Name: Análisis de terminación de la transcripción Uso Enfoque BrUTP-capítulo específico de la transcripción de ejecución en (TRO) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprenda a analizar la terminación de la transcripción por ARN polimerasa II en levadura utilizando el enfoque TRO específico de cadena con BrUTP. Este método distingue polimerasas que transcriben ARNm de aquellas con transcripción pervasiva.

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La investigación en el laboratorio de Ansari fue apoyada por la beca de investigación (No. MCB 1020911) de la Fundación Nacional de Ciencias.

NOTA: Este método fue utilizado en el artículo de investigación publicada en Medler, S y Ansari, A. 2. 1. cultivo y recogida de las células <ol><li> Iniciar un ml de cultivo de 5 de las células en medio YPD (10 g de extracto / L de levadura, 20 g / L de peptona, 2% de dextrosa) a partir de una placa de Saccharomyces cerevisiae recién rayada. </li><li> Cultivar las células durante la noche en un agitador orbital a 30 ° C y 250 rpm. </li><li> Diluir el cultivo crecido durante la noche de 100 veces a un volumen final de 100 ml en medio YPD en un matraz desconcertado a 250 ml. NOTA: Se necesita un total de 100 ml de cultivo por reacción TRO; si se requieren múltiples reacciones, se debe utilizar un volumen mayor de la cultura. </li><li> Cultivar las células a una densidad óptica de 0,8 a 1,0 a 600 nm (A 600 ~ 0,8-1,0). </li><li> Recoger las células por centrifugación a 820 xg durante 5 min a 4 ° C en un tubo cónico estéril de 50 ml. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de hielo frío bu TMNffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, NaCl 100 mM) y se incuba en hielo durante 5 min. </li><li> Centrifugar a 820 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración. </li></ol> 2. permeabilización de las células y se preparan para la ejecución de Ensayo <ol><li> Resuspender las células en 1 ml de solución de sarcosil 0,6% pipeteando arriba y abajo suavemente con una punta truncada P 1000. Transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga refrigerada 1,5 mL. </li><li> Agitar suavemente las células a 4 ° C durante 25 minutos en un agitador de plataforma. NOTA: Tubos de microcentrífuga deben ser empacados en un tubo cónico de 50 ml con hielo para mantener una temperatura fría, evitando la posibilidad de nuevos sucesos de inicio que se producen en el promotor en esta etapa. </li><li> Centrifugar las células a 1200 xg durante 6 minutos a 4 ° C utilizando una centrífuga de mesa refrigerada. </li><li> Se aspira suavemente el sobrenadante para eliminar cualquier exceso de líquido por cadasedimento celular meabilized. </li></ol> 3. Transcripción de ejecución de Reacción <ol><li> Añadir 150 l de transcripción run-en tampón (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2, DTT 2 mM (ditiotreitol), 0,75 mM cada uno de ATP, CTP, GTP, y BrUTP, 200 U de RNasa inhibidor) al sedimento celular permeabilizada. </li><li> Mezclar suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo usando una punta truncada P 200. NOTA: Si el procesamiento de múltiples muestras, mantener todo en hielo hasta que todas las muestras están listas y luego proceder al siguiente paso. </li><li> Se incuba durante 5 minutos a 30 ° C en un baño de agua. NOTA: Ajuste el tiempo de incubación entre 1 y 5 minutos para asegurar la óptima incorporación de BrUTP en el ARN naciente. </li><li> Se detiene la reacción mediante la adición de 500 l de reactivo de aislamiento de ARN fría lista para su uso. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li></ol> 4. La extracción de RNA <ol><li> Añadir 200 l de perlas de vidrio lavadas con ácido a la Suspensiòn celularen (paso 3.4) y agitar enérgicamente durante 20 minutos a 4 ° C en un mezclador de vórtice. </li><li> Perforar el fondo del tubo de microcentrífuga utilizando una aguja de 22 G caliente y colocarlo en la parte superior de un tubo cónico estéril de 15 ml. