La fabricación de espumas y microportadores derivados de la matriz extracelular como específica de tejido de cultivo celular y las plataformas de entrega

El objetivo general de este protocolo consiste en ayudar a determinar el tamaño de espumas o microportadores no reticulados químicamente derivados de matriz extracelular específica de tejido, para aplicaciones en modelos de cultivo celular in vitro tridimensionales, o como andamios pro-regenerativos en sistemas de entrega celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular aplicada y la ingeniería de tejidos, como la forma en que el microambiente celular tridimensional media la función celular y la regeneración del tejido. La principal ventaja de esta técnica es que permite la fabricación de andamios con geometrías ajustables que imitan la composición nativa de la matriz extracelular específica del tejido y que son estables en cultivos a largo plazo sin necesidad de reticulación adicional.

Después de liofilizar la MEC derivada del tejido según el protocolo descrito, utilice tijeras quirúrgicas afiladas para picar finamente el tejido descelularizado. Para criomoler el tejido procesado, llene una cámara de molienda de acero inoxidable de 25 mililitros para un sistema de molino de bolas de laboratorio con la MEC liofilizada picada, y agregue dos bolas de molienda de acero inoxidable de 10 mililitros. Cierre la cámara de molienda cargada y sumérjala completamente en nitrógeno líquido durante tres minutos.

Luego, muela la muestra congelada a 30 hercios durante tres minutos. Repita la inmersión en nitrógeno líquido y la molienda hasta que la MEC se muela en un polvo fino. Pese 250 miligramos de MEC picada o criomolida y transfiera a un tubo cónico de 15 mililitros.

Añada cinco mililitros de tampón de NaH2PO4 22 M al tubo de centrífuga y marque el nivel del líquido en el tubo. Luego, prepare una solución stock de alfa amilasa añadiendo 7,5 miligramos de alfa amilasa a un mililitro de tampón de NaH2PO4 22 M. A continuación, añada 100 microlitros de la solución stock de alfa amilasa a la muestra.

Luego, agregue NaH2PO4 22 M para obtener un volumen final de 10 mililitros. Agite continuamente la suspensión a 300 RPM y temperatura ambiente durante 72 horas. Centrifugue la suspensión a 1500 × g durante 10 minutos.

Recolecte y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado de matriz extracelular digerida. Luego, use 10 mililitros de NaCl al cinco por ciento diluido en agua doblemente destilada para resuspender el material precipitado y agite continuamente durante 10 minutos a 300 RPM. Repita el lavado otras dos veces antes de usar 10 mililitros de agua doblemente destilada para resuspender el precipitado.

Luego, agite continuamente la suspensión a 300 RPM a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de centrifugar la muestra nuevamente, recopile cuidadosamente y deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet de ECM digerida. Añada ácido acético 2 molar hasta la marca de cinco mililitros.

Y vortex. A continuación, agite continuamente la suspensión a 120 RPM y 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, utilizando un homogenizador manual equipado con una sonda de dientes de sierra de 10 milímetros de ancho, homogenice la suspensión de MEC a temperatura ambiente en intervalos de 10 segundos hasta que no queden fragmentos visibles.

Coloque la suspensión en un vaso de precipitados con agua fría entre los intervalos de homogenización para evitar el sobrecalentamiento. Incube la suspensión de MEC a 37 grados Celsius con agitación continua a 120 rpm hasta que la suspensión esté tibia. Luego use ácido acético 2 molar para diluir la suspensión de la muestra a la concentración deseada.

Con una jeringa de tres mililitros y una aguja de calibre 18, llene el molde deseado con la suspensión de matriz extracelular (ECM). Las espumas pueden fabricarse en una variedad de geometrías dependiendo de la forma del molde. Cubra y congele los moldes a menos 20 o menos 80 grados Celsius.

Luego, coloque los moldes en un frasco para liofilizador. Conecte el frasco al sistema de liofilización del laboratorio y seque los moldes durante 24 horas o hasta que estén completamente secos. Incube la suspensión de ECM criomolido con agitación continua a 100 RPM durante la noche.

Cargue tres mililitros de suspensión de ECM en una jeringa de tres mililitros con cierre luer y coloque un conjunto de infusión alada en la abertura de la jeringa. Sujete la jeringa dentro de la bomba de jeringa. Luego, fije la aguja a un soporte universal y coloque la punta de la aguja verticalmente a una distancia de cuatro a seis centímetros desde la parte superior de un frasco Dewar de forma baja.

A continuación, sujete un electrodo con pinza cocodrilo a la punta de la aguja, asegurándose también de que la pinza cocodrilo esté conectada al terminal positivo de la fuente de alimentación de alto voltaje. Doble una tira de papel de aluminio sobre el borde del matraz al vacío. Luego, sujete un segundo electrodo con pinza cocodrilo al borde exterior del papel de aluminio.

