Name: Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprende a generar agregados de macrófagos infectados con Mycobacterium tuberculosis en placas de 96 pocillos para evaluar la eficacia de fármacos antituberculosos. Este ensayo compatible con BSL-2 mejora el desarrollo temprano de medicamentos.

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Agradecemos al Dr. Frank Wolschendorf por el acceso al lector automático de placas de imágenes Cytation 3. Este trabajo fue financiado en parte por la subvención R01-AI104499 de los NIH a OK. Partes del trabajo se realizaron en las instalaciones del CFAR de la UAB y por el UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, que están financiados por el AI027767 P30 de los NIH/NIAID y por el NIH 5P30 AR048311.

NOTA: Como M. tuberculosis mc 2 6206 es una cepa no virulenta 17, 18, todos los trabajos en este protocolo se puede realizar en una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2). 1. Condiciones de cultivo para la proteína verde fluorescente que expresan M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb-GFP) NOTA: La M. tuberculosis H37Rv derivado auxótrofo cepa 6206 mc 2 (Δ PANCD, Δ leuCD) transformada con el plásmido que expresa GFP pMN437 se utiliza en este protocolo 16. Es posible sustituir la cepa Mtb-GFP con no expresan GFP cepa de tipo salvaje para permitir un acceso más fácil de la cepa para los investigadores. Sin embargo, la expresión de GFP es deseable para permitir la confirmación visual de la fagocitosis y la formación de agregados de Mtb / macrófagos. para long almacenamiento a largo plazo, Mtb-GFP se congelaron a -80 ° C en 7H9 medio completo (descrito en el paso 1.1) suplementado con 20% de glicerol. <ol><li> Preparar completa medios Mtb-GFP (7H9-C), completándolo medio 7H9 con 10% de Middlebrook OADC, 0,02% tiloxapol, / ml de ácido D-pantoténico 24 mg, 50 mg / ml de L-leucina y 50 mg / ml de higromicina B. </li><li> Descongelar un vial de Mtb-GFP y añadir a 10 ml de 7H9-C en un matraz de fondo cuadrado PETG 30 mL. </li><li> Incubar a 37 ° C en un agitador rotatorio (50 rpm). Tomar medidas de densidad óptica (OD 600) cada pocos días hasta DO600 alcanza 1,0 (aproximadamente 5-8 días). </li><li> Diluir y la cultura paso según sea necesario para mantener un OD 600 entre 0,2 a 1,0. </li><li> Para la infección, utilice una cultura establecida de Mtb-GFP dentro de la fase de crecimiento logarítmico (DO 600 de 0,6-1). Para evitar culturas clumpy, sonicar el frasco de cultivo de Mtb en un baño de agua (130 W; 3 x 5 s pulsos) once o dos veces a la semana </li></ol> 2. Las condiciones de cultivo para THP-1 células <ol><li> Preparar completa THP-1 medio celular (RPMI-C), completándolo RPMI 1640 con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal, 2 mM L-glutamina y HEPES 10 mM. </li><li> Se incuban las células en un matraz T-75 a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro o citometría de flujo cada dos días y mantener las células THP-1 a una densidad entre ,1-0.600.000 por ml. </li></ol> 3. Protocolo de infección para generar estructuras de Mtb / macrófagos de agregado <ol><li> THP-1 de preparación de células (por placa de 96 pocillos) <ol><li> Centrifugar 7 x 10 6 células THP-1 a 250 g durante 5 min. Volver a suspender en 7 ml de RPMI-C. </li></ol></li><li> Preparación de Mtb-GFP <ol><li> Centrifugar 2,8 x 10 8 Mtb-GFP a 3200 xg durante 5 min en una centrífuga de balanceo-cubo ucantar una conversión de OD 600 = 1,0 x 10 3 8 bacterias / ml. </li><li> Lavar una vez con RPMI-C y se centrifuga como en el paso 3.2.1. </li><li> Volver a suspender en 7 ml de RPMI-C y agitar durante 10 s. </li></ol></li><li> Infección NOTA: Véase la figura 1 para la plantilla. <ol><li> Preparar una placa de 96 pocillos mediante la adición de 200 l de agua estéril en las filas A y H y las columnas 1 y 12 para una llanta de agua para evitar la evaporación del medio de cultivo. </li><li> Añadir 200 l RPMI-C a la columna 2 (B2 a G2) para el control de fondo (blanco). </li><li> Para infectar, añadir la suspensión de Mtb-GFP (paso 3.2) para THP-1 suspensión de células (paso 3.1) y mezclar bien con la pipeta. La final de la densidad de células THP-1 es 5 x 10 5 por ml y la multiplicidad correspondiente de la infección es 40. </li><li> Verter el / Mtb-GFP suspensión THP-1 en un depósito de 25 ml. </li><li> Añadir 200 l de células THP-1 / Mtb-GFP suspensión de los 96 pozos restantes (B3 a G11) usinga pipeta multicanal. NOTA: Si se trabaja con placas múltiples de 96 pocillos, resuspender regularmente el THP-1 suspensión / Mtb queda en el depósito para asegurar que se añadió una mezcla homogénea a cada pocillo. </li><li> Incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 7-10 días. </li><li> Cambiar el medio cada 2 días retirando lentamente 100 l pasó medios desde la parte superior de cada pocillo y suavemente la adición de 100 l de pre-calentado medio RPMI-C utilizando una