Name: La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende a generar y cuantificar subtipos de cardiomiocitos inducidos mediante reprogramación directa de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción GHMT. Este protocolo permite estudiar especificación de linajes cardiacos in vitro.

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A.F.-P. fue apoyada por la Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Subvención No.2015165336. N.V.M contó con el apoyo de subvenciones de los NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838) y March of Dimes (#5-FY14-203). Agradecemos a Young-Jae Nam, Christina Lubczyk y Minoti Bhakta por sus importantes contribuciones al desarrollo de protocolos y análisis de datos. También agradecemos a John Shelton por su valiosa aportación técnica y a los miembros del laboratorio de Munshi por su debate científico.

Todos los procedimientos experimentales con las prácticas con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de UT Southwestern Medical Center. 1. Aislamiento de HCN4-GFP E12.5 de embriones de ratón de fibroblastos (MEF) <ol><li> Establecieron apareamientos cronometrados entre homocigotos machos HCN4-GFP y hembras CD-1. </li><li> Sacrificar mujer embarazada en E12.5 mediante eutanasia, dióxido de carbono y dislocación cervical posterior. <ol><li> Retire cuernos uterinos con pinza de disección como se ha descrito previamente 22, 23, y colocarlos en una placa de Petri en el hielo con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) sin Ca2 + o Mg2 +. </li></ol></li><li> Realizar todos los pasos subsiguientes en la campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril. <ol><li> Retire los embriones del útero y el saco amniótico con unas tijeras y pinzas de disección. Mantenga la placenta unida para un mejor manejo. pregnant CD-1 hembras suelen dar a luz a entre 10 y 14 crías. </li><li> El uso de pinzas de disección, tome los embriones aislados y rápidamente enjuagarlos dos veces en 70% (v / v) EtOH. NOTA: Los lavados deben ser rápido para minimizar la muerte celular. </li><li> Retire la cabeza, las extremidades, cola, y los órganos internos, incluyendo el corazón de los embriones aislados. </li><li> Coloque el tejido restante en un plato de 10 cm con 1 ml de PBS 1x y carne picada finamente utilizando una cuchilla de afeitar estéril a aproximadamente 1 mm 3 en tamaño. </li><li> Transferencia de tejido picado en un tubo cónico de 50 ml con PBS. </li><li> Girar a 300 xg durante 3 min. aspirar cuidadosamente el exceso de PBS. </li><li> Añadir 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA estéril por embrión. Se incuban las células en un baño de agua a 37 ° durante 15 min. Mezclar suavemente el tubo cada 4 minutos. El exceso de la digestión del tejido reducirá significativamente el rendimiento. </li><li> mezcla de células vórtice a la máxima velocidad (3.200 rpm) durante 4 s. </li><li> Añadir 2 ml de medio de fibroblastos por embrión y mezclar. filtro tediante un filtro de células de 100 micras usando una pipeta para ayudar a las células a través del filtro. Consulte la Tabla 1 para la formulación de todos los medios posteriores. </li><li> Girar a 300 xg durante 4 minutos. Con cuidado, aspirar el sobrenadante. </li><li> Añadir 10 ml de medio de fibroblastos fresca por 3 embriones y triturar 6-10 veces. </li><li> Placa de las células en 1 15-cm placa de cultivo de tejido por cada 3 embriones preparados. Noche a la mañana la cultura en un 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Después de la incubación durante la noche, vuelva a colocar los medios de comunicación con frescos 30 ml de medio por placa. Coloque las células de nuevo en la incubadora durante la noche. NOTA: Compruebe si hay HCN4-GFP + contaminación de células bajo un microscopio de fluorescencia. La cultura debe ser GFP - y sólo convertirse GFP + sobre la reprogramación. </li><li> El día siguiente, las células de la cosecha con 3 ml de fresco precalentado 0,25% de tripsina-EDTA. Contar y congelar las células. Por lo general, congelar las células a 3 x 10 6 células por ml. El Yie esperadaLD debe ser de 3 x 10 6 células por embrión. </li></ol></li></ol> 2. Producción y reprogramación Retrovirus Precaución: La siguiente protocolo requiere la producción y el