Imágenes en vivo de la actividad antifúngica por los neutrófilos humanos primarios y los monocitos en respuesta a las A. fumigatus

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la actividad antifúngica de las células inmunitarias humanas primarias en tiempo real utilizando conidios reporteros fluorescentes de aspergillus y microscopía de vídeo de células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las respuestas inmunitarias contra las infecciones fúngicas en poblaciones específicas de pacientes y, en particular, la respuesta inmunitaria innata que se produce al principio de la exposición a los hongos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para identificar defectos específicos en la inmunidad innata y antifúngica, como la fagocitosis, la migración celular que mata la inhibición del crecimiento fúngico.

Para empezar, rayar la cepa AF293 de Aspergillus fumigatus portadora del gen indicador fluorescente dsRed sobre agar preparado en dos matraces T75. Incubar los cultivos a 37 grados Celsius, 5%CO2 durante siete días para obtener aproximadamente de 10 a los 9 conidios. Después de la incubación, sumergir los cultivos en 20 mililitros de PBS con 0.05%Tween 80 y recolectar conidios de A fumigatus.

Luego, usando un colador de celdas de 40 micrómetros, filtre las suspensiones resultantes en un tubo de 50 mililitros para eliminar los fragmentos de hifas. Una vez filtradas las suspensiones, centrifugarlas a 805 veces G durante 10 minutos. A continuación, deseche los sobrenadantes y vuelva a suspender los gránulos en 20 mililitros de PBS estéril.

Finalmente, agrupe las muestras y centrifugue la suspensión resultante una vez más. Vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de PBS y transfiera un mililitro de alícuotas de la suspensión conidial obtenida a tubos de microcentrífuga. Centrifugar las alícuotas a 9.300 veces G a temperatura ambiente durante 10 minutos.

A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender la bolita de conidiales en un mililitro de bicarbonato de sodio 0,05 molar con un pH de 8,3. Para etiquetar los conidios, agregue 10 microlitros de la solución madre de biotina al tubo de microcentrífuga, cubra la muestra con papel de aluminio e incube durante dos horas en un balancín a cuatro grados centígrados. Después de centrifugar la muestra marcada con biotina durante 10 minutos a 9, 300 veces G, retire con cuidado el sobrenadante.

A continuación, vuelva a suspender el pellet de conidios en un mililitro de una solución de Tris-HCL de 100 micromolares con un pH de 8,0. E incubar esta suspensión a cuatro grados centígrados durante una hora con una suave agitación para desactivar la biotina ilimitada. Centrifugar la muestra a 9.300 veces G durante 10 minutos.

Retire con cuidado el sobrenadante resultante, lave el pellet con un mililitro de PBS estéril y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS. A continuación, añada 10 microlitros de una solución madre de Streptavidin-AF633 a un mililitro de la suspensión de conidios. Incube esta suspensión cubierta con papel de aluminio durante 40 minutos a temperatura ambiente en un balancín.

Centrifugar la muestra a 9.300 veces G durante 10 minutos. A continuación, retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender la bolita de conidiales en un mililitro de PBS. Con un hemocitómetro, cuente los conidios en una dilución de uno a 1,000 y luego ajuste la concentración de conidios a 3,6 veces 10 por el 6º conidio por mililitro con medio independiente de CO2.

Finalmente, envuelva la suspensión en papel de aluminio y guárdela a cuatro grados centígrados. Recolectar y diluir una muestra de sangre humana con PBS. A continuación, utilice una jeringa con una aguja de hierro para cubrir la muestra de sangre con 15 mililitros de un medio para el aislamiento de células mononucleares.

Centrifugar la muestra a 630 veces G durante 20 minutos sin interrupción y con baja aceleración. Recoja con una pipeta Pasteur la capa central de PBMC localizada entre el suero amarillo y la capa transparente de solución de aislamiento de linfocitos. A continuación, transfiera la suspensión recogida a un nuevo tubo de 50 mililitros.

Diluir el PBMC con PBS para obtener 50 mililitros de la suspensión y lavar las células. Después del lavado, mezcle 20 microlitros de la suspensión celular con 160 microlitros de PBS y 20 microlitros de azul de tripán y cuente las células con un hemocitómetro. Cuando se cuentan, diluir a una concentración adecuada en un tubo de 15 mililitros, centrifugar las células durante 10 minutos a 515 veces G y luego volver a suspenderlas usando 40 microlitros de una solución tampón por una vez 10 hasta la séptima de las células.

Agregue 10 microlitros de CD14 MicroBeads por uno por 10 a la séptima celda y mezcle bien. Incubar la muestra a cuatro grados centígrados durante 15 minutos, asegurándose de mezclar el tubo cada cinco minutos. Después de la conjugación, lavar las células en un mililitro de la solución tampón por una vez 10 a la séptima célula y centrifugar la suspensión a 515 veces G durante 10 minutos.