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 1 min a 4 ° C para recoger el lisado celular. Transferir el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 500 l de reactivo de aislamiento de ARN en frío y 200 l de cloroformo al lisado celular. Mezclar el contenido en un mezclador de vórtice y se centrifuga a 16.168 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir un volumen igual de frío fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (125: 24: 1) pH 4-5. Agitar vigorosamente en un vórtex y se centrifuga a 16.168 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir la fase que contiene RNA acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga. Repita el paso 4.6 dos veces más. </li><li> A la fase acuosa que contiene RNA-final, añadir 5 M NaCl stock para obtener una concentración final de 0,3 M. Añadir 3 veces el volumen de etanol frío para precipitar el ARN. <ol><li> Incubar durante 1 hora o durante la noche a -20 ° C. NOTA: Realice los pasos 4.9 - 4.11, mientras que las perlas anti-BrdU se incubaron durante bloqueo (véase el paso 5.3). </li></ol></li><li> Centrifugar a 16.168 xg durante 20 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet de ARN en 100 l de agua DEPC (pirocarbonato de dietilo). </li><li> Utilice un mini kit de aislamiento de ARN para separar el ARN de los nucleótidos no incorporados BrUTP. Eluir el ARN de la columna con 100 l de agua libre de RNasa. </li><li> Incubar el ARN en un baño de agua a 65 ° durante 5 min y luego se transfieren a hielo durante al menos 2 min. </li></ol> 5. Purificación por Afinidad de ARN marcado con BrUTP <ol><li> Al 25 l de anti-BrdU se establecieron cuentas, añadir 500 l de 0,25 x SSPE (sodio fosfato salino EDTA) tampón de unión (20x SSPE: NaCl 3 M, 0,2 M NaH 2 PO 4 </sub&gt;, 0,02 M EDTA, pH 7,4, EDTA 1 mM, 0,05% de Tween, NaCl 37,5 mM). Centrifugar a 200 xg durante 30 s a 4 ° C y separar el sobrenadante. </li><li> Repita el paso 5.1 tres veces. </li><li> Añadir 500 l de tampón de bloqueo (1x tampón de unión, 0,1% de polivinilpirrolidona, 1 mg ultra-pura albúmina de suero bovino (BSA)) a las perlas y agitar suavemente durante 1 - 2 horas a 4 ° C en un agitador de plataforma. </li><li> Lavar las perlas dos veces más con 500 l de tampón de unión, como se describe en el paso 5.1. </li><li> Añadir 400 l de tampón de unión a las perlas. </li><li> Transferir 100 l de ARN (de la etapa 4.11) directamente a las perlas. Incubar con agitación suave durante 1 - 2 horas a 4 ° C en un agitador de plataforma. </li><li> Lavar el perlas secuencialmente con 500 l de tampón de unión, 500 l de tampón de sal baja (SSPE 0,2x, EDTA 1 mM, 0,05% Tween), 500 l de tampón de sal alta (0.25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% de Tween, NaCl 100 mM), y dos veces con 500 l de tampón de TET (1x TE, 0,05% de Tween), girando a200 xg durante 30 s a 4 ° C en entre cada lavado. </li><li> Eluir el ARN marcado con BrUTP a partir de perlas secuencialmente, dos veces con 150 l y una vez con 200 l de tampón de elución (DTT 20 mM, NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS), incubando durante 4 minutos a 42 ° C en un baño de agua seguido de un breve centrifugado para separar los granos del sobrenadante. </li></ol> 6. La precipitación de ARN BrUTP Etiquetada <ol><li> Añadir 500 l de frío fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (125: 24: 1) pH 4 - 5 a la afinidad purificada BrUTP etiquetados ARN. Mezclar en un mezclador de vórtice y se centrifuga a 16.168 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 5 M NaCl común conseguir una concentración final de 0,3 M y 3 veces el volumen de etanol frío para precipitar el ARN. </li><li> Se incuba a -20 ° C durante la noche. </li><li> Recoger el ARN precipitado por centrifugación a 16.168 xg durante 30 min a 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Eliminar el sobrenadante y dejar que el precipitado se seque al aire durante 10 minutos. </li><li> Resuspender el precipitado de ARN en 26 l de agua DEPC. </li><li> Determinar la concentración final de ARN mediante la medición de la absorbancia a 260 nm usando un espectrofotómetro. Además, determinar la relación de 260/280. Una relación de ~ 2 es indicativa de una muestra de ARN puro. </li><li> Almacenar las muestras de ARN en alícuotas a -80 ° C hasta que sea necesario para la síntesis de cDNA. </li></ol> 7. La transcripción inversa del ARN marcado con BrUTP <ol><li> Ajustar la concentración de ARN a 100 ng / l usando agua DEPC. Utilizar 0,5 g de ARN para cada reacción de síntesis de ADNc. NOTA: La concentración de molde de RNA puede variar de 0,5 a 1,0 mg para lograr la síntesis de ADNc óptimo. </li><li> Transcripción inversa del ARN usando múltiples cebadores inversos diseñados aguas abajo del sitio (sitio de terminación) de poli (A) como se muestra en la Figura 3A. </li><li> Para cada reacción de transcripción inversa, añadir 5 l de ARN template (0,5 g), 1 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 2 l de cebador inverso C, D, E, F o G (50 mM cada uno) (véase la figura 3A) y agua libre de nucleasa. El