pipeta multicanal. No resuspender pozos y molestar a los agregados Mtb / macrófagos en el fondo de los pocillos. </li><li> Examinar visualmente los pozos por microscopía de fluorescencia (objetivo 4-10X) al día, tomando nota del tamaño de los agregados Mtb / macrófagos. Durante el día 7-10, Mtb agregados / macrófagos deben ser lo suficientemente grande (véase la figura 2 para referencia) para proceder a las pruebas de la eficacia del fármaco (Sección 4). </li><li> Si se desea, imágenes de la captura de los 96 pocillos utilizando un sistema de imágenes de células automatizado equipadoscon campo brillante y el filtro de GFP establece para documentar Mtb formación de agregados / macrófagos. NOTA: Si los usuarios no tienen acceso a un sistema automatizado de imágenes, las imágenes de pozos representativos pueden ser tomadas con cualquier microscopio adecuado con capacidad de GFP y de campo brillante. </li></ol></li></ol> 4. Ensayo de inhibición del crecimiento para evaluar la eficacia de medicamentos contra Mtb Derivado de MTB / agregados de macrófagos <ol><li> Preparación de la droga (por triplicado condiciones para dos fármacos) NOTA: Consulte la Figura 1A para la plantilla. <ol><li> En una placa de 96 pocillos separada, añadir 125 l de los medios de comunicación 7H9-C a través de B2 a G10. </li><li> Preparar dos fármacos en el doble de la más alta concentración final deseada en 1 ml de 7H9-C para tener en cuenta la dilución en el paso 4.2.4. </li><li> Añadir 250 l de cada fármaco a los pocillos B11-C11-D11 y E11-F11-G11, respectivamente, para los tratamientos por triplicado. </li><li> Usando una pipeta multicanal, en serie dilute los fármacos de ensayo de dos veces moviendo 125 l de B11-B10-G11 en G10. Mezclar pipeteando 5 veces en cada paso. </li><li> Continuar para pasar 125 l de una columna a otra (derecha a izquierda) a través de la placa, y dejar después de la columna 4. </li><li> Después de mezclar la columna 4, deseche 125 l en un contenedor de residuos. Las columnas 2 y 3 no deben contener alguna droga para permitir su uso como fondo (espacio en blanco) y los controles de crecimiento positivas. NOTA: Como alternativa, siga plantilla en la figura 1B para las bibliotecas de pruebas de drogas. Cada placa de 96 pocillos puede acomodar a 58 medicamentos en una sola concentración. Preparar esta placa de fármaco usando el doble de la concentración final deseada, ya que se diluirá en un medio en el paso 4.2.4. </li></ol></li><li> El tratamiento farmacológico: <ol><li> Recuperar la placa de 96 pocillos que contenía el Mtb infectados con macrófagos (agregados Mtb / macrófagos). </li><li> decantar cuidadosamente todos los pozos correspondientes (B2) a través de G11 con una pipeta multicanal.Realice esto de una manera de dos pasos: primero eliminar 150 l sin inclinar la placa, y luego eliminar residuos de medios (~ 50 l) por la inclinación de la placa y la inserción de la punta de la pipeta hasta el borde inferior del pozo. Como MTB / macrófagos agregados son adherentes a la parte inferior del pozo, ningún material se debe perder. </li><li> Añadir con cuidado 100 l de 7H9-C medios de comunicación a todos los pocillos pertinentes (B2 a través de G11) de la placa que contiene los agregados / macrófagos Mtb. </li><li> Con una pipeta de múltiples canales, transferir 100 l de la droga que contiene 96 pocillos de placa (etapa 4.1) a los pocillos correspondientes de la placa de la infección. </li><li> Colocar en bolsa sellada y se incuba durante 3 días a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 5. La cuantificación de la eficacia de medicamentos usando el ensayo de microtitulación resazurina <ol><li> Preparar resazurina solución madre a una concentración final de 0,8 mg / ml en H 2 O. Se filtra a través de 0,22 micras de tamaño de poro de membrana de PVDF para la esterilización.</li><li> Preparar la solución de trabajo resazurina mezclando resazurina solución madre, H2O y Tween-80 (solución al 20% en H2O) en una proporción de 2: 1: 1. Las concentraciones finales son 0,4 mg / ml de resazurina y 5% de Tween-80. </li><li> El uso de un lector de placas, la configuración de un programa para leer la fluorescencia a 530 nm de excitación y 590 nm de emisión cada 30 minutos durante 24 horas a 37 ° C. lector de placas pre-calentamiento a 37 ° C. </li><li> Añadir 20 l de solución de trabajo de la resazurina a todos los pocillos pertinentes (B2 a través de G11) de la placa tratado con fármaco (etapa 4.11) usando una pipeta multicanal. </li><li> Colocar la placa en el lector de placas e iniciar el programa establecido en el paso 5.3. NOTA: Para facilitar el procesamiento de grandes volúmenes de placas de ensayo, es suficiente para desarrollar el ensayo en una incubadora a 37 ° y realizar solo fluorescencia lee cada 24 h. Esto es aplicable a los usuarios que no tienen acceso a un lector de placas con capacidades cinéticas e incubación también. </li></ol>