manejo de los retrovirus infecciosos. Realice los siguientes pasos en un gabinete de seguridad biológica de nivel 2 bajo BSL-2 directrices y una técnica estéril. Utilice lejía al 10% de disponer de todos los materiales expuestos a los retrovirus. <ol><li> La producción y preparación de retrovirus MEFs NOTA: El siguiente protocolo es para la producción retroviral en placas de 6 pocillos y la infección por el MEF en placas de 24 pocillos. Para otros formatos, consulte la Tabla 2. MEFs se siembran en el Día -1, por lo que tendrá que ser coordinado adecuadamente para cada experimento (ver la sección 2.3 y en la Figura 2) el calendario. <ol><li> Mantener las células según las recomendaciones del fabricante Plat-E (PE). Brevemente, las células de cultivo de PE en DMEM suplementado con 10% FBS, 1 mg / ml puromycin, 10 mg / ml de blasticidina, penicilina, y estreptomicina. células de paso 1: 4 cada dos días cuando el cultivo alcanza el 70-90% de confluencia. </li><li> Día -2: El día antes de la transfección, las células semilla Plat-E en células de 1 x 10 6 / pocillo en una placa de 6 pocillos en medio de transfección. Las células deben ser 70 a 80% de confluencia en el momento de la transfección. </li></ol></li><li> La transfección usando un agente de transfección comercial. NOTA: Los reactivos comerciales deben estar a temperatura ambiente (TA) antes de la transfección. Para la transfección de ADN, añadir cada plásmido retroviral DNA individualmente (G, H, M y T) para formar un cóctel GHMT 9. <ol><li> Día -1: En un tubo de poliestireno de 15 ml cónico, mezclar 60 l de medio de suero reducido con 6 l de reactivo de transfección por reacción de un formato de placa de 6 pocillos. Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente. NOTA: Puesto que el reactivo de transfección utilizada aquí se une a los plásticos, unadd directamente a los medios de comunicación de suero reducido para evitar cualquier disminución en la eficiencia de la transfección. </li><li> Añadir un total de 2 g de GHMT cóctel por la reacción y golpear suavemente para que se mezcle. No hacer vórtice. Incubar la reacción durante 15 min a TA. </li><li> Añadir la mezcla de la etapa 2.2.3 a las células de PE en una manera prudente gota. </li><li> Se incuban las células transfectadas Plat-E durante la noche en un 37 ° C, 5% de CO2. Registre el momento de la transfección. </li></ol></li><li> La siembra de fibroblastos de embriones de ratón HCN4-GFP. <ol><li> 1 h antes del chapado MEFs, preparar una placa de 24 pocillos para inmunocitoquímica. <ol><li> Añadir un cubreobjetos de 12 mm fibronectina por pocillo. </li><li> Recubrir los pocillos con 300 l de solución de colágeno bovino (por ejemplo, surecoat) y se incuban en una incubadora a 37ºC durante 1 h. </li><li> Aspirar solución de revestimiento inmediatamente antes de chapado MEF. </li></ol></li><li> Descongelar un vial congelado de HCN4-GFP MEFs y lavar con x1 fibrobl pre-calentadomedios ast a 500 xg durante 5 min. </li><li> Determinar la viabilidad celular mediante exclusión con azul de tripano o tintes similares. Calcular el número de células viables por ml de cultivo utilizando la siguiente fórmula: % de células viables = [1.00 - (Número de células azules / Número de células totales)] x 100 <ol><li> Calcular el número total de células viables utilizando la siguiente fórmula: Las células viables =% de células viables x factor de dilución x 10.000 x volumen total de la suspensión celular </li></ol></li><li> Semilla 3 x 10 4 células por pocillo en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos previamente preparada solución de fibronectina colágeno bovino. </li></ol></li><li> Transducción y reprogramación de MEFs NOTA: De acuerdo con las indicaciones del fabricante, debidamente mantenido células Plat-E producen un título promedio de 1 x 10 7 unidades de infección / ml. Aunque el título no se mide directamente para cada experimento, un control GFP siempre se incluye como un sustituto para la eficiencia de la infección.La expresión de alto GFP y la intensidad (GFP +&gt; 95%) típicamente correlacionado con éxito la generación de GHMT mediada de iCLMs. <ol><li> Día 0: 24 h después de la transfección, se filtra el medio retroviral PE a través de un tamaño de filtro de acetato de 0,45 micras de poro exento