Conéctelo al terminal de fuente de tierra de la fuente de alimentación. Llene el frasco Dewar con nitrógeno líquido hasta aproximadamente un centímetro del borde superior, de modo que tres cuartas partes de la lámina queden sumergidas. Luego, ajuste la bomba de jeringa a una velocidad de infusión de 30 mililitros por hora y electronebulice las muestras según el protocolo descrito en el texto.

Una vez finalizada la infusión, vierta cuidadosamente el exceso de nitrógeno líquido del Dewar, dejando el microportador suspendido en aproximadamente 25 mililitros de nitrógeno líquido para asegurar que permanezcan congelados. Transfiera inmediatamente los microportadores junto con el nitrógeno líquido a un tubo cónico de 50 mililitros, vertiendo en un solo movimiento suave. Luego, use una espátula para recoger cualquier microportador congelado que quede en el Dewar.

Añádalos también a la centrífuga. Para prepararse para la liofilización, cubra el tubo de centrífuga con papel de aluminio perforado con pequeños orificios. Coloque los tubos de centrífuga cubiertos en un frasco de liofilizador.

Luego, conecte inmediatamente el matraz al liofilizador y seque las muestras durante la noche. Transfiera suavemente la espuma liofilizada a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga etanol absoluto en exceso. De manera similar, re-suspenda los microportadores liofilizados en etanol absoluto en exceso dentro del tubo de centrífuga original utilizado para la recolección.

Utilizando una pipeta serológica, filtre los microportadores a través de un tamiz de acero inoxidable con un tamaño de malla definido hacia un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para eliminar cualquier agregado y seleccionar los rangos de tamaño deseados. Incube la muestra a cuatro grados Celsius durante cuatro horas o hasta que la espuma o los microportadores se hayan sedimentado en el fondo del tubo cónico. Luego, bajo una campana de flujo laminar y con técnica aséptica, utilice una pipeta serológica para eliminar el etanol absoluto de los andamios y agregue exceso de etanol al 95 % diluido con PBS estéril.

Incube los andamios a cuatro grados Celsius durante cuatro horas o hasta que los andamios se hundan en el fondo del recipiente de rehidratación. Rehidrate gradualmente los andamios mediante una serie de etanol. En cada paso, incube los andamios a cuatro grados Celsius hasta que se hundan en el fondo del recipiente, antes de cambiar la solución.

Sustituya el PBS estéril por dos enjuagues adicionales para eliminar el etanol residual. Almacene las muestras en PBS estéril al 100 % a cuatro grados Celsius hasta que estén listas para el cultivo celular. Utilice los andamios entre una y dos semanas después de la rehidratación.

Se muestran aquí ejemplos de los tipos de espumas y microportadores derivados de la MEC fabricados utilizando tejido adiposo descelularizado, tejido dérmico descelularizado de cerdo y ventrículo izquierdo descelularizado de cerdo. Esto demuestra que las técnicas pueden aplicarse para generar andamios biosintéticos específicos de tejido utilizando una variedad de tejidos descelularizados como fuentes de MEC.

Después de la criomolienda o picado, digestión enzimática y homogeneización, las muestras pueden dispensarse en un recipiente antes de la congelación y liofilización. Esta figura representa espumas liofilizadas de DAT, DDT y DLV rehidratadas, sintetizadas en un molde de placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos. Estas espumas de DAT, DDT y DLV se fabricaron con MEC criomolido a una concentración de 35 miligramos por mililitro y una temperatura de congelación de menos 80 grados Celsius.

Para fabricar microportadores derivados de la MEC utilizando una técnica de electroaspersión, para cada concentración de suspensión de MEC, se puede ajustar el calibre de la aguja, la velocidad de infusión y el voltaje para generar microportadores esféricos discretos que varían entre 350 y 500 micrómetros de diámetro tras una rehidratación controlada. Finalmente, los microportadores DAT, DDT y DLV mostrados aquí mediante MEB revelan que la ultraestructura en tamaño puede variar según la fuente de MEC descelularizada. Los métodos presentados en este video pueden utilizarse para fabricar una amplia variedad de microportadores y espumas específicos de tejidos, compuestos de MEC pura y no enlazada químicamente, utilizando tejido descelularizado como fuente de matriz.

Tras seguir estos procedimientos, las espumas y los microportadores pueden sembrarse con células bajo condiciones estáticas o dinámicas y pueden utilizarse como sustratos instructivos para células en cultivos celulares in vitro y aplicaciones in vivo.