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<li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos descrito en detalle un modelo de infección de Mtb alternativa adecuada para las pruebas de la eficacia del fármaco. Este modelo tiene en cuenta dos factores clave que deben ser considerados en mayor medida durante el proceso de desarrollo de la primera medicamentos contra la tuberculosis: la presencia de barreras fisiológicamente relevantes a la penetración del fármaco y cambios metabólicos de Mtb durante la infección. Si bien ya hemos demostrado los beneficios de nuestro modelo de infecció...

<html> La tuberculosis (TB) sigue siendo una grave amenaza mundial de la salud a pesar de la disponibilidad de regímenes de quimioterapia contra la tuberculosis durante más de 40 años 1. Esto se debe en parte a la necesidad de largos períodos de tratamiento de más de 6 meses utilizando múltiples combinaciones de fármacos, lo que conduce a paciente incumplimiento 2. La aparición de la tuberculosis resistente a los medicamentos en los últimos años se ha agravado aún más los problemas en un campo en el éxito del desarrollo de fármacos clínicamente aprobados es prácticamente inexistente 3. De hecho, a pesar del desarrollo exhaustiva fármaco anti-TB, sólo un único fármaco ha sido aprobado por la FDA para uso clínico en los últimos 40 años 4. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas generaciones de fármacos antituberculosos para hacer frente a este problema. Un problema clave en el descubrimiento de fármacos TB es la falta de éxito de la transferencia a partir de compuestos con actividad in vitro de la eficacia en el ámbito clínico= &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Inicialmente, los enfoques basados diana se utilizan para la detección de drogas anti-Mtb 5, que no se tradujo en células bacterianas enteras. Incluso cuando se utilizan células Mtb, a menudo se lleva a cabo utilizando cultivos de caldo crecido, que no predicen con precisión la eficacia del fármaco in vivo 8, 9. Estos problemas han sido reconocidos y ensayos de cribado de fármacos contra macrófagos que contienen Mtb o latente Mtb se han establecido con éxito 8, 10, 11, 12. Sin embargo, incluso estos ensayos más avanzados no dan suficiente consideración a las barreras de penetración que los medicamentos encuentran en las lesiones pulmonares no vascularizados, y en los focos necróticos en el sitio de la infección. En efecto, Incluso para la primera línea de la tuberculosis rifampicina fármaco, la dosis subóptima ha sido cuestionada debido a insuficiente en el tejido vivo y el líquido cefalorraquídeo (LCR) La penetración de 13, 14, 15, así como una disminución de la eficacia contra intracelular Mtb 8, 9. Como tal, los nuevos modelos y ensayos que tengan en cuenta estos parámetros durante el proceso de desarrollo temprana ventaja, mejoraría sin duda los esfuerzos de descubrimiento de fármacos antituberculosos. Para hacer frente a esta necesidad, hemos establecido recientemente un modelo de bajo costo, rápida, y BSL-2 compatibles alternativa infección para las pruebas de eficacia de drogas Mtb 16. Este modelo de infección producida densamente poblado Mtb dentro de grandes estructuras de agregados de macrófagos, que recapitula las barreras de penetración celular fisiológicamente relevantes y generó macrófagos passaged <em&gt; Mtb con un estado fisiológico alterado parecido latente Mtb. Mtb derivado de este modelo de infección se combinó con el ensayo de la resazurina de microtitulación (REMA) para evaluar la eficacia del fármaco, que produjo resultados consistentes con otros modelos de