de tensioactivos de celulosa y transferir a un tubo cónico de 15 mL. Añadir polibreno a una concentración final de 8 mg / ml. reponer cuidadosamente las células con 2 ml de medio de transfección fresco. NOTA: Las células se desprenden fácilmente de la placa si se cambia el material con demasiada rapidez. </li><li> Aspirar el medio de los MEFs cultivadas y añadir el medio retroviral recién recogida; debe producir 1,7 ml de medio por pocillo de una placa de 6 pocillos. Añadir ~ 800 l por pocillo de una placa de 24 pocillos. Volver placa MEF a la incubadora y se incuba durante la noche. </li><li> Día 1: Repita los pasos 2.4.1 y 2.4.2. Desechar las células después de la colección de virus 2º. Volver MEFs infectadas a la incubadora y dejar reposar durante la noche. </li><li> Día 2: 48 h después de la inducción, aspirar el celular acondicionado medios de comunicación y de lavado x1 con 1x PBS. Añadir medios ICLM 500 l pre-calentado por pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Sustitución de los medios ICLM cada 2 - 3 días. Plataforma en 14 días después de la inducción viral para inmunocitoquímica análisis (CPI) de la reprogramación cardiaca. </li></ol></li></ol> 3. La inmunotinción de MEFs reprogramadas <ol><li> 14 días después de la inducción, aspirar con cuidado los medios de comunicación. </li><li> Enjuague cada pocillo con 300 l de helado de PBS 1x. Aspirar el exceso de solución. </li><li> Fijar las células con 250 l de paraformaldehído al 4% de solución (PFA) por pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar 15 min a RT. NOTA: Se ha corregido células se pueden almacenar en PBS a 4 ° C durante 1 - 2 semanas antes de la tinción. </li><li> permeabilizar las células por lavado de pozos x3 con 300 L de 0,1% Triton X-100 PBS (PBST). Incubar 5 minutos a temperatura ambiente después de cada lavado. Aspirar el exceso de solución después del último lavado. </li><li> Bloque de 10min a TA con 1x universal almacenador intermediario del bloque a 300 l / pocillo. </li><li> Preparar (CPI) tampón de tinción: Añadir 1: 1 de PBS 1x y 1x tampón de bloqueo universal. Diluir anticuerpos primarios en tampón de tinción ICC e incubar anticuerpos noche a 4 ° C. Consulte la sección de material para las diluciones recomendadas. <ol><li> Manchar un par de diapositivas con α-actinina ratón, αGFP pollo y conejo NPPA para el MIP y la identificación de IAM. </li><li> Manchar un par de diapositivas con el ratón α-actinina, αGFP pollo, conejo y MYL2 para la identificación de MIP y MIV. </li></ol></li><li> Al día siguiente, se lavan los pocillos con 300 l x3 0,1% PBST. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente después de cada lavado. Aspirar el exceso de solución después del último lavado. </li><li> Preparar las diluciones de anticuerpos secundarios en tampón de tinción de la CPI. Consulte la sección de material para las diluciones recomendadas. Incubar anticuerpos secundarios 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz. <ol><li> Manchar todas las diapositivas con la siguiente antibodie secundarias: ratón Alexa-555, pollo Alexa-488, y el conejo Alexa-647. </li></ol></li><li> Lavar los pocillos con 300 l x3 0,1% PBST. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente después de cada lavado. Proteger de la luz. </li><li> Añadir 2,4 l de medio de montaje que contienen 1,5 mg / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Retirar con cuidado el cubreobjetos del pozo de la placa de 24 pocillos, eliminar el exceso de solución y transferir al portaobjetos de vidrio con medio de montaje. Presione suavemente el cubreobjetos para eliminar el exceso de volumen y el aire. </li><li> sellar los portas con esmalte de uñas preferido o sellador plástico. Tienda diapositivas montadas a 4 ° C protegido de la luz. </li></ol> 4. Identificación de los subtipos cardíacos Utilizando microscopía confocal NOTA: Para imágenes, un microscopio confocal equipado con al menos 2 detectores fluorescentes capaces de detección espectral a 405, 488, 555, y 639 nm longitud de onda es necesaria con el fin de identificar IPMS, Iams, y IVMS. imagLas células E usando un Plan-Apocromático 20X / 0.75 o mejor objetivo. El uso de software de análisis de imágenes del fabricante, la digitalización de imágenes de zoom puede lograr