volumen de reacción final en cada tubo es de 13 l. NOTA: El número de reacciones de transcripción inversa dependerá del número de cebadores inversos utilizados para la síntesis de ADNc. Por ejemplo, para ASC1 se utilizaron cinco cebadores inversos y por lo tanto cinco reacciones de transcripción inversa se establecieron. Etiquetar los tubos como C, D, E, F y G sobre la base del cebador inverso usado para la síntesis de ADNc. </li><li> Incubar los tubos que contienen plantilla de ARN, mezcla de dNTP y cebadores en un termociclador a 65 ° C durante 5 min para eliminar cualquier conformación estructural secundaria, y después se enfría a 4 ° C durante al menos 2 min. </li><li> Añadir 1 l transcriptasa inversa (200 U / l) reversa, 4 l de tampón y 2 l de DTT 0,1 M a cada tubo que contiene la plantilla de ARN y el cebador (paso 7.4). Mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Realizar la transcripción inversa mediante la incubación de la mezcla de reacción en un termociclador a 42 ° C durante 60 min. </li><li> Inactivar la transcriptasa inversa a 65 ° C durante 20 min. </li><li> Almacenar el ADNc a -20 ° C o proceder al siguiente paso. </li></ol> 8. La amplificación de cDNA <ol><li> Realizar la reacción de PCR para la amplificación de cada preparación de cDNA (con la etiqueta C, D, E, F y G para ASC1) de la etapa 7.8 de la siguiente manera: Modelo de 3,0 l de cDNA de la etapa 7.8, 1.0 l cebador directo B (10 mM), 1,0 l cebador C inversa o 10x de la polimerasa PCR buffer D o e o F o G (10 mM), 2,5 l, 0,5 l de la mezcla dNTP (10 mM cada uno), 1,0 l de MgCl 2 (2,5 mM), 15,5 agua de grado l PCR, y 0.5 enzima polimerasa termoestable l. NOTA: Las diferentes diluciones de cDNA plantilla que va de 1: 5 a 1: 100 debería realizarse una prueba para optimizar el rendimiento del producto de PCR. Un cebador directo único promotor-proximal se utiliza para amplificar cDNAobtenido utilizando diferentes cebadores inversos. Por ejemplo, se utilizó un cebador directo solo B situado cerca del promotor en combinación con cinco cebadores inversos de C a G para ASC1. BC, BD, BE, BF y BG se utilizaron en tubos etiquetados como C, D, E, F y G, respectivamente, como se muestra en la Figura 3A. </li><li> Ejecutar la PCR utilizando los siguientes parámetros de ciclo térmico: 1 ciclo de 95 ° C durante 2 min (arranque en caliente para la activación de la polimerasa), 30 - 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s (desnaturalización), 54 ° C durante 15 s (recocido) , 68 ° C durante 1 min (extensión), y 1 ciclo de 68 ° C durante 5 min (extensión final). NOTA: La temperatura de hibridación puede variar dependiendo de los cebadores específicos que se utiliza y el tiempo de extensión varía dependiendo del tamaño de producto esperado. </li><li> Separar el producto de PCR por electroforesis en 0,8%, 1,5%, o 2% geles de agarosa, según el tamaño esperado del producto. </li><li> Cuantificar el producto de PCR como se describe en El Kaderi et al. , 2012 11. NOTA: Como alternativa, utilice estrategia en tiempo real RT-PCR cuantitativa para cuantificar la cantidad de transcritos nacientes. </li></ol>

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<li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586(2015).</li>
<li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li>
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<li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome%3A+why%2C+where+and+how+to+stop%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li>
<li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+eukaryotic+transcriptome%3A+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li>
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<li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reality+of+pervasive+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625(2011).</li>
<li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li>
<li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15(2012).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo TRO capítulo específico utilizado aquí es una adaptación del protocolo utilizado para GRO-Sec (Global Run on-Sequencing) análisis en células de mamíferos 12. Hemos modificado con éxito el protocolo para estudiar la transcripción incipiente levadura en ciernes. Para analizar específicamente el defecto terminación de la transcripción, se ajustó el protocolo adicional mediante la eliminación de la etapa de hidrólisis de ARN. Esto nos permitió detectar específicamente la longitud nacient...