infección intracelular y se correlacionó bien con la capacidad reportada de medicamentos comunes de TB para conseguir altas concentraciones de CSF en relación con las concentraciones séricas 16. A continuación se describe en detalle la generación de estructuras agregadas MTB / macrófagos para producir macrófagos pases Mtb adecuada para las pruebas de sensibilidad a los medicamentos utilizando REMA. En particular, se muestra cómo este sistema la infección podría ser adaptado a un formato de 96 pocillos para la compatibilidad con la detección rendimiento de los fármacos antituberculosos de candidatos.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Siga las recomendaciones del fabricante</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>Prepare una solución madre al 20% en H2O; filtro esterilizar</td></tr> la <tr><td>sal hemicálcica de ácido D-pantoténico</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>Prepare una solución madre de 24 mg/mL en H2O; filtro esterilizar</td></tr><tr><td>L-leucina</td><td>MP Biomedicals 194694</td><td></td><td>Prepare una solución madre de 50 mg/ml en H2O; filtro de esterilización</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>Prepare una solución madre de 200 mg/mL en H2O</td></tr><tr><td>Nalgene Square Botella de medios de PETG Thermo</td><td>Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medios</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Citación 3 lector de placas</td><td>Biotek</td><td></td><td>Intercambiable con cualquier lector de placas fluorescente y microscopio</td></tr><tr><td>Gen5 Software Biotek</td><td></td><td></td><td>Registro y análisis de coversión de rezasurin</td></tr><tr><td>rifampicina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>Prepare una solución madre de 10 mg/ml en H2O</td></tr><tr><td>Clorhidrato de moxifloxacina</td><td>Acros Organics 457960010</td><td></td><td>Prepare una solución madre de 10 mg/mL en H2O</td></tr><tr><td>Resazurin Sodium Salt Sigma</td><td></td><td>R7017</td><td>Prepare 800 &mu; g/mL de solución madre en H2O; esterilizar por filtro</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific T164500</td><td></td><td>Prepare una solución madre al 20% en H2O; esterilizar por filtro</td></tr></tbody></table>

un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

El proceso temprano de desarrollo de fármacos antituberculosos se ve obstaculizado por la ineficiente traducción de compuestos con actividad in vitro a la eficacia en el entorno clínico. Es probable que esto se deba a la falta de consideración de las barreras de penetración celular fisiológicamente relevantes que existen en el huésped infectado. Recientemente establecimos un modelo de infección alternativo que genera grandes estructuras agregadas de macrófagos que contienen M. tuberculosis (Mtb) densamente empaquetada en su núcleo, que era adecuado para las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos. Este modelo de infección es barato, rápido y, lo que es más importante, compatible con BSL-2. Aquí, describimos los procedimientos experimentales para generar estructuras agregadas de Mtb/macrófagos que producirían Mtb pasadas por macrófagos para pruebas de susceptibilidad a medicamentos. En particular, demostramos cómo este sistema de infección podría adaptarse directamente al formato de placa de 96 pocillos, mostrando capacidad de rendimiento para el cribado de bibliotecas de compuestos contra Mtb. En general, este ensayo es una valiosa adición a la caja de herramientas de descubrimiento de fármacos Mtb actualmente disponible debido a su simplicidad, rentabilidad y escalabilidad.