imágenes de calidad inmersión 40X-petróleo. <ol><li> Biblioteca de imágenes: tomar imágenes de 8 bits con DAPI, Alexa-488, Alexa-555, y Alexa-647 canales (CH.). Pixel tiempo de permanencia de 6 s, 1024 tamaño de la trama, paso de línea a los 2, y un promedio de 2 es suficiente para imágenes de alta resolución. </li><li> Para cada diapositiva, empezar desde un borde y comenzar a escanear hacia arriba y abajo en el canal rojo fluorescente (cap.) Para las células sarcómero + α-actinina + (Consulte la Figura 3 y la Figura 5A para ejemplos). estrías sarcómero son más fáciles de identificar visualmente en la longitud de onda de 555 nm. <ol><li> Una vez que se ha identificado un α-actinina + + células Sarcómero, cambiar a la ch verde. y mantener la nota si es positivo (MIP). Cambie a la computadora para evaluar el rojo lejano 647 ch. (IAM o IVM). NOTA: Las celdas que estánα-actinina + / + Sarcómero / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 - se designan como IPMS. Expresión de GFP se verá en toda la célula (Figura 4A). </li><li> diapositivas mancha con α-actinina (ratón-Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), NPPA (conejo-Alexa647), y DAPI. Las células que son α-actinina + / + Sarcómero / Hnc4-GFP - / + NPPA son IAM. NPPA tinción perinuclear y aparecerá punteada (Figura 4B). </li><li> diapositivas mancha con α-actinina (ratón-Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), MYL2 (conejo-Alexa647). Las células positivas para α-actinina + / + Sarcómero / Hnc4-GFP - / + MYL2 son IVMS. MYL2 tinción exhibirá una forma estriada a lo largo del filamento de sarcómero. Debido a variaciones en la calidad de la tinción y el plano z, estrías pueden no ser siempre fácilmente visible (Figura 4C). </li></ol></li></ol> NOTA: A fin de evaluar el número real de MEFs potencialmente reprogramadas, 2 pocillos de una placa de 24 pocillos se siembran en paralelo a los pocillos experimentales y se cosechan un día después de la siembra. El número total de células cultivadas en placas se determina entonces el promedio de los dos pozos. Esto se convierte en las células totales reales plateados (Atotal). <ol><li> sarcómero + <ol><li> Inspeccione visualmente cada célula en un cubreobjetos para el buen α-actinina + / + Sarcómero (paneles de la derecha figura 3) y registro (Figura 5B-i). </li><li> Tabular el número total de α-actinina + / + Sarcómero en cada cubreobjetos y se divide por el total de células chapados reales (Atotal) (Figura 5 B-III). Por ejemplo, si atotal = 12.500 células, y 100 células se alfa-actinina + / + Sarcómero entonces, 0,8% de los MEFs en placas fueron reprogramado. Un promedioexperimento reprogramación rendirá 1% alfa-actinina + / + células sarcómero (Figura 5C). </li></ol></li><li> subtipo + NOTA: Para los siguientes pasos, consulte la Figura 5B / C para un flujo de trabajo ICLM cuantificación representativa. Brevemente, para cada sarcómero + de células, tabular si es única, ya sea para el subtipo (Figura 5B-i). Calcular el% de Subtipo (Figura 5B-iii) dividiendo el número de células de subtipo + sobre el sarcómero media + células x 100 (Figura 5B-i). Para el cálculo de la eficiencia absoluta del subtipo% (Figura 5B-IV), se divide el número de células de subtipo + Figura 5B-i por el número total de células sembradas x 100 (Figura 5 B-II). <ol><li> Para cada uno de los α-actinina células + / + Sarcómero, evaluar si son GFP +, + NPPA, o MYL2 <sarriba&gt; +. </li><li> Tabular número total de α-actinina + / Sarcómero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 -, actinina + / Sarcómero + / Hnc4-GFP - / NPPA +, y α-actinina + / Sarcómero + / Hnc4-GFP - / células MYL2 + (Figura 5B-I). </li><li> Para calcular el porcentaje de cada subtipo, se divide el número de células de subtipos + por el número total de α-actinina + / + células sarcómero en que así y se multiplica por 100. GHMT genera IPMS, Iams, y IVMS proporciones aproximadamente iguales a (figura 5B-iii). </li><li> Para calcular el número absoluto de subtipo + células, se divide el número total de células subtipo + para la condición experimental por Atotal y se multiplica por 100 (Figura 5 B-II). En iPMS promedio representan el 0,3% de la población total de células infectadas, Iams 0,3%, yIVMS 0,25% (Figura 5B-iv). </li></ol></li></ol>