El ciclo de la transcripción eucariótica consiste en tres pasos principales; iniciación, elongación y terminación. La terminación de la transcripción por la RNA polimerasa II consta de dos etapas distintas interdependientes 3. El primer paso implica la escisión, de poliadenilación y liberación de ARNm a partir de la plantilla, y es seguida inmediatamente por el segundo paso, marcado por el desacoplamiento de la polimerasa a partir de la plantilla. La terminación adecuada es crucial para el reciclado de la polimerasa durante la iniciación / reinicio de la transcripción, para la prevención de interferencia con la transcripción de genes aguas abajo, y para mantener la transcripción aberrante bajo control mediante la limitación de la transcripción de RNA penetrante 4, 5 no codificante. A pesar de los recientes avances, la terminación es de lejos el menos comprendido paso del ciclo de la transcripción de ARN polimerasa II. Un ensayo de terminación fiable es esencial para el estudio del mecanismo de underlying terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II in vivo. Un número de enfoques experimentales se utilizan para detectar el defecto de terminación en un gen de la transcripción de forma activa en condiciones fisiológicas. Estos incluyen transferencia Northern, chip factor de terminación (Inmunoprecipitación de cromatina) y el ensayo TRO tradicional. Cada una de estas técnicas tienen algunas ventajas y desventajas. El ensayo TRO tradicional solía ser el método más fiable y sensible para la detección de un defecto de terminación de la transcripción in vivo 1. Este ensayo se localizan las moléculas de polimerasa transcripcionalmente activos en las diferentes regiones de un gen dentro de la célula. En condiciones normales, el ensayo muestra moléculas transcriptionally comprometidos polimerasa estrictamente distribuidos entre el promotor y el terminador del gen de la región (Figura 1A). A la terminación defectuosa, sin embargo, la polimerasa es incapaz de leer la señal de terminacióny se detecta en la región corriente abajo del extremo 3 &#39;del gen (Figura 1B). Un defecto terminación de la transcripción se manifiesta en la presencia de un sentido de transcripción de la polimerasa que inicia a partir de la región próxima al promotor, y siendo incapaz de leer la señal de terminación, continúa la transcripción de la región aguas abajo del extremo 3 &#39;de un gen, como se muestra en la figura 2A. Con la comprensión de que el genoma eucariota exhibe la transcripción omnipresente abrumadora en el sentido, así como las direcciones de sentido opuesto en los alrededores de un gen 6, 7, 8, 9, 10, pronto se hizo evidente que el ensayo TRO tradicional no puede detectar si la señal de la polimerasa aguas abajo de un gen representa una transcripción de promotor-iniciado (Figura 2A) o un ARN aberrante que inició somewhere en el medio del gen o aguas abajo del elemento terminador (Figura 2B), o la transcripción de la polimerasa en la dirección anti-sentido desde el extremo 3 &#39;del gen (Figura 2C). El ensayo TRO específica de hebra usando BrUTP describe aquí puede distinguir si la señal de la polimerasa readthrough observado representa mRNA sentido extendido promotor-iniciado o un transcrito antisentido que inició aguas abajo del gen bajo examen. Hemos utilizado con éxito este método para demostrar el papel de Kin28 quinasa en la terminación de la transcripción de levadura en ciernes 2. Empleando el enfoque que aquí se muestra que Rna14 es necesaria para la terminación de la transcripción de levadura en ciernes ASC1.