Para confirmar la solidez de la adaptación de este modelo de infección al formato de placa de 96 pocillos, que aquí examinamos la sensibilidad a los medicamentos de Mtb derivado de nuestra 96 pocillos adaptada modelo de infección a la rifampicina (RIF) y moxifloxacina (moxi) de acuerdo con la plantilla dada en la figura 1A. Se demuestra que la generación de estructuras de agregados de macrófagos MTB / clave para este ensayo se puede producir de forma fi...

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

El objetivo general de este procedimiento es generar de forma reproducible estructuras agregadas de macrófagos infectados con mycobacterium tuberculosis en formato de placa de 96 pocillos para pruebas de susceptibilidad a fármacos mediante un colorante de viabilidad. Este método puede mejorar el proceso temprano de desarrollo de fármacos para compuestos anti tuberculosis, el cual se ve obstaculizado por la traducción poco productiva de compuestos candidatos al entorno clínico. La principal ventaja de este modelo de infección sencillo, económico y compatible con BSL-2 es que reproduce barreras de penetración celular fisiológicamente relevantes, similares a los granulomas de tuberculosis.Esto produce resultados de susceptibilidad a fármacos más predictivos de la eficacia in vivo. Comience este procedimiento preparando la proteína verde fluorescente expresada por M.tuberculosis MC squared 6206, denominado en adelante MTBGFP, para la infección. Tenga en cuenta que esta es una cepa avirulenta, por lo que todo el trabajo en el protocolo descrito aquí puede realizarse en una instalación de nivel de bioseguridad dos.Para cada placa de 96 pocillos, centrifugar 2,8 × 10⁸ MTBGFP a 3.200 × g durante cinco minutos en una centrífuga con rotor de cestillos oscilantes. Tras la centrifugación, aspirar el sobrenadante y añadir cinco mililitros de RPMIC para lavar las bacterias. Pippetear hacia arriba y hacia abajo para resuspender la célula.Luego, centrifugue nuevamente. Después de la segunda centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda las células bacterianas en siete mililitros de RPMIC; a continuación, vortexee durante 10 segundos. A continuación, para cada placa de 96 pocillos que se vaya a preparar, centrifugue siete veces 10 a la sexta células monocíticas humanas THP1 a 250 × g durante cinco minutos.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda las células THP1 en siete mililitros de RPMIC. A continuación, prepare una placa de 96 pocillos para la infección agregando 200 microlitros de agua estéril a los pocillos de las filas A y H y las columnas 1 y 12. Este borde de agua evitará la evaporación del medio de cultivo.Añada 200 microlitros de RPMIC a la columna dos, desde B2 hasta G2, para el control de fondo o blanco. Para infectar el monocito THP1, use una pipeta para transferir toda la suspensión bacteriana preparada de MTBGFP a la suspensión de células THP1 y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. La densidad final de células THP1 es de cinco veces 10 a la quinta por mililitro y la multiplicidad de infección correspondiente es de 40.A continuación, vierta la suspensión de THP1 MTBGFP en un reservorio de 25 mililitros y, utilizando una pipeta multicanal, agregue 200 microlitros de la suspensión de THP1 MTBGFP a todas las 96 pocilas restantes, desde E3 hasta G11. Incube la placa a 37 grados Celsius, con 5%CO2 durante siete a 10 días. Cada dos días durante la incubación, utilice una pipeta multicanal para cambiar el medio eliminando lentamente 100 microlitros del medio gastado de la parte superior de cada pocila y agregando suavemente 100 microlitros de RPMIC precalentado.Al cambiar el medio, es importante tener cuidado de no perturbar los agregados de macrófagos con M. tuberculosis en el fondo de las pocilas. Examine visualmente las pocilas cada día utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con campos claros y filtros para GFP, con un objetivo de cuatro a 10 X. Observe el tamaño de los agregados de macrófagos con M. tuberculosis y capture imágenes si lo desea.Deben transcurrir entre siete y diez días para que los agregados de macrófagos con MTB sean lo suficientemente grandes como para proceder a la prueba de eficacia de fármacos, tal como se describe más adelante en el video. Para la prueba de fármacos, prepare dos fármacos antituberculosos por triplicado en una nueva placa de 96 pocillos de la siguiente manera. Primero, agregue 125 microlitros de medio 7H9C a los pocillos B2 hasta G10.A continuación, prepare los dos fármacos a doble de la concentración final deseada más alta en un mililitro de 7H9C. Mediante una pipeta, agregue 250 microlitros de cada fármaco a los pocillos B, C y D 11, y luego a E, F y G 11 respectivamente, para tratamientos por triplicado. A continuación, utilizando una pipeta multicanal, diluya seriamente los fármacos de prueba al doble al transferir 125 microlitros del pocillo B 11 al G 11 hacia los pocillos B 10 al G 10.Mezcle mediante pipeteo cinco veces en cada paso. Continúe transfiriendo 125 microlitros de columna a columna de derecha a izquierda a través de la placa, y deténgase después de la columna cuatro. Después de mezclar la columna cuatro, deseche 125 microlitros en un recipiente de desecho.Las columnas dos y