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<li>Ichim, C. V., Wells, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+viral+preparations+by+concentration+using+successive+rounds+of+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation.</a> J Transl Med. 9, 137(2011).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente estudio proporciona una estrategia de reprogramación directa para la conversión de los MEF en un conjunto diverso de subtipos cardíacas a través de la expresión mediada por retrovirus de la transcripción cardiaca Factores Gata4, MEF2C, Tbx5, y Hand2 (GHMT). Utilizando un enfoque de inmunotinción múltiplex en combinación con un ratón reportero PM-específica, somos capaces de identificar IAM, IVMS, y iPMS a una resolución de una sola célula. Dicho ensayo permite una experimental sistema in vitro capaz...

El corazón es el primer órgano funcional para el desarrollo en el embrión de 1, 2. En combinación con el sistema circulatorio, que suministra oxígeno, nutrientes, y un mecanismo de eliminación de residuos durante el desarrollo. Tres semanas después de la fecundación, el corazón humano late por primera vez y su regulación adecuada es mantenida por los cardiomiocitos (CMS). Por lo tanto, la pérdida irreversible de estas células especializadas es la cuestión fundamental que subyace en la insuficiencia cardíaca progresiva. Si bien algunos organismos, tales como el pez cebra y Xenopus tienen el potencial para la regeneración cardiaca, el corazón de los mamíferos adultos es más limitada 3, 5, 6. Por lo tanto, dada la función crítica del corazón, no es sorprendente que la enfermedad cardíaca es la causa principal de muerte en el mundo, con 600.000 muertes sólo en 7 de los Estados Unidos. losrefore, las terapias basadas en células para reparar o reemplazar el miocardio lesionado de manera eficiente son de gran interés clínico. El estudio seminal de Yamanaka y colegas 8 mostró que la expresión forzada de cuatro factores de transcripción es suficiente para convertir células de fibroblastos completamente diferenciadas a células madre pluripotentes. Sin embargo, la capacidad tumorigénico de todas las estrategias de células madre pluripotentes ha sido una preocupación fundamental en su uso para fines terapéuticos. Esto motivó el campo científico para buscar métodos alternativos para transdifferentiate células evitando al mismo tiempo una etapa pluripotente. Recientemente, varios grupos han demostrado la viabilidad de esta estrategia mediante la visualización de conversión directa de fibroblastos de ratón a células cardiomiocitos como inducidas (iCLMs) con la expresión ectópica de los factores de transcripción Gata4, MEF2C, Tbx5, y más tarde, Hand2 (GMT y GHMT , respectivamente) 9, 10. Furthermore, la misma estrategia se puede realizar in vivo y en los tejidos humanos derivados de 9, 11, 12. Estudios recientes han puesto de relieve factores adicionales o vías de señalización que pueden ser modulados para mejorar aún más la eficiencia de reprogramación cardíaca 13, 14, 15. Tomados en conjunto, estos estudios demuestran el potencial de transdiferenciación dirigida para las terapias regenerativas. Sin embargo, la baja eficiencia de reprogramación CM, los mecanismos moleculares desconocidos, reproducibilidad inconsistentes debido a las diferencias metodológicas 16, y la naturaleza heterogénea de iCLMs siguen sin resolverse. Con el fin de evaluar directamente ICLM heterogeneidad, se diseñó un ensayo de una sola célula discreta y robusto para la identificación del desarrollo sarcómero y specificatio linaje cardiacon-dos características necesarias de los cardiomiocitos funcionales. Hay al menos tres tipos principales de CM en el corazón tal como se define por su ubicación y propiedades eléctricas únicas: auricular (AM), ventricular (VM) y el marcapasos (PM) 17, 18, 19, 20. En una combinación orquestada, que permiten el bombeo de la sangre adecuado. Durante la lesión del corazón, uno o todos los subtipos podrían verse afectados, y tendrían que ser abordado sobre una base caso por caso, el tipo de terapia celular. En la actualidad, la mayoría de las estrategias se centran en la generación global de los cardiomiocitos, mientras que poco trabajo se está haciendo para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la especificación subtipo. El siguiente estudio detalla cómo cuantificar adecuadamente sarcómeros bien organizados e identificar un conjunto diverso de subtipos de cardiomiocitos. El uso de un marcapasos (MP) de ratón específico de reportero, somos capaces de aplicar un immunocytochemical enfoque para distinguir los miocitos auriculares inducidas similar (IAM), miocitos ventriculares-como inducidas (IVM), y miocitos inducida PM-como (IPMS) 21. Sobre la base de nuestras observaciones, solamente las células que exhiben organización del sarcómero son capaces de latidos espontáneos. Esta plataforma permite la reprogramación única para evaluar el papel de ciertos parámetros en la organización del sarcómero, la especificación de subtipo, y la eficiencia de reprogramación CM en la resolución de una sola célula.