La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

El objetivo general de este procedimiento es generar y cuantificar un conjunto diverso de subtipos de cardiomiocitos inducidos. Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales clave sobre la conversión de linaje específica de subtipos durante la reprogramación cardíaca, como las señales necesarias que regulan el ensamblaje del sarcómero y la especificación de subtipos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona el método para cuantificar los efectos sobre la especificación de subtipos cardíacos, lo cual es necesario para realizar estudios mecanicistas.

Para comenzar, aísle fibroblastos embrionarios de ratón de embriones en la etapa E 12.5. Almacénelos en nitrógeno líquido según se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, recolecte células plat-E y siembre una millón de células por pocillo en una placa de seis pocillos, de modo que las células alcancen una confluencia del 70 al 80 % en 24 horas.

Cubra las células con medio de transfección e incúbelas bajo condiciones estándar de cultivo. Un día antes del experimento, tome un tubo cónico de poliestireno de 15 mililitros y mezcle 60 microlitros de medio con suero reducido con seis microlitros de reactivo de transfección por reacción. Incube la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Dado que el reactivo de transfección que utiliza se agrega directamente al medio con suero reducido para evitar cualquier disminución en la eficiencia de transfección. A continuación, agregue un total de dos microgramos de la mezcla GHMT por reacción, y golpee suavemente el tubo para mezclarlo. Incube la reacción durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego agregue la mezcla a las células plat-E de manera gota a gota.

Registre la fecha y la hora de la transfección. Incube las células plat-E transfectadas durante la noche. Una hora antes de sembrar el fibroblasto embrionario de ratón, prepare una placa de 24 pocillos para inmuno-citoquímica agregando primero cubreobjetos recubiertos con fibronectina de 12 milímetros a cada pocillo.

A continuación, agregue 300 microlitros de solución de colágeno bovino a cada pocillo e incube la placa durante una hora. Cerca del final de la incubación, descongele un vial congelado de fibroblastos embrionarios de ratón HCN4GFP. Descongele rápidamente las células, lávelas una vez con medio para fibroblastos precalentado y cuente la concentración de células viables.

Luego aspire la solución de recubrimiento en la placa de 24 pocillos e inmediatamente siembre 30.000 células por pocillo sobre los cubreobjetos recubiertos con colágeno y fibronectina. Veinticuatro horas después de la transfección, filtre el medio retroviral a través de un filtro de acetato de celulosa libre de surfactantes con un tamaño de poro de 0,45 micrones y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue polibreno hasta alcanzar una concentración final de ocho microgramos por mililitro.

Reponga cuidadosamente las células plat-E con dos mililitros de medio de transfección fresco. Cambiar el medio demasiado rápidamente puede hacer que las células se desprendan. Las células plat-E mantenidas adecuadamente producen un promedio de diez millones de unidades infecciosas por mililitro.

Una alta expresión e intensidad de GFP en más del 95 % de las células generalmente se correlaciona con una generación exitosa de miocitos similares a cardiomiocitos inducidos mediante GHNT. A continuación, aspire el medio de los fibroblastos embrionarios cultivados y agregue el medio retroviral recién recolectado. Luego, regrese la placa de metionina al incubador e incube durante la noche.

Al día siguiente, transfiera nuevamente el medio de las células plat-E a los fibroblastos embrionarios. Descarte las células plat-E después de la segunda recopilación del virus. 48 horas después de la inducción, aspire el medio condicionado y lave las células una vez con PBS.

Luego, agregue 500 microlitros de medio precalentado inducido para cardiomiocitos similares a miocitos por pocillo de la placa de 24 pocillos. Reemplace el medio cada dos o tres días durante los próximos 12 días. Catorce días después de la inducción, aspire cuidadosamente el medio y enjuague cada pocillo con 300 microlitros de PBS frío con hielo.

Luego, retire el PBS y agregue 250 microlitros de una solución al 4% de paraformaldehído por pocillo e incube las células durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, permeabilice las células lavando los pocillos tres veces durante cinco minutos con 300 microlitros de Triton X-100 al 0,1% en PBS. Aspire el exceso de solución de permeabilización después del último lavado y luego agregue un tampón bloqueador universal a razón de 300 microlitros por pocillo.

Bloquee durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tiña un par de portaobjetos durante la noche con los anticuerpos anti-alfa actinina de ratón, anti-GFP de pollo y anti-NPPA de conejo para identificar los miocitos marcapasos inducidos en los miocitos atriales inducidos. Al día siguiente, lave los pocillos y agregue el anticuerpo secundario adecuado según se describe en el protocolo de texto adjunto.

Después de lavados adicionales, agregue 2.4 microlitros de medio de montaje a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Tome un cubreobjetos de la placa de 24 pocillos y elimine la solución en exceso. Luego, transfiéralo al portaobjetos con el medio de montaje.

Para cada portaobjetos, comience desde un borde y escanee de arriba hacia abajo en el canal de fluorescencia roja para identificar células positivas para alfa-actinina y sarcómeros positivos. Las estrías de los sarcómeros son más fáciles de identificar en la longitud de onda de 555 nanómetros. Una vez identificadas, cambie al canal verde y anote si las células son positivas.

Luego, cambie al ordenador para evaluar la longitud de onda de 647 nanómetros en el espectro rojo lejano y buscar la tinción de NPPA o MYL2. Las células que son positivas para alfa-actinina, positivas para sarcómero, negativas para Hnc4-GFP y positivas para Nppa son miocitos inducidos similares a los auriculares. La tinción de Nppa aparecerá paranuclear y puntiforme.

Primero, cuente el número de células 24 horas después de la siembra, como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, inspeccione visualmente cada célula en un cubreobjetos para verificar la tinción adecuada de alfa-actinina y sarcómeros, y registre el número de células que presentan tinción positiva para ambos marcadores. Luego, divida entre el número total real de células sembradas.

Un experimento promedio de reprogramación producirá aproximadamente un uno por ciento de células que son positivas para alfa-actinina y sarcómero. Al día 14, el experimento puede detenerse y evaluarse la organización del sarcómero. Esto se identifica mediante la tinción positiva de alfa-actinina mostrada aquí en rojo.

Solo las células que muestran organización de los sarcomeros son capaces de latir espontáneamente, por lo que esta es una buena verificación inicial. Aquí se muestran cardiomiocitos inducidos similares a marcapasos procedentes de ratones con el reportero Hcn4-GFP. Tres células de esta imagen presentan organización de los sarcomeros.

Tres agrupaciones celulares positivas para Hcn4-GFP se encuentran en el centro de la imagen y pueden identificarse como un tipo de célula marcapasos. Se puede observar una célula en la parte inferior izquierda con tinción de alfa-actinina, pero sin organización de sarcomeros ni marcador de subtipo identificable. En esta población de cardiomiocitos inducidos similares a los ventriculares, la célula central exhibe organización de sarcomeros; esta célula también da positivo para el marcador de cadena ligera de miosina MYL-2, que es un marcador de cardiomiocitos ventriculares.

Una vez dominado, el plaqueo y la transfección de las células plat-E pueden realizarse en una hora. La inducción de los fibroblastos embrionarios de ratón toma de una a dos horas y la cuantificación de mitosis en una placa completa de 24 pocillos dura aproximadamente ocho horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que fibroblastos embrionarios de ratón sanos y virus de alto título son fundamentales para un experimento de reprogramación exitoso.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar y cuantificar subtipos individuales de cardiomiocitos inducidos.