tres no deben contener ningún fármaco. Esto permitirá utilizarlas como fondo y como controles positivos de crecimiento. A continuación, retire la placa de 96 pocillos que contiene los macrófagos infectados con MTB del incubador.Sin inclinar la placa, utilice una pipeta multicanal para retirar 150 microlitros de medio de los pozos B desde el dos hasta el G 11. Luego incline la placa como se muestra aquí, inserte las puntas de la pipeta en el borde inferior de los pozos y retire el medio restante, aproximadamente 50 microlitros. Dado que los agregados de MTB y macrófagos se adhieren al fondo del pozo, no se debería perder ningún material.Sin embargo, la eliminación del medio debe ser lo más suave posible y se debe tener cuidado para evitar la resuspensión durante este proceso. Añada suavemente 100 microlitros de medio 7H9C a los pocillos B desde el dos hasta el G 11 de la placa, que contienen los agregados de macrófagos MTB. Utilizando una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros del fármaco que contiene la placa de 96 pocillos a los pocillos correspondientes de la placa de infección.Luego, coloque la placa en una bolsa sellada e incúbela durante tres días a 37 grados Celsius. El ensayo de resazurina depende de las especies oxidativas producidas por el MTB metabólicamente activo para convertir la resazurina azul en resorufina fluorescente de color rosa. El cambio de color y fluorescencia puede utilizarse como marcador sustituto para determinar la cantidad de crecimiento bacteriano.Prepare una solución stock de resazurina a una concentración final de 8 miligramos por mililitro en agua. Filtre a través de una membrana de PVDF con un tamaño de poro de 22 micrómetros para esterilizar. Prepare una solución de trabajo en resazurina mezclando la solución stock, agua y Tween-80 en una proporción de dos a uno a uno.Las concentraciones finales son 4 miligramos por mililitro de resazurina y 5% de Tween-80. Utilizando un lector de placas, configure un programa para leer la fluorescencia con una excitación de 530 nanómetros y una emisión de 590 nanómetros durante 24 horas cada 30 minutos a 37 grados Celsius. Precaliente el lector de placas a 37 grados Celsius.Utilizando una pipeta multicanal, agregue 20 microlitros de la solución de trabajo de resazurina a los pocillos B desde el dos hasta el G 11 de la placa tratada con fármaco. Coloque la placa en el lector e inicie el programa. Para confirmar la robustez de la adaptación de este modelo de infección al formato de placa de 96 pocillos, se evaluó la susceptibilidad de MTB a la rifampicina RIF y a la moxifloxacina moxy según se describe en este video.Como se muestra aquí, se generaron con éxito estructuras de agregados de macrófagos con MTB en un formato de placa de 96 pocillos, permitiendo así la compatibilidad con alto rendimiento. Para medir cuantitativamente la conversión de la resazurina como indicador del crecimiento bacteriano, se monitoreó cinéticamente la fluorescencia de los pocillos individuales durante 24 horas. La presencia de células viables de MTB se determina por la conversión del colorante azul resazurina a su forma reducida rosa, lo cual se refleja cuantitativamente en las redes de fluorescencia relativa en el punto de tiempo de saturación.Estos gráficos mini representativos muestran las unidades de fluorescencia resultantes en el eje Y frente al tiempo mostrado en el eje X. Para generar las curvas de letalidad por susceptibilidad a fármacos, los pocillos tratados con rifampicina y moxifloxacino se normalizaron respecto al control sin fármaco con crecimiento máximo de MTB como 100% de supervivencia. Las señales de fondo del control en blanco se restaron de cada pocillo de muestra.Se representó el porcentaje de supervivencia para cada concentración individual del tratamiento con fármaco para generar una curva de letalidad. Estos datos muestran que la concentración inhibitoria mínima, que define la concentración más baja del antibiótico en la que se observa una inhibición del crecimiento del 90%, es mayor de dos microgramos por mililitro, tanto para rifampicina como para moxifloxacino frente a MTB derivada de nuestro modelo de infección. Por lo tanto, la concentración inhibitoria mínima de estos dos fármacos frente a MTB utilizando nuestro modelo de infección y ensayo refleja mejor la actividad de estos fármacos in vivo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar de forma confiable y reproducible estructuras de agregados de macrófagos infectados con MTB para pruebas de susceptibilidad a fármacos utilizando el ensayo de resazurina. Siguiendo este procedimiento, modificar la plantilla de fármacos de dos fármacos, como se muestra, a un panel de biblioteca de 58 fármacos se puede realizar fácilmente para permitir el cribado de fármacos de alto rendimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un ensayo para evaluar la eficacia de medicamentos contra la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Se genera un modelo de infección in vitro que contiene agregados de Mtb/macrófagos que imita la infección in vivo. Tras la introducción de antibióticos adecuados, su eficacia se prueba mediante un ensayo de resuzarina para controlar la supervivencia de las bacterias con concentraciones crecientes del fármaco.