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Componente de medios iCLM, medios Plat-E, fibroblastos y medios de transfección</td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11150059</td><td>Componente de medios iCLM</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>Componente de medios iCLM, medios Plat-E, fibroblastos y medios de transfección Insulina-Transferrina-Selenio</td></tr><tr><td>G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td>Componente de los medios iCLM</td></tr><tr><td>Solución vitamínica MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>Componente de los medios iCLM</td></tr><tr><td>Aminoácidos MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>Componente de los medios iCLM</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>Componente de los medios iCLM</td></tr><tr><td>Antibióticos-antimicóticos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Componente del suplemento iCLM media</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Componente del medio iCLM</td></tr><tr><td>Suero de caballo inactivado por calor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td>Componente del medio iCLM</td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>Componente del medio iCLM</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>1514022 Componente de los medios Plat-E y los medios fibroblastos</td></tr><tr><td>Puromycin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11139-03</td><td>Componente del medio Plat-E</td></tr><tr><td>Blasticidina&nbsp; &nbsp;</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>Componente de los medios Plat-E</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Componente de los medios de fibroblastos</td></tr><tr><td>Escaneo láser confocal LSM700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Para el análisis confocal</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección FuGENE 6</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Reactivo de transfección&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM Medio de suero reducido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Reactivo de transfección&nbsp;</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Reactivo de inducción. Úselo a una concentración final de 8 &mu; M/mL</td></tr><tr><td>Platinium-E (PE) Línea celular de paquetes retrovirales,</td><td>célula ecotrópicaBiolabs</td><td>RV-101</td><td>Línea celular de pacaking retroviral</td></tr><tr><td>Tripsina 0.25% EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>para MEFs y disociación de Plat-E</td></tr><tr><td>Anti &alfa;-Actinina de ratón (Clon EA-53)</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Anticuerpo para análisis confocal. Úselo en 1:200</td></tr><tr>Anticuerpo Thermo <td>Fisher Scientific</td><td>A10262</td> anticuerpo<td>anti-GFP IgY</td><td>para análisis confocal. Úselo a 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti-NPPA&nbsp;</td><td>Anticuerpo Abgent</td><td>AP8534A</td><td>para análisis confocal. Usar a 1:400</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti Myl2 IgG&nbsp;</td><td>Anticuerpo ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>para análisis confocal. Uso en solución Vectashield 1:200</td></tr><tr><td>con DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>Colorante para análisis confocal</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1.0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat Fibronectina 12 mm cubreobjetos</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>cubreobjetos para análisis confocal</td></tr><tr><td>100 &mu; m filtro de celdas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m Filtros de jeringas SFCA 25MM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-740-106</td><td>Para la filtración de virus</td></tr><tr><td>Jeringas de 6 mL</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>Para la filtración</td></tr><tr><td>de virus Cabra anti-Pollo IgY (H& L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>Anticuerpo secundario para análisis confocal. Usar a 1:400</td></tr><tr><td>Burro anti-conejo A647 IgG(H+L)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>Anticuerpo secundario para análisis confocal. Úselo a 1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG(H+L) anti-ratón de cabra A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>para análisis confocal. Úselo a 1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml</td><td>Para la permeabilización celular&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco sin CaCl2 y MgCl2 (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Power Block 10x Reactivo de bloqueo universal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>Diluido a 1x en H2O</td></tr><tr><td>16% Solución acuosa de paraformaldehído (PFA)</td>Ciencias de la <td>electromicroscopía&nbsp;</td><td>15710</td><td>Usar al 4% diluido en dH2O</td></tr><tr><td>placas de 6 cm&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placas de cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 cm&nbsp; Placas de cultivo de tejidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos cónicos</td><td>Corning</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos cónicos</td><td>Corning</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Solución de azul de tripano</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Para la viabilidad</td></tr><tr><td>Alcohol etílico 200 grados</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>Lejía</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

