Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

El objetivo general de este procedimiento es determinar la estructura de complejos macromoleculares mediante el análisis de partículas individuales de datos de criomicroscopía electrónica utilizando el software de procesamiento de imágenes SPHIRE. La crio-EM de una sola partícula se está convirtiendo en una tecnología convencional para estudiar estructuras de macromoléculas con una resolución casi atómica. SPHIRE es un novedoso paquete de software que permite el procesamiento semiautomatizado de datos crio-EM de una manera fácil de usar.

La principal ventaja de SPHIRE es el mecanismo de validación automática. La mayoría de los procedimientos deben ejecutarse una sola vez y los resultados son objetivos y reproducibles. La crio-EM de alta resolución se puede utilizar para colocar residuos individuales, proporcionando así información crucial sobre la organización y función de máquinas micromoleculares complejas.

Las personas nuevas en este método deben tener en cuenta que la obtención de una estructura de alta resolución depende en gran medida de la calidad de la muestra y de los datos de entrada. Para comenzar a usar la aplicación PHIRE, abra la GUI desde el terminal. Abra las UTILIDADES para mostrar una imagen de criomicroscopía con e2display.

Utilice la herramienta de medición incorporada para medir el eje de partículas más largo en angstrom por píxel. Abra la configuración del proyecto. Establezca el tamaño de la ventana CTF al menos en el tamaño de la caja de partículas.

Ajuste el tamaño de la caja de partículas a un número par, al menos 1 1/2 veces el diámetro de la partícula. Establezca el radio de la partícula en al menos la mitad de la longitud medida. Introduzca la simetría del grupo de puntos, si se conoce, y la masa molecular aproximada.

Registre la configuración. A continuación, en el menú PELÍCULA, abra Alineación de película de micrografía. Establezca las rutas de los archivos ejecutables unblur y summovie.

Elija una película de micrografía sin formato y sin alinear y sustituya la variable de nombre de archivo por un comodín para establecer el patrón de ruta de la micrografía de entrada. Asigne un nombre al directorio de salida. Introduzca el número de fotogramas de película, el voltaje del microscopio y la exposición por fotograma.

Ejecute el proceso para generar micrografías promedio ponderadas por dosis y sin ponderar por movimiento. A continuación, abra el menú CTER y seleccione Estimación de CTF. Establezca las micrografías sin ponderar la dosis como entrada.

Asigne un nombre al directorio de salida y rellene los parámetros de recopilación de datos. Establezca la frecuencia más baja en 0285 angstroms inversos y la frecuencia más alta en 0,285 angstroms inversos. Ejecute el proceso para generar una lista de parámetros CTF.

A continuación, abra el menú VENTANA y seleccione Selección de partículas. Establezca las micrografías ponderadas por dosis como entrada e inicie la utilidad e2boxer. Realice la selección de partículas de forma manual o automática.

Extraiga las partículas seleccionadas en pilas de imágenes y combine las pilas en una sola pila de imágenes virtuales en una base de datos BDB. Una vez que se hayan seleccionado y apilado las partículas, abra el menú ISAC y seleccione ISAC 2D Clustering. Establezca la pila de imágenes virtuales en la base de datos BDB como entrada.

Calcule el número de imágenes por clase, rellene los parámetros restantes y genere los promedios de las clases 2D. Una vez completada la clasificación 2D, utilice la utilidad Mostrar datos para ver los promedios de clase reproducibles validados.

Verifique que se representen múltiples orientaciones de partículas y que los promedios de clase sean de calidad satisfactoria. Genere una nueva pila de imágenes virtuales que contenga solo partículas que pertenezcan a los promedios de clase validados. A continuación, abra el menú VIPER y utilice la utilidad Mostrar datos para ver los promedios de la clase.

Elimine los promedios de clase de mala calidad o que muestren vistas idénticas de la partícula. Guarde los promedios de clase restantes en un nuevo archivo. A continuación, seleccione Modelo 3D inicial RVIPER y utilice la pequeña selección de promedios de clase como entrada.

Ejecute el comando para generar un modelo 3D inicial reproducible de la proteína. Inspeccione el modelo en el programa de gráficos moleculares Chimera. Compare el modelo con una estructura conocida de una proteína homóloga o dominio de la proteína de interés.

Regrese al menú VIPER en SPHIRE y seleccione Crear referencia 3D. Genere un modelo de referencia 3D inicial con el tamaño de píxel correcto y una máscara 3D. Abra el menú MERIDIEN y seleccione Refinamiento 3D.

Rellene la pila de imágenes de entrada y las rutas iniciales del archivo de referencia 3D. Asigne un nombre al directorio de salida y defina la máscara del modelo de referencia como máscara 3D. Seleccione Aplicar máscara 2D dura.

Establezca la resolución inicial entre 20 y 25 angstroms, y ejecute el refinamiento 3D para producir los medios volúmenes sin filtrar. A continuación, visualízalo en medio volumen sin filtrar en Chimera. Determine un umbral de binarización en el que todas las densidades de proteínas estén conectadas, pero los artefactos de ruido no.

