Análisis de terminación de la transcripción Uso Enfoque BrUTP-capítulo específico de la transcripción de ejecución en (TRO)
12 de marzo de 2017
Describimos un enfoque experimental básico para el análisis de la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II in vivo utilizando BrUTP mediante el enfoque de rodaje de transcripción específica de cadena (TRO) en levadura en ciernes. Este protocolo puede extenderse para estudiar la terminación de la transcripción por otras ARN polimerasas tanto en levaduras como en eucariotas superiores.
El objetivo general de este procedimiento es estudiar la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa a la levadura en ciernes en condiciones in vivo mediante la transcripción específica de la cadena en el enfoque. Este método ayuda a responder a la pregunta clave de si la polimerasa transcripcionalmente activa detectada más allá de los tres extremos principales del gen es la que se inicia desde la región promotora. La principal ventaja de este método es que puede distinguir una polimerasa que transcribe un ARNm de una polimerasa que transcribe de forma generalizada y que inició las transcripciones y estará en los tres extremos principales del gen.
Esta técnica puede extenderse para estudiar la terminación de la transcripción por otras ARN polimerasas y levaduras debido a la naturaleza conservadora de la terminación por diferentes polimerasas. Aunque este método puede proporcionar información sobre el papel preciso de los factores de terminación en el ciclo de transcripción de la levadura, también puede extenderse para estudiar la terminación en eucariotas superiores. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la permeabilización celular y la transcripción se detiene, ya que requieren una ejecución cuidadosa, y las transcripciones nacientes también pueden ser difíciles de purificar.
Primero tuvimos la idea de este método a partir del enfoque de búsqueda GRO que proporciona una instantánea de todo el genoma de la posición de las polimerasas transcripcionalmente activas de una manera específica de la cadena. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la ejecución de la transcripción y la purificación del ARN son difíciles de realizar debido a la baja cantidad y la naturaleza inestable de las transcripciones nacientes. Antes de comenzar la transcripción, se ejecuta la reacción, se cultivan, cosechan y permeabilizan las células de levadura en crecimiento exponencial, para obtener una paleta celular permeabilizada.
Para iniciar la reacción, agregue 150 microlitros de transcripción ejecutada en tampón a la paleta celular permeabilizada. Con una punta P-200 truncada, mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Coloque la muestra en hielo.
Una vez que todas las muestras se hayan resuspendido en la transcripción ejecutada en tampón, incube las muestras durante cinco minutos a 30 grados centígrados en un baño de agua. Detenga la reacción añadiendo 500 microlitros de reactivo de aislamiento de ARN frío listo para usar a cada muestra. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Comience el procedimiento de extracción de ARN agregando 200 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido a cada suspensión celular y agitando vigorosamente en un mezclador de vórtice durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de 20 minutos, use una aguja caliente de calibre 22 para perforar la parte inferior de cada tubo de microcentrífuga y coloque el tubo en la parte superior de un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 300 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados y transferir el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Agregue 500 microlitros de reactivo de aislamiento de ARN frío y 200 microlitros de cloroformo al lisado celular. Mezcle el contenido en el mezclador de vórtice y luego centrifugue a 16, 168 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
Agregue un volumen igual de fenol cloroformo isoamílico frío. Agite vigorosamente en el mezclador de vórtice y luego centrifugue a 16, 168 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la fase acuosa superior que contiene ARN a un nuevo tubo de microcentrífuga.
Añadir un volumen igual de fenol cloroformo isoamílico frío, vortex y centrifugar de nuevo. Al ARN final que contiene la fase acuosa, agregue un volumen apropiado de un stock de cloruro de sodio de cinco molares para obtener una concentración final de 0,3 molares. Agregue tres veces el volumen de etanol frío para precipitar el ARN.
Incubar durante una hora, o toda la noche, a 20 grados centígrados. Cuando termine la precipitación del ARN, centrifugue a 16, 168 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Retirar el sobrenadante y volver a suspender la paleta de ARN en 100 microlitros de agua DEPC.
Utilice un kit de aislamiento de ARN para separar el ARN de los nucleótidos trifosfato de bromouridina no incorporados y eluir el ARN de la columna con 100 microlitros de agua libre de ARNasa. Incubar el ARN en un baño de agua a 65 grados centígrados durante cinco minutos. Y luego transfiera a hielo durante al menos dos minutos.
Comience este procedimiento preparando las perlas de uranio empobrecido anti bromo mientras se precipita el ARN. Para cada muestra, agregue 500 microlitros de tampón aglutinante EDTA de fosfato salino de sodio 0.25 X a 25 microlitros de perlas sedimentadas. Centrifugar a 200 veces G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados y eliminar el sobrenadante.