A continuación, vuelva a suspender hasta una vez 10 a la octava célula en 500 microlitros de la solución tampón. Monte una columna que se utilizará con una sola muestra en un separador magnético siguiendo las instrucciones del fabricante y lave la columna una vez con 500 microlitros de solución tampón. Cargue 500 microlitros de la suspensión de la celda en la columna.

Una vez que esté seca, lave la columna tres veces con una solución tampón. Coloque un nuevo tubo de 15 mililitros debajo de la columna y separe la columna del separador magnético. Luego, usando un mililitro de solución tampón, eluya las células de la columna en el tubo.

Lavar y resuspender las células eluidas en medio RPMI. Después de ajustar la densidad celular a seis veces 10 a la quinta celda por mililitro, siembre 200 microlitros de la suspensión en un plato de imágenes de vidrio de 35 milímetros. Incubar el cultivo durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de CO2.

Para aislar los neutrófilos, extraiga todo el suero y la mayor parte de la solución de aislamiento de linfocitos de la muestra de sangre que quede después de la recolección de PBMC. Asegúrese de no quitar la delgada banda blanca en la parte superior de la bolita roja. Manteniendo las células en hielo, a continuación, lisar los glóbulos rojos y centrifugar los neutrófilos restantes a 394 veces G. A continuación, lavar las células dos veces con PBS frío y luego volver a suspender en un mililitro de un medio independiente de CO2.

Para una citometría de flujo, ajuste la densidad celular a seis veces 10 por la quinta célula por mililitro y agregue 400 microlitros de la suspensión celular a una placa de 24 pocillos. Agregue 200 microlitros de la misma suspensión celular a un plato de imágenes de vidrio de 35 milímetros para un examen microscópico. Para visualizar dsRed y Alexa Fluor 633 durante la microscopía, precaliente un calentador de microscopio y encienda el microscopio y la computadora.

A continuación, agregue 100 microlitros de tres por 10 a la 6ª suspensión conidial FLARE por mililitro a los pocillos apropiados de la placa de imagen. Registre la hora en que se agregan los conidios FLARE. Monte el plato de imágenes en la platina del microscopio, luego, en la configuración de adquisición, ajuste la potencia del láser al 10% y el tiempo de exposición a un segundo.

Y ajuste la sensibilidad de la cámara para obtener una imagen clara pero no sobreexpuesta de dsRed y AF633 y configure una lista de puntos de escenario. Inicialice la imagen cuando todos los puntos estén enfocados, los canales fluorescentes estén optimizados y se hayan establecido el tiempo y la duración del ciclo. Aquí se presentan imágenes tomadas durante un cultivo simultáneo de neutrófilos y conidios FLARE.

La señal fluorescente verde correspondiente a la tinción AF633 es visible tanto en conidios vivos como muertos. Mientras que la fluorescencia de dsRed se puede observar exclusivamente en conidios vivos. Por lo tanto, entre todos los conidios detectados, solo los que están teñidos simultáneamente con ambos tintes y visibles como manchas magenta están vivos.

La fagocitosis y la muerte de conidios de A fumigatus cocultivados con células de macrófagos alveolares de ratón se cuantificaron mediante citometría de flujo. En el análisis, los macrófagos transeúntes están marcados con una puerta naranja, mientras que los macrófagos asociados con conidios muertos y positivos solo para la tinción de AF633 se muestran dentro de la puerta azul. Además, los conidios muertos no revelan tinción de blanco de calcofluor, lo que indica su localización intracelular.

Los conidios vivos teñidos con dsRed y AF633 están marcados con una puerta roja, estos conidios también se internalizan dentro de las células de macrófagos, como lo demuestra la disminución de la tinción de blanco de calcofluor. Finalmente, se evaluó la influencia de A fumigatus en la migración de neutrófilos humanos, revelando un mayor movimiento y velocidad de las células inmunitarias en respuesta a los conidios hinchados en comparación con los conidios en reposo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en ocho horas para una sola población de células.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las células en hielo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la medición de especies reactivas de oxígeno o la citocinesis, para proporcionar más información sobre la respuesta inmunitaria antifúngica innata en la misma población celular. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología fúngica exploren la fagocitosis y la eliminación antifúngica utilizando patógenos fúngicos en células inmunitarias primarias.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar las respuestas inmunitarias antifúngicas innatas de las células inmunitarias humanas primarias en tiempo real utilizando conidios reporteros fluorescentes de aspergillus y microscopía de video de células vivas. No olvide que trabajar con sangre humana puede ser peligroso y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas de EPP para evitar la transmisión de infecciones.