la evaluación de cardiomiocitos subtipos a raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

La reprogramación directa de un tipo de célula en otro ha surgido recientemente como un poderoso paradigma para la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades y la especificación de linajes. En particular, la conversión de fibroblastos en miocitos similares a cardiomiocitos inducidos (iCLM) por Gata4, Hand2, Mef2c y Tbx5 (GHMT) representa una vía importante para generar miocitos cardíacos de novo in vitro e in vivo. La evidencia reciente sugiere que la GHMT genera una mayor diversidad de subtipos cardíacos de lo que se apreciaba anteriormente, lo que subraya la necesidad de un enfoque sistemático para realizar estudios adicionales. Sin embargo, antes de que la reprogramación directa pueda utilizarse como estrategia terapéutica, es necesario comprender en detalle los fundamentos mecanicistas de la conversión de linaje para generar subtipos cardíacos específicos. Aquí presentamos un protocolo detallado para la generación de iCLMs por reprogramación mediada por GHMT de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). 
Describimos métodos para el aislamiento de MEF, la producción retroviral y la infección por MEF para lograr una reprogramación eficiente. Para determinar la identidad del subtipo de las células reprogramadas, detallamos un enfoque paso a paso para realizar inmunocitoquímica en iCLMs utilizando un conjunto definido de anticuerpos compatibles. También se presentan métodos para la microscopía confocal, la identificación y la cuantificación de iCLM y subtipos individuales de auriculares (iAM), ventriculares (iVM) y marcapasos (iPM). Finalmente, discutimos los resultados representativos de los experimentos prototípicos de reprogramación directa y destacamos aspectos técnicos importantes de nuestro protocolo para garantizar una conversión de linaje eficiente. En conjunto, nuestro protocolo optimizado debería proporcionar un enfoque gradual para que los investigadores realicen experimentos significativos de reprogramación cardíaca que requieran la identificación de subtipos individuales de MC.