<table><tbody><tr><td>Mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td>pH 4-5</td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol</td><td>Life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa, placenta humana</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Perlas anti-BrdU</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-32323AC</td><td></td></tr><tr><td>Protoscript II</td><td>New England Biolabs</td><td>M03368L</td><td>o una enzima equivalente</td></tr><tr><td>Advantage 2 polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>o una enzima equivalente</td></tr><tr><td>5-Bromouridina 5' trifosfato sodio sal</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-214314A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0451AA</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td></td><td>N0454AA</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>N0452AA</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina ultrapura (BSA)</td><td>MC Labs</td><td>UBSA-100</td><td></td></tr><tr><td>Asc1 B</td><td></td><td></td><td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td></tr><tr><td>Asc1 C</td><td></td><td></td><td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC</td></tr><tr><td>Asc1 D</td><td></td><td></td><td>TGTACATATGTATTTTCGCAGCA</td></tr><tr><td>Asc1 E</td><td></td><td></td><td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td></tr><tr><td>asc1 f</td><td></td><td></td><td>ctatggaatgggggttttaag</td></tr><tr><td>asc1 g</td><td></td><td></td><td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td></tr><tr><td>5s cDNA</td><td></td><td></td><td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td></tr><tr><td>5' 5s inverso</td><td></td><td></td><td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td></tr><tr><td>3' 5s reverso</td><td></td><td></td><td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td></tr></tbody></table>

análisis de terminación de la transcripción uso enfoque brutp-capítulo específico de la transcripción de ejecución en (tro)

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Este manuscrito describe un protocolo para la detección de defecto de terminación de la transcripción in vivo. El protocolo TRO capítulo específico utilizando BrUTP describe aquí es un enfoque experimental poderosa para analizar el defecto terminación de la transcripción en condiciones fisiológicas. Al igual que el ensayo de TRO tradicional, se basa en la presencia de una polimerasa transcripcionalmente activo más allá del extremo 3 &#39;del gen como un indicador de un defecto de terminación de la transcripción 1. Supera dos problemas importantes con el ensayo TRO tradicional. En primer lugar, se puede detectar si la polimerasa lectura a través de la señal de terminación es el que inicia la transcripción de la región próxima al promotor, o si es simplemente representa una polimerasa penetrante transcripción que inició de manera no específica de algún lugar del cuerpo o de la 3 &#39; final del gen. En segundo lugar, se puede distinguir si la señal de la polimerasa transcripcionalmente activo más allá de laregión terminadora es realmente la polimerasa mRNA sentido transcripción de lectura completa o una señal de ARN anti-sentido no codificante terminador iniciada. Brevemente, el protocolo implica permeabilización de las células de levadura en crecimiento exponencial, permitiendo que las transcripciones que iniciaron in vivo para alargar en presencia del nucleótido BrUTP, purificando el ARN marcado con BrUTP por el enfoque de afinidad, transcripción inversa el ARN naciente purificada y amplificar el ADNc usando cebadores específicos de cadena que flanquean las regiones de terminación del gen promotor y 2.

Para demostrar la aplicabilidad del procedimiento TRO BrUTP cadena específica en la detección de un defecto de terminación de la transcripción, hemos utilizado un mutante sensible a la temperatura de terminación defectuosa de RNA14 llama rna14-1. El papel de Rna14 en la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II se demostró usando el ensayo de TRO tradicional que detectó ARN en la región del terminador-proximal de genes seleccionados 1.</...

Describimos un enfoque experimental básico para el análisis de la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II in vivo utilizando BrUTP mediante el enfoque de rodaje de transcripción específica de cadena (TRO) en levadura en ciernes. Este protocolo puede extenderse para estudiar la terminación de la transcripción por otras ARN polimerasas tanto en levaduras como en eucariotas superiores.

