Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases Mycobacterium tuberculosis

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

El objetivo general de este procedimiento es generar de forma reproducible estructuras agregadas de macrófagos infectados con Mycobacterium tuberculosis en formato de placa de 96 pocillos para pruebas de susceptibilidad a fármacos utilizando un colorante de viabilidad. Este método puede mejorar el proceso temprano de desarrollo de fármacos para compuestos antituberculosos, que se ve obstaculizado por la traducción improductiva de los compuestos candidatos al entorno clínico. La principal ventaja de este modelo de infección simple, económico y compatible con BSL dos es que recapitula barreras de penetración celular fisiológicamente relevantes, que recuerdan a los granulomas de tuberculosis.

Esto produce resultados de susceptibilidad a los fármacos más predictivos de la eficacia in vivo. Comience este procedimiento preparando la proteína fluorescente verde que expresa M. tuberculosis MC squared 6206, en lo sucesivo denominada MTBGFP, para la infección. Tenga en cuenta que se trata de una cepa virulenta, por lo que todo el trabajo en el protocolo descrito aquí se puede realizar en una instalación de nivel dos de bioseguridad.

Por cada placa de 96 pocillos que se va a instalar, centrifugar a 2,8 veces 10 al octavo MTBGFP a 3, 200 veces G durante cinco minutos en una centrífuga de cubo oscilante. Después del centrifugado, aspire el sobrenadante y agregue cinco mililitros de RPMIC para lavar las bacterias. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender la célula.

A continuación, vuelva a centrifugar. Después del segundo centrifugado, vierta el sobrenadante y vuelva a suspender las células bacterianas en siete mililitros de RPMIC, luego en vórtice durante 10 segundos. A continuación, por cada placa de 96 pocillos que se va a instalar, centrifugar siete veces 10 a la sexta célula monocítica humana THP1 a 250 veces G durante cinco minutos.

Después de la centrifugación, vierta el sobrenadante y vuelva a suspender las células THP1 en siete mililitros de RPMIC. A continuación, prepare una placa de 96 pocillos para la infección añadiendo 200 microlitros de agua estéril a los pocillos de las filas A y H y de las columnas uno y 12. Este borde de agua evitará la evaporación del medio de cultivo.

Agregue 200 microlitros de RPMIC a la columna dos, B dos a G dos, para el control de fondo o en blanco. Para infectar el monocito THP1, use una pipeta para transferir toda la suspensión bacteriana MTBGFP preparada a la suspensión celular THP1 y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. La densidad final de células THP1 es de cinco por 10 a la quinta por mililitro y la correspondiente duplicidad de infección es de 40.

A continuación, vierta la suspensión THP1 MTBGFP en un depósito de 25 mililitros y, a continuación, con una pipeta multicanal, añada 200 microlitros de suspensión THP1 MTBGFP a todos los 96 pozos restantes, desde el E tres hasta el G 11. Incubar la placa a 37 grados centígrados, con 5% de CO2 durante siete a 10 días. Cada dos días durante toda la incubación, utilice una pipeta multicanal para cambiar el medio retirando lentamente 100 microlitros de medio gastado de la parte superior de cada pocillo y añadiendo suavemente 100 microlitros de RPMIC precalentado.

Al cambiar el medio, es importante tener cuidado de no alterar los agregados de macrófagos MTB en el fondo de los pozos. Cada día examine visualmente los pozos utilizando un microscopio de fluorescencia, equipado con sistemas de filtros de campo claro y GFP con un objetivo de cuatro a 10 veces. Anote el tamaño de los agregados de macrófagos MTB y capture imágenes si lo desea.

Para el día siete a 10, los agregados de macrófagos MTB deben ser lo suficientemente grandes como para proceder a las pruebas de eficacia del medicamento, como se describe más adelante en el video. Para las pruebas de drogas, prepare dos medicamentos antituberculosos por triplicado en una nueva placa de 96 pocillos de la siguiente manera. Primero, agregue 125 microlitros de medio 7H9C a los pocillos B dos a G 10.

A continuación, prepare los dos medicamentos al doble de la concentración final más alta deseada en un mililitro de 7H9C. Con una pipeta, agregue 250 microlitros de cada medicamento a los pocillos B, C y D 11 y luego E, F y G 11 respectivamente para tratamientos por triplicado. A continuación, utilizando una pipeta multicanal, diluya en serie los fármacos de prueba dos veces moviendo 125 microlitros de B 11 a G 11 a B 10 a G 10.

Mezcle pipeteando cinco veces en cada paso. Continúe moviendo 125 microlitros de columna a columna de derecha a izquierda a través del plato y deténgase después de la columna cuatro. Después de mezclar la columna cuatro, deseche 125 microlitros en un contenedor de desechos.