Lave las cuentas tres veces con el tampón aglutinante. Después de retirar el sobrenadante del tercer lavado, agregue 500 microlitros de tampón de bloqueo a las perlas y agite suavemente durante una o dos horas a cuatro grados centígrados en un agitador de plataforma. Lavar las cuentas dos veces más con 500 microlitros de tampón aglutinante.
Retire el sobrenadante del segundo lavado y agregue 400 microlitros de tampón aglutinante a las cuentas. Transfiere 100 microlitros de ARN directamente a las perlas. Incubar con una agitación suave durante una o dos horas a cuatro grados centígrados en un agitador de plataforma.
Girar a 200 veces G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados y luego retirar el sobrenadante. A continuación, agregue 500 microlitros de tampón aglutinante a las cuentas. Girar a 200 veces G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante.
De esta manera, lave las perlas secuencialmente con tampón de unión, tampón de baja sal, tampón de alta sal y dos veces con tampón TET. Para eluir el ARN marcado con trifosfato de bromouridina de las perlas, agregue 150 microlitros de tampón de elución e incube durante cuatro minutos a 42 grados Celsius en un baño de agua. Gira brevemente y recoge el sobrenadante.
De esta manera, eluir secuencialmente dos veces con 150 microlitros y una vez con 200 microlitros de tampón de elución. De cada muestra se deben obtener alrededor de 500 microlitros de ARN marcado con trifosfato de bromouridina purificado por afinidad. Para precipitar el ARN marcado con trifosfato de bromouridina purificado por afinidad, agregue 500 microlitros de alcohol isoamílico de fenol cloroformo frío a cada muestra.
Vórtice y centrífuga a 16, 168 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga. Añadir el volumen adecuado de un caldo de cloruro sódico de cinco molares para obtener una concentración final de 0,3 molar.
Luego agregue tres veces el volumen de etanol frío. Incubar a 20 grados centígrados durante la noche para precipitar el ARN. Al día siguiente, recoja el ARN precipitado por centrifugación a 16, 168 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante y deje que la paleta se seque al aire durante 10 minutos. Resuspender la paleta de ARN en 26 microlitros de agua DPC. Determine la concentración final de ARN midiendo la absorbancia a 260 nanómetros con un espectrofotómetro.
Almacene las muestras de ARN y las alícuotas a 80 grados centígrados hasta que las necesite para la síntesis de ADNc. La transcripción específica de la cadena de trifosfato de bromouridina se utilizó para probar el requisito de ARN 14 para la terminación de la transcripción del gen ASC1 en levaduras en ciernes. El ARN marcado con trifosfato de bromouridina del mutante ARN 14-1 y sus células isogénicas de tipo salvaje se purificó y se transcribió inversamente con cebadores C, D, E, F y G. El ADNc correspondiente se amplificó por PCR utilizando los pares de cebadores B y C, B y D, B y E, B y F, y B y G, y se fraccionó en geles de agarosa.
La presencia de productos amplificados por PCR de los pares de cebadores B y E, B y F, y B y G en el mutante, refleja un fenotipo de lectura de terminación. Sin embargo, en las células de tipo salvaje, la ejecución de la transcripción en la señal estaba limitada hasta el elemento terminador, y no había ninguna ejecución de transcripción detectable en la señal más allá de la región terminadora. Este gráfico muestra la cuantificación de los geles con cinco S RNA como control de normalización.
La detección de transcripciones nacientes iniciadas por el promotor que leen a través de la señal de terminación en las células mutantes, pero no en las de tipo salvaje, confirma que el ARN 14 es un factor de terminación. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la transcripción que se ejecuta en la reacción es fundamental para obtener un resultado exitoso.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la búsqueda GRO, para responder a preguntas adicionales, como el papel de un factor en la terminación en todo el genoma. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la transcripción exploraran la terminación por otras ARN polimerasas en levaduras y sistemas eucariotas superiores. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la transcripción, ejecutarse en las reacciones y purificar las transcripciones etiquetadas nacientes.
No olvide que el ARN puede ser extremadamente inestable y siempre se deben tomar precauciones como usar guantes, mantener la temperatura alrededor de cuatro grados centígrados y usar agentes libres de ARNasa mientras se realiza este procedimiento.
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Visión general
Este artículo describe un método para analizar la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II in vivo utilizando BrUTP y el enfoque de transcripción continua específico de hebra (TRO) en levadura en brote. El protocolo también se puede adaptar para estudiar la terminación de la transcripción por otras ARN polimerasas tanto en levaduras como en eucariotas superiores.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Regulación transcripcional
- Actividad de la ARN polimerasa
- Biología molecular de la levadura
Antecedentes
- La terminación de la transcripción es un proceso crítico en la expresión génica.