Análisis de terminación de la transcripción Uso Enfoque BrUTP-capítulo específico de la transcripción de ejecución en (TRO)

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa a la levadura en ciernes en condiciones in vivo mediante la transcripción específica de la cadena en el enfoque. Este método ayuda a responder a la pregunta clave de si la polimerasa transcripcionalmente activa detectada más allá de los tres extremos principales del gen es la que se inicia desde la región promotora. La principal ventaja de este método es que puede distinguir una polimerasa que transcribe un ARNm de una polimerasa que transcribe de forma generalizada y que inició las transcripciones y estará en los tres extremos principales del gen.Esta técnica puede extenderse para estudiar la terminación de la transcripción por otras ARN polimerasas y levaduras debido a la naturaleza conservadora de la terminación por diferentes polimerasas. Aunque este método puede proporcionar información sobre el papel preciso de los factores de terminación en el ciclo de transcripción de la levadura, también puede extenderse para estudiar la terminación en eucariotas superiores. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la permeabilización celular y la transcripción se detiene, ya que requieren una ejecución cuidadosa, y las transcripciones nacientes también pueden ser difíciles de purificar.Primero tuvimos la idea de este método a partir del enfoque de búsqueda GRO que proporciona una instantánea de todo el genoma de la posición de las polimerasas transcripcionalmente activas de una manera específica de la cadena. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la ejecución de la transcripción y la purificación del ARN son difíciles de realizar debido a la baja cantidad y la naturaleza inestable de las transcripciones nacientes. Antes de comenzar la transcripción, se ejecuta la reacción, se cultivan, cosechan y permeabilizan las células de levadura en crecimiento exponencial, para obtener una paleta celular permeabilizada.Para iniciar la reacción, agregue 150 microlitros de transcripción ejecutada en tampón a la paleta celular permeabilizada. Con una punta P-200 truncada, mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Coloque la muestra en hielo.Una vez que todas las muestras se hayan resuspendido en la transcripción ejecutada en tampón, incube las muestras durante cinco minutos a 30 grados centígrados en un baño de agua. Detenga la reacción añadiendo 500 microlitros de reactivo de aislamiento de ARN frío listo para usar a cada muestra. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Comience el procedimiento de extracción de ARN agregando 200 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido a cada suspensión celular y agitando vigorosamente en un mezclador de vórtice durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de 20 minutos, use una aguja caliente de calibre 22 para perforar la parte inferior de cada tubo de microcentrífuga y coloque el tubo en la parte superior de un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 300 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados y transferir el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Agregue 500 microlitros de reactivo de aislamiento de ARN frío y 200 microlitros de cloroformo al lisado celular. Mezcle el contenido en el mezclador de vórtice y luego centrifugue a 16, 168 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.Agregue un volumen igual de fenol cloroformo isoamílico frío. Agite vigorosamente en el mezclador de vórtice y luego centrifugue a 16, 168 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la fase acuosa superior que contiene ARN a un nuevo tubo de microcentrífuga.Añadir un volumen igual de fenol cloroformo isoamílico frío, vortex y centrifugar de nuevo. Al ARN final que contiene la fase acuosa, agregue un volumen apropiado de un stock de cloruro de sodio de cinco molares para obtener una concentración final de 0,3 molares. Agregue tres veces el volumen de etanol frío para precipitar el ARN.Incubar durante una hora, o toda la noche, a 20 grados centígrados. Cuando termine la precipitación del ARN, centrifugue a 16, 168 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Retirar el sobrenadante y volver a suspender la paleta de ARN en 100 microlitros de agua DEPC.Utilice un kit de aislamiento de ARN para separar el ARN de los nucleótidos trifosfato de bromouridina no incorporados y eluir el ARN de la columna con 100 microlitros de agua libre de ARNasa. Incubar el ARN en un baño de agua a 65 grados centígrados durante cinco minutos. Y luego transfiera a hielo durante al menos dos minutos.Comience este procedimiento preparando las perlas de uranio empobrecido anti bromo mientras se precipita el ARN. Para cada muestra, agregue 500 microlitros de tampón aglutinante EDTA de fosfato salino de sodio 0.25 X a 25 