrays o secuenciación análisis para determinar a que mutantes, comparados a los controles unmutated, fueron sensible a la farmacoterapia.
Por último, pantallas permite entender los genes y redes moleculares en la enfermedad humana. Los investigadores de este experimento cultivan neuronas en presencia de virus de RNA-codificación precipitación expresión de muchos genes diferentes. Análisis automatizado de células immunostained entonces fue utilizado para revelar genes que influyen en las propiedades físicas de las neuronas, como consecuencia del neurite. Este enfoque con éxito ha identificado genes implicados en enfermedades neurodegenerativas.
Sólo haya visto video en pantallas genéticas de Zeus, una poderosa técnica para descubrir los genes implicados en procesos biológicos fundamentales. En este video repasamos algunos tipos principales de pantallas genéticas, protocolos generales para llevar a cabo ambos adelante y reversa pantallas y discutieron cómo se aplican estos métodos en los laboratorios de hoy. ¡Gracias por ver!
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Pantallas genéticas son herramientas importantes para la identificación de genes y mutaciones responsables de fenotipos de interés y para entender cómo los genes funcionan en procesos biológicos. Pantallas se realizan en diversos sistemas modelo, como moscas, gusanos, plantas y cultivo celular y han conducido al descubrimiento de nuevos caminos celulares y potenciales dianas farmacológicas para enfermedades humanas.
Este video proporciona una visión general de los diferentes tipos de pantallas genéticas, explicar dos protocolos generales para pantallas en gusanos nematodos y muestran que algunas pantallas de formas se aplican en los laboratorios de hoy.
En primer lugar, vamos a echar un vistazo a qué pantallas genéticas son y lo que podemos aprender de ellos.
Pantallas genéticas se basan en genética ya sea adelante o atrás. En un avance o "clásica" pantalla genética, las mutaciones son generadas al azar en el ADN de un organismo con la radiación o productos químicos conocidos como mutágenos. Bases adicionales pueden también insertarse en el ADN mediante, por ejemplo, secuencias conocidas como transposones, que pueden integrar en diferentes posiciones dentro del genoma y alterar la función de genes en el cual Inserte. Estos tipos de inserciones se juntan a menudo con los reporteros fluorescentes para habilitar la detección directa de microorganismos mutados. Cuando un mutante para mostrar un fenotipo de interés, el gen desconocido que era transformado se puede traz a un cromosoma y secuenciado.
El enfoque opuesto a la proyección es una pantalla genética inversa, donde los investigadores alteran la expresión de muchos genes candidatos y luego buscan fenotipos mutantes resultantes de estas manipulaciones.
Además de "pérdida de función" mutaciones que alteran la actividad de un gen, pantallas genéticas pueden basarse también en mutaciones "ganancia de función", que causan la expresión de un gen o funcionalidad para aumentar. Esto puede lograrse insertando aleatoriamente elementos regulatorios del gen en el genoma, que conduciría a la sobreexpresión de un gen que se inserta el elemento arriba de.
Alternativamente, en un método llamado "proyección de expresión", los investigadores hacen uso de las bibliotecas de plásmidos que contienen las secuencias de la proteína-codificación de varios genes e introducir en las células los genes donde se expresará muy. Fenotipos resultantes pueden utilizarse entonces para entender la función del gene.
Para descubrir más información acerca de un gen conocido o mutación, pueden usarse filtros de modificador. Una pantalla de supresor comienza con un mutante caracterizado e identifica mutaciones adicionales que el fenotipo mutante menos severa. Una mutación supresora encontró en el mismo gen como la mutación original se denomina "intragénicas," mientras que una mutación supresora en un gen distinto se considera "extragenic."
Por el contrario, pantallas potenciador identifican mutaciones adicionales que aumentan la severidad de un fenotipo mutante. Estos pueden ser útiles para determinar los genes que son redundantes o pueden interactuar funcionalmente. Si la combinación de dos o más mutaciones resultado grave retraso del crecimiento o incluso la muerte, la afección se denomina "enfermedad sintética o letalidad". Una pantalla para las mutaciones letales o enfermas sintético revela genes que funcionan en redundantes, pero esencial, vías biológicas. Esto es especialmente útil, por ejemplo, en la identificación de varios productos génicos que pueden ser objeto simultáneamente con fármacos para destruir las células cancerosas.
Ahora que usted comprende algunas estrategias de cribado genético común, vamos a ver un protocolo general para una pantalla hacia delante en un organismo modelo popular, el gusano del nematodo.
En este ejemplo, mutagénesis química se llevará a cabo con Metanosulfonato de etilo o el ccsme, que funciona mediante la modificación química de nucleótidos de guanina, pudiendo llegar a par inapropiadamente con timina en posteriores rondas de replicación del ADN. Ya que EMS es un mutágeno y carcinógeno posible, debería tratarse sólo al usar una doble capa de guantes y trabajo debe llevarse a cabo en una campana de humos.
Para empezar, gran número de gusanos en la última etapa larvaria es seleccionado, lavado y recogido. EMS se añaden a los gusanos y los gusanos se incuban durante varias horas inducir mutaciones. Después de mutagénesis, EMS debe ser quitado de los gusanos e inactiva con hidróxido de sodio. Gusanos son entonces lavados varias veces en medio de cultivo y revestidos en placas de agar.
Siguiente, sano-mirando gusanos son transferidos a nuevas placas recién sembradas con bacterias como fuente de alimento y permite reproducir. Segunda generación progenie puede ser examinada visualmente para fenotipos mutantes, tales como defectos locomotores.
Ahora, vamos a ir a través de un protocolo para una pantalla de genética reversa en nematodos.