Vuelva al menú MERIDIEN de SPHIRE y abra Máscara 3D adaptable. Introduzca la entrada de medio volumen sin filtrar y el umbral de binarización. Asigne un nombre a la máscara de salida y ejecute el proceso para generar una máscara 3D de bordes suaves.

A continuación, abra Enfoque y seleccione los medios volúmenes sin filtrar. Establezca la máscara 3D de borde suave de medio volumen como la máscara proporcionada por el usuario. Ejecute el proceso que fusiona los medios volúmenes y, a continuación, filtra y enfoca el volumen combinado.

Abra el archivo de registro para ver la estimación final de la resolución. Genere un mapa 3D de la distribución angular de partículas de la pila de imágenes de entrada generada durante el refinamiento 3D. Abra el modelo 3D afilado y filtrado en Chimera.

Inspeccione el mapa de densidad y sus características de alta resolución. Abra la distribución angular en Chimera y verifique que los ángulos de Euler estén distribuidos isotrópicamente. Abra el menú SORT3D y seleccione Estimación de variabilidad 3D.

Genere un mapa de variabilidad 3D a partir de la pila virtual de imágenes de partículas pertenecientes a los promedios de clase validados. Genere una máscara 3D binarizada a partir de este mapa de variabilidad para la posterior agrupación en clústeres 3D enfocados. A continuación, abra el RSORT3D Clustering 3D y seleccione el directorio del refinamiento 3D anterior como entrada.

Asigne un nombre al directorio de salida y defina las máscaras 3D globales y enfocadas. Utilice al menos de 5.000 a 10.000 imágenes por grupo para grandes conjuntos de datos. Ejecute el proceso de ordenación para generar volúmenes de cada grupo 3D homogéneo.

Utilice Quimera para identificar la estructura con la resolución aparente más alta. Vuelva al menú SORT3D en SPHIRE y abra Refinamiento de subconjunto local. Establezca la ruta del archivo de texto del subconjunto en el archivo de clúster de ID de partícula correspondiente a la estructura de resolución más alta.

Establezca el directorio de refinamiento 3D en el directorio que contiene los medios volúmenes sin filtrar y la iteración de reinicio en la iteración de resolución más alta del refinamiento 3D anterior. Ejecute el comando para generar medios volúmenes locales sin filtrar. A continuación, cree una máscara 3D de bordes suaves a partir de uno de los medios volúmenes locales.

Combine los medios volúmenes locales y enfoque el volumen combinado sin aplicar un filtro de paso bajo. A continuación, abra el menú LOCALRES y haga clic en Resolución local. Seleccione los medios volúmenes locales.

A continuación, seleccione la mascarilla de bordes suaves local. Establezca la resolución general en la resolución absoluta estimada al enfocar el volumen local combinado. Calcule la resolución local del volumen.

A continuación, abra Filtro local 3D. Establezca el volumen local nítido sin filtrar como entrada. Seleccione el mapa de resolución local y la máscara 3D de bordes suaves.

Aplique el filtro de resolución local al volumen enfocado para producir el modelo 3D final. Abra el mapa de volumen y resolución local resultante en Chimera. Inicie la herramienta Color de superficie y elija el volumen en el menú y la opción de colorear la superficie de acuerdo con la resolución local.

El complejo tóxico TcdA1 se visualizó mediante criomicroscopía. Todas las imágenes mostraban partículas individuales claramente discernibles y anillos de Thon que se extendían a una resolución de más de cuatro angstroms en el espectro de potencia. Las partículas se seleccionaron utilizando e2boxer y luego se extrajeron en una pila de imágenes.

Los promedios de clases bidimensionales se generaron mediante alineación y agrupamiento estables iterativos, o ISAC. Estos promedios de clase se utilizaron para calcular un modelo 3D reproducible con RVIPER. Este modelo concordaba bien con la estructura cristalina previamente resuelta de TcdA1.

El refinamiento 3D automático de este modelo utilizando MERIDIEN generó una resolución casi atómica map. 3D el análisis de variabilidad indicó flexibilidad localizada de la región terminal N marcada con histidina, los dominios de unión al receptor y el dominio de unión a TcB. Se realizaron cálculos de resolución local.

El modelo agudizado se filtró localmente y se aplicó una escala de colores correspondiente a la resolución local, mostrando concordancia topológica entre las áreas de alta variabilidad y las áreas de baja resolución. La estructura crio-EM final de TcdA1 con una resolución de 3,5 angstrom mostró densidades claras para la mayoría de las cadenas laterales. Un mapa de densidad con este nivel de detalle se puede utilizar aún más para la construcción de modelos atómicos de novo.

Con este enfoque, se puede obtener una estructura de resolución casi atómica en cuestión de horas o unos pocos días, sin información estructural a priori. Al intentar este procedimiento, utilice solo datos de alta calidad y compruebe los resultados intermedios. La heterogeneidad composicional y estructural de la muestra crio-EM podría ser un factor limitante para alcanzar una resolución casi atómica.

Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo usar SPHIRE para la determinación estructural de crio-EM. Como ha visto, las rutinas de agrupamiento incluidas en SPHIRE le permitirán no solo resolver la estructura de la proteína de interés, sino también estudiar la dinámica conformacional y proporcionar información mecanicista crucial sobre mecanismos moleculares complejos.