microlitros de perlas sedimentadas. Centrifugar a 200 veces G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados y eliminar el sobrenadante.Lave las cuentas tres veces con el tampón aglutinante. Después de retirar el sobrenadante del tercer lavado, agregue 500 microlitros de tampón de bloqueo a las perlas y agite suavemente durante una o dos horas a cuatro grados centígrados en un agitador de plataforma. Lavar las cuentas dos veces más con 500 microlitros de tampón aglutinante.Retire el sobrenadante del segundo lavado y agregue 400 microlitros de tampón aglutinante a las cuentas. Transfiere 100 microlitros de ARN directamente a las perlas. Incubar con una agitación suave durante una o dos horas a cuatro grados centígrados en un agitador de plataforma.Girar a 200 veces G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados y luego retirar el sobrenadante. A continuación, agregue 500 microlitros de tampón aglutinante a las cuentas. Girar a 200 veces G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante.De esta manera, lave las perlas secuencialmente con tampón de unión, tampón de baja sal, tampón de alta sal y dos veces con tampón TET. Para eluir el ARN marcado con trifosfato de bromouridina de las perlas, agregue 150 microlitros de tampón de elución e incube durante cuatro minutos a 42 grados Celsius en un baño de agua. Gira brevemente y recoge el sobrenadante.De esta manera, eluir secuencialmente dos veces con 150 microlitros y una vez con 200 microlitros de tampón de elución. De cada muestra se deben obtener alrededor de 500 microlitros de ARN marcado con trifosfato de bromouridina purificado por afinidad. Para precipitar el ARN marcado con trifosfato de bromouridina purificado por afinidad, agregue 500 microlitros de alcohol isoamílico de fenol cloroformo frío a cada muestra.Vórtice y centrífuga a 16, 168 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga. Añadir el volumen adecuado de un caldo de cloruro sódico de cinco molares para obtener una concentración final de 0,3 molar.Luego agregue tres veces el volumen de etanol frío. Incubar a 20 grados centígrados durante la noche para precipitar el ARN. Al día siguiente, recoja el ARN precipitado por centrifugación a 16, 168 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.Retire el sobrenadante y deje que la paleta se seque al aire durante 10 minutos. Resuspender la paleta de ARN en 26 microlitros de agua DPC. Determine la concentración final de ARN midiendo la absorbancia a 260 nanómetros con un espectrofotómetro.Almacene las muestras de ARN y las alícuotas a 80 grados centígrados hasta que las necesite para la síntesis de ADNc. La transcripción específica de la cadena de trifosfato de bromouridina se utilizó para probar el requisito de ARN 14 para la terminación de la transcripción del gen ASC1 en levaduras en ciernes. El ARN marcado con trifosfato de bromouridina del mutante ARN 14-1 y sus células isogénicas de tipo salvaje se purificó y se transcribió inversamente con cebadores C, D, E, F y G. El ADNc correspondiente se amplificó por PCR utilizando los pares de cebadores B y C, B y D, B y E, B y F, y B y G, y se fraccionó en geles de agarosa.La presencia de productos amplificados por PCR de los pares de cebadores B y E, B y F, y B y G en el mutante, refleja un fenotipo de lectura de terminación. Sin embargo, en las células de tipo salvaje, la ejecución de la transcripción en la señal estaba limitada hasta el elemento terminador, y no había ninguna ejecución de transcripción detectable en la señal más allá de la región terminadora. Este gráfico muestra la cuantificación de los geles con cinco S RNA como control de normalización.La detección de transcripciones nacientes iniciadas por el promotor que leen a través de la señal de terminación en las células mutantes, pero no en las de tipo salvaje, confirma que el ARN 14 es un factor de terminación. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la transcripción que se ejecuta en la reacción es fundamental para obtener un resultado exitoso.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la búsqueda GRO, para responder a preguntas adicionales, como el papel de un factor en la terminación en todo el genoma. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la transcripción exploraran la terminación por otras ARN polimerasas en levaduras y sistemas eucariotas superiores. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la transcripción, ejecutarse en las reacciones y purificar las transcripciones etiquetadas nacientes.No olvide que el ARN puede ser extremadamente inestable y siempre se deben tomar precauciones como usar guantes, mantener la temperatura alrededor de cuatro grados centígrados y usar agentes libres de ARNasa mientras se realiza este procedimiento.

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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