Aprovechando el ratón reportero PM-específica, hemos desarrollado una estrategia inmunotinción múltiplex para identificar diversas miocitos endógenos como se muestra en la Figura 1. Siguiendo los pasos de reprogramación que se muestran en la Figura 2, la inducción de los CM subtipo específico puede detectarse ya en el día 4 21, aunque a una velocidad baja. Para el día 14, el experimento se puede detener y evaluado para la organiza...

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la generación y cuantificación de diversos subtipos cardíacos reprogramados utilizando una administración mediada por retrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c y Tbx5.

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

El objetivo general de este procedimiento es generar y cuantificar un conjunto diverso de subtipos de cardiomiocitos inducidos. Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales clave sobre la conversión de linaje específica de subtipos durante la reprogramación cardíaca, como las señales necesarias que regulan el ensamblaje del sarcómero y la especificación de subtipos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona el método para cuantificar los efectos sobre la especificación de subtipos cardíacos, lo cual es necesario para realizar estudios mecanicistas.Para comenzar, aísle fibroblastos embrionarios de ratón de embriones en la etapa E 12.5. Almacénelos en nitrógeno líquido según se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, recolecte células plat-E y siembre una millón de células por pocillo en una placa de seis pocillos, de modo que las células alcancen una confluencia del 70 al 80 % en 24 horas.Cubra las células con medio de transfección e incúbelas bajo condiciones estándar de cultivo. Un día antes del experimento, tome un tubo cónico de poliestireno de 15 mililitros y mezcle 60 microlitros de medio con suero reducido con seis microlitros de reactivo de transfección por reacción. Incube la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente.Dado que el reactivo de transfección que utiliza se agrega directamente al medio con suero reducido para evitar cualquier disminución en la eficiencia de transfección. A continuación, agregue un total de dos microgramos de la mezcla GHMT por reacción, y golpee suavemente el tubo para mezclarlo. Incube la reacción durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego agregue la mezcla a las células plat-E de manera gota a gota.Registre la fecha y la hora de la transfección. Incube las células plat-E transfectadas durante la noche. Una hora antes de sembrar el fibroblasto embrionario de ratón, prepare una placa de 24 pocillos para inmuno-citoquímica agregando primero cubreobjetos recubiertos con fibronectina de 12 milímetros a cada pocillo.A continuación, agregue 300 microlitros de solución de colágeno bovino a cada pocillo e incube la placa durante una hora. Cerca del final de la incubación, descongele un vial congelado de fibroblastos embrionarios de ratón HCN4GFP. Descongele rápidamente las células, lávelas una vez con medio para fibroblastos precalentado y cuente la concentración de células viables.Luego aspire la solución de recubrimiento en la placa de 24 pocillos e inmediatamente siembre 30.000 células por pocillo sobre los cubreobjetos recubiertos con colágeno y fibronectina. Veinticuatro horas después de la transfección, filtre el medio retroviral a través de un filtro de acetato de celulosa libre de surfactantes con un tamaño de poro de 0,45 micrones y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue polibreno hasta alcanzar una concentración final de ocho microgramos por mililitro.Reponga cuidadosamente las células plat-E con dos mililitros de medio de transfección fresco. Cambiar el medio demasiado rápidamente puede hacer que las células se desprendan. Las células plat-E mantenidas adecuadamente producen un promedio de diez millones de unidades infecciosas por mililitro.Una alta expresión e intensidad de GFP en más del 95 % de las células generalmente se correlaciona con una generación exitosa de miocitos similares a cardiomiocitos inducidos mediante GHNT. A continuación, aspire el medio de los fibroblastos embrionarios cultivados y agregue el medio retroviral recién recolectado. Luego, regrese la placa de metionina al incubador e incube durante la noche.Al día siguiente, transfiera nuevamente el medio de las células plat-E a los fibroblastos embrionarios. Descarte las células plat-E después de la segunda recopilación del virus. 48 horas después de la inducción, aspire el medio condicionado y lave las células una vez con PBS.Luego, agregue 500 microlitros de medio precalentado inducido para cardiomiocitos similares a miocitos por pocillo de la placa de 24 pocillos. Reemplace el medio cada dos o tres días durante los próximos 12 días. Catorce días después de la inducción, aspire cuidadosamente el medio y enjuague cada pocillo con 300 microlitros de PBS frío con hielo.Luego, retire el PBS y agregue 250 microlitros de una solución al 4% de paraformaldehído por pocillo e incube las células durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, permeabilice las células lavando los pocillos tres veces durante cinco minutos con 300 microlitros de Triton X-100 al 0,1% en PBS. Aspire el exceso de solución de permeabilización después del último lavado y luego agregue un tampón bloqueador universal a razón de 300 microlitros por pocillo.Bloquee durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tiña un par de portaobjetos durante la noche con los anticuerpos anti-alfa actinina de ratón, anti-GFP de pollo y anti-NPPA de conejo para identificar los miocitos marcapasos inducidos en los miocitos atriales inducidos. Al día siguiente, lave los pocillos y agregue el anticuerpo secundario adecuado según se describe en el protocolo de texto adjunto.Después de lavados adicionales, agregue 2.4 microlitros de medio de montaje a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Tome un cubreobjetos de la placa de 24 pocillos y elimine la solución en exceso. Luego, transfiéralo al portaobjetos con el medio de montaje.Para cada portaobjetos, comience desde un borde y escanee de arriba hacia abajo en el canal de fluorescencia roja para identificar células positivas para alfa-actinina y sarcómeros positivos. Las estrías de los sarcómeros son más fáciles de identificar en la longitud de onda de 555 nanómetros. Una vez identificadas, cambie al canal verde y anote si las células son positivas.Luego, cambie al ordenador para evaluar la longitud de onda de 647 nanómetros en el espectro rojo lejano y buscar la tinción de NPPA o MYL2. Las células que son positivas para alfa-actinina, positivas para sarcómero, negativas para Hnc4-GFP y positivas para Nppa son miocitos inducidos similares a los auriculares. La tinción de Nppa aparecerá paranuclear y puntiforme.Primero, cuente el número de células 24 horas después de la siembra, como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, inspeccione visualmente cada célula en un cubreobjetos para verificar la tinción adecuada de alfa-actinina y sarcómeros, y registre el número de células que presentan tinción positiva para ambos marcadores. Luego, divida entre el número total real de células sembradas.Un experimento promedio de reprogramación producirá aproximadamente un uno por ciento de células que son positivas para alfa-actinina y sarcómero. Al día 14, el experimento puede detenerse y evaluarse la organización del sarcómero. Esto se identifica mediante la tinción positiva de alfa-actinina mostrada aquí en rojo.Solo las células que muestran organización de los sarcomeros son capaces de latir espontáneamente, por lo que esta es una buena verificación inicial. Aquí se muestran cardiomiocitos inducidos similares a marcapasos procedentes de ratones con el reportero Hcn4-GFP. Tres células de esta imagen presentan organización de los sarcomeros.Tres agrupaciones celulares positivas para Hcn4-GFP se encuentran en el centro de la imagen y pueden identificarse como un tipo de célula marcapasos. Se puede observar una célula en la parte inferior izquierda con tinción de alfa-actinina, pero sin organización de sarcomeros ni marcador de subtipo identificable. En esta población de cardiomiocitos inducidos similares a los ventriculares, la célula central exhibe organización de sarcomeros; esta célula también da positivo para el marcador de cadena ligera de miosina MYL-2, que es un marcador de cardiomiocitos ventriculares.Una vez dominado, el plaqueo y la transfección de las células plat-E pueden realizarse en una hora. La inducción de los fibroblastos embrionarios de ratón toma de una a dos horas y la cuantificación de mitosis en una placa completa de 24 pocillos dura aproximadamente ocho horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que fibroblastos embrionarios de ratón sanos y virus de alto título son fundamentales para un experimento de reprogramación exitoso.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar y cuantificar subtipos individuales de cardiomiocitos inducidos.

assessing-cardiomyocyte-subtypes-following-transcription-factor

Research

Investigación

JoVE Journal

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La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón (Video) | JoVE Journal

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

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