Un ensayo para evaluar la eficacia de un fármaco frente a un modelo de infección por Mycobacterium tuberculosis

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

La cuantificación rápida y eficiente del crecimiento intracelular de M. tuberculosis es crucial para buscar mejores terapias contra la tuberculosis (TB). Este protocolo describe un ensayo de detección colorimétrica basado en caldo utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido para cuantificar el crecimiento de Mtb en macrófagos tratados con terapias candidatas dirigidas al huésped.

Un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis

La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.

Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Este estudio proporciona un protocolo para evaluar la interacción de Mycobacterium tuberculosis con el sensor microbiano SLAMF1. Los ensayos se llevaron a cabo en macrófagos derivados de monocitos humanos mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Las herramientas descritas son relevantes para estudiar las interacciones entre patógenos e inmunorreceptores.

Ensayos de fluorescencia para el estudio de la interacción de Mycobacterium tuberculosis con el receptor inmunitario SLAMF1

Mycobacterium tuberculosis forma biofilms de drogas tolerantes cuando se cultivan en ciertas condiciones. Aquí se describen los métodos para el cultivo de M. biopelículas la tuberculosis y la determinación de la frecuencia de las drogas persisters tolerantes. Estos protocolos serán útiles para futuros estudios sobre los mecanismos de tolerancia a las drogas en M. la tuberculosis.

Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis Las biopelículas

La tuberculosis y la malaria son dos de las infecciones más prevalentes en los humanos y las principales causas de morbilidad y mortalidad en las poblaciones pobres de las zonas tropicales. Hemos establecido un sistema de modelo experimental para estudiar los resultados de la coinfección tuberculosis-la malaria en ratones tras la exposición a ambos patógenos a través de su vía natural de infección.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei</i

Un microarray de la amplificación de PCR asimétrica combina la amplificación y la hibridación de microarrays en una sola cámara, lo que simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final. La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de diagnósticos basados ​​en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos más bajos recursos.

Demostración de un resistente a múltiples fármacos<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Microarray Amplificación

Aprende a generar agregados de macrófagos infectados con Mycobacterium tuberculosis en placas de 96 pocillos para evaluar la eficacia de fármacos antituberculosos. Este ensayo compatible con BSL-2 mejora el desarrollo temprano de medicamentos.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases

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