Un enfoque común para efectuar reversas pantallas en gusanos es alimentar a los animales una biblioteca de bacterias expresan ARN bicatenario, uno por cada cepa bacteriana, que se golpea abajo la expresión de un gen candidato cada en los gusanos. Estas bibliotecas están a menudo disponibles en el mercado y pueden ser el cultivadas para su uso en pantallas.
Para empezar, se cultivan solo colonias de bacterias que contiene clones de la biblioteca individual, y se induce la producción de RNA de doble hebra. Culturas son vistas en pocillos distintos de una placa con medio de cultivo de nematodos y deja secar en una campana de humos estéril.
A continuación, gusanos son plateados en las bacterias y permite alimentar en una cámara humidificada durante tres o cuatro días. Rápidamente se pueden observar fenotipos mutantes, en los gusanos originales que colocan en las placas de alimentación, o en la progenie de primera generación.
Ahora que ya has visto cómo hacia adelante y reversas pantallas genéticas se llevan a cabo, vamos a discutir algunas de sus aplicaciones actuales.
Algunas pantallas genéticas se utilizan para ayudar a los científicos a identificar proteínas que interaccionan físicamente o función en la misma vía molecular. En este experimento, los científicos idearon una pantalla basada en microscopía de alto rendimiento para descubrir nuevos receptores transmembranales que activan una molécula de señalización especial. Por overexpressing una variedad de genes en células de riñón embrionario humano que contiene la fluorescencia etiquetada señalización proteínas, fueron capaces de monitor que receptores afectan localización subcelular de la proteína.
Otra aplicación del screening genético es la caracterización de las interacciones entre medicamentos gen. Aquí, una biblioteca de levadura mutada se generó mediante mutagénesis al azar a gran escala con inserciones de transposones. Cada cepa mutante se cultivaba entonces en presencia de una droga. El crecimiento de cada cepa fue cuantificada usando PCR seguida de microarrays o secuenciación análisis para determinar a que mutantes, comparados a los controles unmutated, fueron sensible a la farmacoterapia.
Por último, pantallas permite entender los genes y redes moleculares en la enfermedad humana. Los investigadores de este experimento cultivan neuronas en presencia de virus de RNA-codificación precipitación expresión de muchos genes diferentes. Análisis automatizado de células immunostained entonces fue utilizado para revelar genes que influyen en las propiedades físicas de las neuronas, como consecuencia del neurite. Este enfoque con éxito ha identificado genes implicados en enfermedades neurodegenerativas.
Sólo haya visto video en pantallas genéticas de Zeus, una poderosa técnica para descubrir los genes implicados en procesos biológicos fundamentales. En este video repasamos algunos tipos principales de pantallas genéticas, protocolos generales para llevar a cabo ambos adelante y reversa pantallas y discutieron cómo se aplican estos métodos en los laboratorios de hoy. ¡Gracias por ver!
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Q1: What is the difference between forward and reverse genetic screens?
Forward genetic screens randomly generate mutations in an organism's DNA using mutagens or transposons, then identify unknown genes responsible for phenotypes of interest. Reverse genetic screens take the opposite approach: researchers target specific candidate genes for disruption, then observe resulting mutant phenotypes. Both methods help uncover gene function and biological pathways.
Q2: How do loss-of-function and gain-of-function mutations differ in genetic screens?
Loss-of-function mutations disrupt a gene's activity, reducing its expression or function. Gain-of-function mutations increase a gene's expression or functionality, often by inserting regulatory elements that drive overexpression. Expression screening uses plasmid libraries containing protein-coding sequences to achieve gain-of-function effects and understand gene function.
Q3: What are suppressor and enhancer screens used for?
Suppressor screens identify mutations that reduce the severity of an existing mutant phenotype, revealing genes that interact or compensate for the original mutation. Enhancer screens find mutations that increase phenotype severity, helping determine redundant or functionally interacting genes. Synthetic lethality screens reveal genes in essential but redundant pathways, useful for identifying drug targets in cancer therapy.
Q4: How is chemical mutagenesis performed in nematode worms?
In forward screens using nematodes, worms at the last larval stage are exposed to ethyl methanesulfonate (EMS), a chemical mutagen that modifies guanine nucleotides, causing mispairing with thymine during DNA replication. After several hours of incubation, EMS is removed and inactivated with sodium hydroxide. Worms are then washed, plated on agar with bacterial food, and allowed to reproduce for screening.
Q5: What is the protocol for reverse genetic screening in nematodes?
Reverse screens in nematodes use bacterial libraries expressing double-stranded RNA targeting individual candidate genes. Bacteria are cultured, spotted onto plates with nematode growth medium, and allowed to dry. Worms feed on the bacteria for three to four days in a humidified chamber, and mutant phenotypes are observed in original worms or first-generation progeny.
Q6: How are genetic screens applied to identify protein interactions and drug targets?
Researchers use high-throughput microscopy-based screens to discover receptors affecting signaling protein localization by overexpressing genes in cultured cells. For drug interactions, mutant libraries are grown with drugs, and growth is quantified using detection and quantification of nucleic acids by real time PCR followed by microarray or sequencing analysis to identify drug-sensitive strains.
Q7: How can genetic screens help understand genes involved in neurodegenerative diseases?
Researchers culture neurons in the presence of RNA-encoding viruses to knock down expression of many target genes. Automated analysis of immunostained cells reveals genes influencing neuronal properties like neurite outgrowth. This approach has successfully identified genes involved in neurodegenerative diseases, demonstrating how screens uncover molecular networks disrupted in human disease.