Las columnas dos y tres no deben contener ningún medicamento. Esto permitirá que se utilicen como fondo y para controles positivos del crecimiento. A continuación, recupere la placa de 96 pocillos que contiene los macrófagos infectados con MTB de la incubadora.

Sin inclinar la placa, utilice una pipeta multicanal para extraer 150 microlitros de medio de los pocillos B dos a G 11. A continuación, incline la placa como se muestra aquí, e inserte las puntas de pipeta en el borde inferior de los pocillos y retire el medio restante, unos 50 microlitros. Como los agregados de macrófagos MTB se adhieren al fondo del pozo, no se debe perder material.

Sin embargo, la extracción del medio debe ser lo más suave posible y se debe tener cuidado para evitar la resuspensión durante este proceso. Agregue suavemente 100 microlitros de medio 7H9C a los pocillos B dos a G 11 de la placa, que contienen los agregados de macrófagos MTB. Utilizando una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros del fármaco que contiene una placa de 96 pocillos a los pocillos correspondientes de la placa de infección.

Luego coloque la placa en una bolsa sellada e incube durante tres días a 37 grados centígrados. El ensayo de resazurina se basa en las especies oxidativas producidas por MTB metabólicamente activa para convertir la resazurina azul en resorufina rosa fluorescente. El cambio de color y fluorescencia se puede utilizar como marcador sustituto para determinar la cantidad de crecimiento bacteriano.

Prepare una solución madre de resazurina a una concentración final de 8 miligramos por mililitro en agua. Filtre a través de una membrana de PVDF de 22 micrómetros de tamaño de poro para la esterilización. Prepare una solución de trabajo en resazurina mezclando la solución madre, el agua y Tween-80 en una proporción de dos a uno a uno.

Las concentraciones finales son 4 miligramos por mililitro de resazurina y 5%Tween-80. Usando un lector de placas, configure un programa para leer la fluorescencia a 530 nanómetros de excitación y 590 nanómetros de emisión durante 24 horas cada 30 minutos a 37 grados Celsius. Precaliente el lector de placas a 37 grados centígrados.

Con una pipeta multicanal, agregue 20 microlitros de solución de trabajo de resazurina a los pocillos B dos a G 11 de la placa tratada con el fármaco. Coloque la placa en el lector e inicie el programa. Para confirmar la robustez de la adaptación de este modelo de infección al formato de placa de 96 pocillos, se evaluó la susceptibilidad de la rifampicina RIF de MTB en moxifloxacina moxy, como se describe en este video.

Como se muestra aquí, las estructuras agregadas de macrófagos MTB se generaron con éxito en un formato de placa de 96 pocillos, lo que permitió la compatibilidad de entrada. Para medir cuantitativamente la conversión de resazurina como indicador del crecimiento bacteriano, se monitoreó cinéticamente la fluorescencia de pocillos individuales durante 24 horas. La presencia de células MTB viables está determinada por la conversión del colorante azul de resazurina a su forma rosada reducida, que se refleja cuantitativamente por las redes z de fluorescencia relativa en el punto de tiempo de saturación.

Estos minigráficos representativos muestran las unidades de fluorescencia resultantes que se muestran en el eje Y frente al tiempo que se muestra en el eje X. Para generar curvas de susceptibilidad a los medicamentos, los pozos tratados con rifampicina y moxifloxacina se normalizaron a un crecimiento máximo de MTB sin control de drogas como 100% de supervivencia. Las señales en blanco de control de fondo se restaron de cada pocillo de muestra.

El porcentaje de supervivencia se graficó para cada concentración individual de tratamiento farmacológico para generar una curva de muerte. Estos datos muestran que la concentración inhibitoria mínima define que la concentración más baja del antibiótico a la que se observa una inhibición del crecimiento del 90% es superior a dos microgramos por mililitro, tanto para la rifampicina como para la moxifloxacina frente a la MTB derivada de nuestro modelo de infección. Como tal, la concentración inhibitoria mínima de estos dos fármacos contra el MTB utilizando nuestro modelo de infección y ensayo refleja mejor la actividad de estos fármacos in vivo.

Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo generar de forma fiable y reproducible estructuras agregadas de macrófagos infectados con MTB para las pruebas de susceptibilidad a los fármacos mediante el ensayo de resazurina. Siguiendo este procedimiento, la modificación de la plantilla de fármacos de dos fármacos como se muestra en un panel de biblioteca de 58 fármacos se realiza fácilmente para permitir el cribado de fármacos de alto rendimiento.