- El enfoque de transcripción continua específico de hebra permite el análisis de la dinámica de la transcripción.
- Este método puede diferenciar entre varios tipos de ARN polimerasas.
- Entender los factores de terminación es esencial para dilucidar el ciclo de transcripción en la levadura.
Propósito del estudio
- Investigar la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II in vivo.
- Determinar si las polimerasas transcripcionalmente activas se inician desde la región del promotor.
- Extender los hallazgos a otras ARN polimerasas en diferentes organismos.
Métodos utilizados
- Enfoque de transcripción continua específico de hebra (TRO).
- Uso de BrUTP para el etiquetado de transcritos de ARN nacientes.
- Técnicas de permeabilización celular para un análisis efectivo de la transcripción.
- Métodos de purificación para transcritos nacientes.
Resultados principales
- El método distingue con éxito entre polimerasas que transcriben ARNm y polimerasas que transcriben de manera generalizada.
- Se obtuvieron conocimientos sobre el papel de los factores de terminación en el ciclo de transcripción.
- El enfoque se puede adaptar para su uso en eucariotas superiores.
- Se identificaron desafíos en la ejecución, como la permeabilización celular, para nuevos usuarios.
Conclusiones
- El enfoque TRO específico de hebra es efectivo para estudiar la terminación de la transcripción.
- Entender la terminación de la transcripción puede proporcionar información sobre la regulación génica.
- Este método tiene amplias aplicaciones en diferentes especies.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables precise detection of transcription termination defects in vivo, addressing a key challenge in target validation where distinguishing true promoter-initiated readthrough from pervasive transcription is essential for mechanistic de-risking. By providing strand-specific, quantitative readouts of polymerase activity beyond terminator regions, it supports predictive confidence in early discovery stages focused on RNA polymerase II and termination factor biology. The approach offers translational continuity from yeast models to higher eukaryotes, facilitating cross-species target validation and preclinical pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining whether observed transcription readthrough stems from promoter-initiated polymerase activity rather than non-specific initiation.
- Operational Value: Enables functional validation of termination factors as drug targets by isolating their specific role in the transcription cycle.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing mechanistic evidence that reduces ambiguity in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces strand-specific nascent RNA signals that serve as quantitative readouts for screening compounds or genetic perturbations affecting termination.
- Operational Value: Generates reproducible, affinity-purified BrUTP-labeled RNA suitable for downstream qPCR or sequencing applications in assay development pipelines.
- Scalability: The protocol’s reliance on standardized permeabilization and purification steps enables adaptation to multi-well formats for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects termination mechanism studies in yeast to conserved pathways in higher eukaryotes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by validating target function across model systems before moving to mammalian validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes are due to specific termination factor loss versus pervasive transcriptional noise, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, particularly when termination mechanisms are under investigation, and supports handoff to preclinical teams via standardized, quantifiable outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by distinguishing promoter-driven transcription from background noise, aiding in pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready, strand-specific nascent RNA that enables reliable comparison of genetic or pharmacological conditions affecting termination efficiency.
- Analytics: Provides amplifiable cDNA from purified BrUTP-labeled RNA, enabling quantitative PCR or sequencing readouts that help teams compare termination proficiency across conditions.
- Translational Research: Connects yeast-based termination findings to higher eukaryotes through conserved polymerase mechanisms, supporting preclinical continuity only when cross-species conservation is demonstrated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for termination analysis that can be applied across multiple targets and projects within nucleic acid-targeted discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in transcription termination studies through strand-specific discrimination.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined permeabilization, labeling, and purification steps that minimize user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering target-specific mechanistic data, reducing late-stage biological risk in RNA-focused therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of termination factor targets based on validated, quantitative evidence of functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, RNA handling, and nucleic acid purification techniques to manage unstable nascent transcripts.
- Dependent on access to BrUTP, RNA isolation reagents, phenol-chloroform workflows, and specialized beads for affinity purification of bromouridine-labeled RNA.
- Necessitates cross-team standardization between discovery biology and analytics groups to ensure consistent RNA yield, labeling efficiency, and cDNA synthesis quality.
- Adaptation to mammalian or higher eukaryotic systems may require optimization of permeabilization conditions and validation of BrUTP incorporation efficiency.
- Practical limitations include low yield of nascent transcripts and technical difficulty in RNA purification, which may affect scalability for high-throughput applications without automation support.
